A.

Pendahuluan
Pengertian kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan
antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada
pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan
fase diam.Tswett adalah penemu kromatografi pada tahun 1903. Perkembangan kromatografi
antara lain:
a. kromatografi cair-padat (KCP).
b. Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh Izmailov.
c. Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada
tahun 1958. Karya Martin dan Synge
yang pada tahun 1041
membuahkan
hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi cair, tetapi juga secara
umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas dan
kromatografi kertas.
d. Pada tahun 1952, Martindan James mempublikasikan makalah pertamanya
mengenaim kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an
kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang canggih.
e. Hal ini menjadi dasar ditemukannya kromatografi yang canggih yaitu
kromatografi cair kinerja tinggi (High Perfomance Liquid Chromatografi).
1. Jenis-jenis kromatografi
Kromatografi dibedakan menjadi 2 jenis yaitu:
a. Kromatografi cair (Liquid Chromatography) merupakan teknik yang tepat
untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan.
Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase
chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size
exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography.
Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat
dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase
stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika.
High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai
prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode
ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.
Size exclusion chromatography atau yang dikenal juga dengan gel
permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk
memisahkan dan memurnikan protein.
Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan untuk
pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.

HPLC

1. Pendahuluan
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun
1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan
obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik, analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industriindustri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT,
penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan
analisisi senyawa-senyawa kiral.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)
merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk analisis
beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi.
KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti
asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar
senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi
dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan
senyawa-senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat
molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti jalannya reaksi sintetis.
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat
kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh
2. a. Prinsip dasar HPLC
Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun
prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom
maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit )
sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang
muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan
menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan
alat HPLC tersebut.
b. Prinsip kerja HPLC
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya
untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang
puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon
< senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol <
golongan asam.

a. Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis
sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat

c.

d.

dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas.
b. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui
kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi
diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari
senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi
yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan
sangat bervariasi dan bergantung pada:
Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada
laju alir dari pelarut).
Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material
apa, tetapi juga pada ukuran partikel).
Komposisi yang tepat dari pelarut.
Temperatur pada kolom
Detector
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati
kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu
penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik
menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa

tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu
Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana
masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang
melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol
kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh

.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang
melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui
layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau
dalam gambar (sangat sederhana).
c. Jenis-jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang
non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain
klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
a. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan
alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
b. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18)
dan
kebanyakan
pemisahannya
adalah
fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
c. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan
pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan
juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak
dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.
d. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel
ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
e. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase
diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul
solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian
molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih

kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi
lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi
ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
f.

Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran
yang sangat kompleks.

3. Instrumentasi
Instrumentasi HPLC terdiri dari fase gerak, pompa, injektor, kolom, detektor dan
pengolah data.

Terdapat 5 komponen dasar HPLC yaitu:

3.1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan
resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase
gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama

di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat

dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang
analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien
digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika
sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering
digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer
dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan
fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarutpelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding
dengan fase terbalik
Fase gerak (eluen) berupa zat cair. Fase gerak selain sebagai pembawa
senyawa campuran menuju detektor, fase gerak juga dapat berinteraksi dengan
solut-solut. Beberapa persyaratan HPLC antara lain :
Harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan dianalisis
Zat cair harus murni dan jernih untuk menghindari kotoran yang dapat mengganggu
interpretasi kromatogram dan menghindarkan penyumbatan kolom
Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
Memiliki viskositas rendah
Sesuai dengan detektor yang digunakan
Pompa dianalogikan sebagai jantung, berfungsi mengalirkan fase gerak cair melalui
kolom.

3.2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan
pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan
tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
3.3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi
dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

3.4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya
proses
pemisahan
solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi
lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil
(nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang
tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.
3.5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
Stabil dalam pengopersiannya.
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut :
Detektor

Sensitifita
s (g/ml)

Kisaran
linier

Karakteristik

5 x 10-10
5 x 10-10
> 2 x 10-10

104
105
105

10-12

104

Indeks bias

5 x 10-7

104

Sensitivitas bagus, paling

sering digunakan, selektif
terhadap gugus-gugus dan
struktur-struktur yang tidak
jenuh.
Sensitifitas sangat bagus,
selektif,
Tidak
peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada elusi
bergradien

Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri

10-8
10-12

104
105

Absorbansi Uvvis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometerphoto
-diode array
Fluoresensi

Peka terhadap perubahan

suhu dan kecepatan alir fase
gerak,
tidak
dapat
digunakan
pada
elusi
bergradien.
Hanya
mendeteksi
solut-solut
ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi timbul
masalah dengan adanya
kontaminasi elektroda.

4. Derivatisasi pada HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen
untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi
pada HPLC adalah untuk:
4.1. Meningkatkan deteksi.
4.2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan
puncak kromatografi yang lebih baik.
4.3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik.
4.4. Menstabilkan analit yang sensitif.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis
sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus
kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu,
juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu
berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni:
produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak
atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar
mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan
deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan
kromatografi.
Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization)
atau setelah analit
Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat
keluar dari kolom
dengan UV-Vis
dideteksi
dengan
(post-column
Fluoresen
derivatization).
Asam-asam
p-nitrobenzil-N,N4-bromometil-7kaboksilat; asamasam
lemak;asam-asam
fosfat
Alkohol

Aldehid; keton

diisopropilisourea (PNBDI);
3,5-dinitrobenzil-N,Ndiisopropilisourea
(DNBDI); p-bromofenasil
bromida (PBPB)
3,5-dinitrobenzil
klorida
(DNBC);
4dimetilaminiazobenzen-4sulfinil
(Dabsyl-Cl);
1naftilisosianat (NIC-1).
p-nitrobenziloksiamin
hidroklorida (PNBA); 3,5dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);

asetoksikumarin;
4-bromometil-7metoksikumarin;

5. Kegun
aan
dari
HPLC

Dansil hidrazin

Amin primer

Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
o
Amin primer (1 ) 3,5-dinitrobenzil
klorida 7-kloro-4-nitrobenzo-2dan sekunder (2o) (DNBC);N-suksinimidil-poksa-1,3-diazol (NBDnitrofenilasetat
(SNPA);N- Cl);
7-fluoro-4suksinimidil-3,5nitrobenzo-2-oksa-1,3dinitrofenilasetat (SDNPA); diazol (NBD-F); Dansil
4-dimetilaminiazobenzen-4klorida
sulfinil
(Dabsyl-Cl);
1naftilisosianat (NIC-1).
Asam-asam
4-dimetilaminiazobenzen-4Fluoresamin
amino (peptida)
sulfinil (Dabsil-Cl)
o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-2oksa-1,3-diazol (NBDCl);
7-fluoro-4nitrobenzo-2-oksa-1,3diazol (NBD-F);
Kegunaan HPLC antara lain:
5.1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri
farmasi
dan pestisida.
5.2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
5.3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
5.4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5.5. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
5.6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
5.7. Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

6. Metode Preparasi Sampel

Sampel harus dalam bentuk larutan. Untuk skala analisis sampel dalam L, konsentrasi sampel
yang diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi
maksimal adalah sekitar 40 ppm.
7. Metode Analisis
Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaliguskualitatif. Untuk analisa
kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram baku pembanding
berdasarkan waktu retensinya.
Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C= Konsentrasi
X = sampel
P = pembanding
Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan menggunakan kurva
kalibrasi larutan standar.

Prosedur Kerja

1. Pembuatan pelarut dan fasa gerak

Metanol disaring dengan PTFE dan air disaring dengan selulosa nitrat. Lalu dicampur masing-masing
dengan perbandingan 75:25 dengan volume total sebanyak 500 mL.
2. Pembuatan larutan induk parasetamol
Sebanyak 6,25 mg parasetamol ditimbang dengan neraca analitik dalam botol timbang. Parasetamol
tersebut dilarutkan dengan sedikit pelarut, dipindahkan ke dalam labu ukur 25 mL. Setelah itu,
dihomogenkan dan ditambahkan pelarut sampai tanda batas.
3. Pembuatan larutan standar parasetamol
Larutan induk parasetamol masing-masing dipipet sebanyak 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL dan 5 mL yang
masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Setelah itu ditambahkan pelarut masingmasing sebanyak 5 mL dan dihomogenkan. Kemudian ditambah lagi pelarut sampai tanda
batas.Selanjutnya disaring dengan PTFE dan disimpan dalam botol vial lalu didegassing.
4. Pembuatan larutan sampel parasetamol
Sebanyak 6 tablet obat sampel masing-masing ditimbang beratnya dan dihitung berat rata-ratanya.
Tablet obat tersebut digerus dalam mortar hingga halus dan ditimbang serbuknya sebanyak 27 mg
dengan neraca analitik dalam botol timbang. Kemudian dilarutkan dengan sedikit pelarut dan
dipindahkan ke dalam labu ukur 25 mL, sampel dihomogenkan dalam ultrasonic vibrator.Setelah itu
ditambahkan pelarut hingga tanda batas.

Larutan sampel tersebut kemudian disaring dan ditampung dalam labuerlenmeyer. Kemudian dipipet
sebanyak 1 mL dan disimpan dalam labu ukur 10 mL yang diencerkan dengan pelarut sampai tanda
batas. Larutan sampel teresbut disaring kembali menggunakan membran PTFE dan filtratnya
didegassing selama 5 menit. Setelah itu, sampel siap untuk diinjeksikan.
5. Prosedur HPLC
Alat dan eluen yang akan digunakan dikondisikan sehingga setimbang +/- 30 menit. Kelima standar
parasetamol diinjeksikan, diikuti dengan sampel yang diinjeksikan sebanyak 2 kali pengulangan.
Rata-rata area sampel dihitung dan kadar parasetamol dalam sampel ditentukan dengan metode kurva
kalibrasi.

8. Hasil dan Analisis Data

Pada percobaan penentuan kadar parasetamol dalam sampel obat menggunakan kromatografi
cairan kinerja tinggi (HPLC) ini menggunakan fasa gerak metanol dan air dengan komposisi 75:25.
Fasa gerak dalam HPLC ini selain berfungsi sebagai pelarut, juga bersifat interaktif sehingga bisa
berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Fasa gerak dalam hal ini bertindak sebagai
pelarut sangat mempengaruhi waktu retensi, sehingga pelarut yang digunakan harus benar-benar
jernih dan murni. Oleh sebab itu, metanol dan air terlebih dahulu disaring.
Dalam pembuatan larutan induk parasetamol, pembuatannya harus dilakukan dalam satu kali
pengerjaan, artinya untuk membuat larutan standar parasetamol dan untuk keperluan pengenceran
sampel harus menggunakan larutan induk parasetamol yang sama. Hal tersebut dilakukan untuk
menjaga agar peak yang ditunjukkan kromatogram sampel memungkinkan masih berada dalam
rentang konsentrasi larutan standar yang dibuat.
Selain itu, baik dalam pembuatan larutan induk parasetamol, larutan standar parasetamol maupun
sampel harus dihomogenkan, supaya larutan benar-benar bercampur sempurna (merata). Larutan
standar dan sampel juga harus didegassing untuk menghilangkan gas-gas yang kemungkinan ada
dalam larutan tersebut. Hal itu dilakukan karena gas dapat mengganggu baseline pada kromatogram,
sehingga peak yang dihasilkan tidak sesuai.
Akibat perbedaan interaksi antara solut dengan fasa gerak dan fasa diam yang terjadi mulai dari
kolom sampai terdeteksi oleh detektor, maka hasil yang diperoleh adalah dalam bentuk kromatogram
yang diperlihatkan oleh rekorder. Deret larutan standar yang dibuat mulai dari konsentrasi 25, 50, 75,
100 dan 125 ppm
Berikut tabel data deret larutan standar yang diperoleh:
Konsentrasi
(ppm)

Luas Area

Waktu
retensi

25

2488335

1,51

50

4126411

1,50

75

6744285

1,51

100

8901360

1,51

125

10667748

1,51

Analisis terhadap cuplikan atau sampel obat dilakukan setelah semua deret larutan standar
telah dianalisis. Sampel diinjeksikan sebanyak 2 kali injeksi untuk memperoleh luas area rata-rata
yang nantinya akan digunakan untuk menghitung kadar parasetamol yang terdapat dalam sampel obat
tersebut.
Berikut tabel data sampel yang diperoleh:
Data Sampel
Penginjeksian 1

Waktu Retensi (min)

Area

Peak 1

1,51

7762424

Peak 2

2,31

13143

Peak 1

0,06

7100

Peak 2

0,26

57665

Peak 3

1,51

7777816

Peak 4

2,30

6844

Penginjeksian 2

Kromatogram sampel yang diperoleh dari masing-masing penginjeksian menunjukkan adanya

2 peak dan 4 peak. Hal tersebut dikarenakan kandungan dalam sampel obat tidak hanya mengandung
parasetamol saja, tetapi juga mengandung bahan lain seperti propanezon, deklorfenilamina maleat dan
kafein, sehingga peak lainnya yang ditunjukkan dalam kromatogram adalah bahan lain yang
terkandung dalam sampel obat tersebut. Peak yang dianggap sebagai peak parasetamol adalah peak
yang pertama (penginjeksian pertama) dan peak yang ketiga (penginjeksian kedua) karena dilihat dari
waktu retensi yang sama atau hampir sama dengan waktu retensi deret larutan standar.
Untuk menentukan kadar parasetamol yang terkandung dalam sampel obat tersebut, maka
dibuat terlebih dahulu kurva kalibrasi dari data deret larutan standar.
Dari kurva kalibrasi tersebut, diperoleh persamaan garis y = 84535x + 24549, sehingga setelah
dilakukan perhitungan menggunakan persamaan garis, maka kadar parasetamol dalam sampel adalah
84,837% dalam 27 mg sampel obat.
Kesimpulan :
Berdasarkan percobaan, diperoleh kadar parasetamol dalam 27 mg sampel obat sebesar 84,837%
9. Kelebihan dan Kekurangan
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi.

9.1.

kelebihan dari alat HPLC antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya
memisah yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang
tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan
zat yang tidak stabil.
Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

9.2.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

Harga sebuah alat HPLC cukup mahal
Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5
dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi
harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

10. Pembahasan
Dari hasil praktikum diatas di dapati hasil yang gagal karena tidak di dapati
persamaan linear yang akan digunakan untuk menghitung kadar sampel vitamin C.
Hal ini disebabkan karena kesalahan dalam melakukan pengenceran (human error).
Pada kurva yang di tampilkan di atas menunjukkan peak kurva yang berbeda-beda di
karenakan kadar vitamin C yang diukur berbeda-beda.
11. Kesimpulan
1. Pengenceran merupakan faktor yang sangat penting karena
mempengaruhi kadar/konsentrasi vitamin C.
2. Seharusnya semakin tinggi peak dari kurva yang terlihat maka semakin
besar konsentrasi vitamin C.
3. HPLC merupakan suatu metode yang baik untuk menganalisa suatu
produk obat.