2.

Inokulasi Bakteri
Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan

bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat
tinggi. Inokulasi dilakukan dalam kondisi aseptik, yakni kondisi dimana semua alat yang
ada dalam hubungannya dengan medium dan pengerjaan dijaga agar tetap steril. Hal ini
untuk menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro 1998).
Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman
bakteri (inokulasi) yaitu :
1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi
kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah
kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui
suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet.
2. Pemindahan dengan dengan pipet
Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1
ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni.
3. Pemindahan dengan kawat inokulasi.
Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel. Ujungnya boleh lurus juga boleh
berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat
ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja
setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala.
2.1.1 Teknik Inokulasi
Ada

beberapa

metode

yang

digunakan

untuk

mengisolasi

biakan

murni

mikroorganisme yaitu :
a) Metode gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang
sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan

media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara
garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh
menjadi koloni.
Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila
dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang
berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat
goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.
b) Metode tebar.
Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish
dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan
dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan pinggan kedua
untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa
pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.
a) Metode tuang. Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar
melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada
suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni 1997).
b) Metode tusuk. Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan
ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke
dalam media (Winarni 1997).
2.1.2 Macam-Macam Media
Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :
1. Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme.
2. Plate culture: media padat dalam petridish.
3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi.
4. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan cara
penusukan.

5. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.

6. Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok.
2.1.3 Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri
a) Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk
seperti benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh
di dalam suatu media.
b) Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose
yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif
banyak.

2.2

Isolasi Mikroba
Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam

skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam
suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat bakteri yang kita butuhkan tersebut
tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal
dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis
nutrient yang disyaratkan bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang ,menyediakan
kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar 1986).
Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, substrat yang
berupa bahan pangan, tanaman, dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri,
khamir, kapang, dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di lingkungan ini
sangatlah beranekaragam sehingga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap
penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini
kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk mengisolasi
DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotic
(Ferdiaz 1992).

Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba

diluar dari lingkungan alamiahnya. Pemisahan mikroorganisme dari lingkungan ini
bertujuan untuk memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan
bakteri lainnya dan disebut biakan murni. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan
satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari camouran bermacam-macam
mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel
mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya (Nur dan Asnani 2007).
Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu
biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan
gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan padda prinsip pengenceran dengan
maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat
terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto 2004).
Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain
digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi,
fisiologi, dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies (Dwijoseputro
2005). Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu
antara lain:
1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi.
2. Tempat hidup atau asal mikrobatersebut.
3. Medium pertumbuhan yang sesuai.
4. Cara menginkubasi mikroba.
5. Cara menginokulasi mikroba.
6. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai
dengan yang dimaksud.
7. Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni.

2.2.1 Metode Isolasi mikroba

Menurut hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk memperoleh
biakan murni yaitu:
1.

Metode cawan gores. Metode ini mempunyai dua keuntungan, yanti menghemat
bahan dan waktu. metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik

2.

kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.

Metode cawan tuang. Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi
campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan specimen dalam medium
agar yang telah dicairkan dan didinginkan (500C) yang kemudian dicawankan.
Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam specimen pada umumnya tidak
diketahui sebelumnya, maka pengenceran perku dilakukan beberapa tahap
sehingga sekurang-kurangnya satu diantara cawan tersebut mengandung koloni
terpisah diatas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan

3.

dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi.

Teknik sebar (spread plate). Teknik isolasi mikroba dengan cara menyebarkan

4.

mikroba pada permukaan media yang akan digunakan.

Teknik pengenceran (dilution method). Suatu sampel dari suatu suspense yang
berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang
tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian diambil kira-kira 1 mL untuk
diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL
untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan
mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam medium tersebut, akan
tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang
demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin bahwa koloni

tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat
5.

mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.

Teknik micromanipulator. Mengambil satu bakteri dengan mikropipet yang
ditempatkan

dalam

micromanipulator,

kemudian

ditempatkan

dalam

micromanipulator, kemudian dipempatkan dalam medium encer untuk dibiakkan.

Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua
pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan
suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut
dikenal dengan isolasi mikroba.
2.2.2 Cara mengisolasi mikroba
1.

Isolasi pada agar cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengnecerkan mikroorganisme
sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap
koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel
tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: metode gores
kuadran, dan metode agar cawan tuang. Metode gores kuadran, merupakan metode yang
dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi mikroorganisme, dimana setiap koloni
berasal dari satu sel. Metode agar tuang berbeda dengan metode gores kuadran, cawan
tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50 0C) yang kemudian
dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir

2.

mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan/di dalam cawan.

Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada
agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga
perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi

3.

pegenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran
besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel
mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel

tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun
micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

Faktor-faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba:

a.

Suplai nutrisi

Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber
energy dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah: karbon, nitrogen,
hydrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi, dan seju,lah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau
kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga
pada kahirnya dapat menyebabkan kematian. Kondisi tidak bersih dan higienis pada
lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba
sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu
prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih dan higienis adalah meminimalisir sumber
nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali.
b.

Suhu atau temperature

Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam mempengaruhi pertumbuhan

mikroorganisme. Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang berlawanan:
1.

Apabila suhu naik maka kecepatan metabolism naik dan pertumbuhan dipercepat.
Sebaliknya apabila suhu turun, maka kecepatan metabolism akan menurun dan pertumbuhan

2.

diperlambat.
Apabila suhu naik atau turun secara drastic, tingkat pertumbuhan akan terhenti, komponen
sel menjadi tidak aktif dan rusak sehingga sel-sel menjadi mati.
Berdasarkan

hal

diatas,

maka

suhu

yang

berkaitan

dengan

pertumbuhan

mikroorganisme digolongkan menjadi tiga, yaitu:

1.
2.

Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka pertumbuhan terhenti.
Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling cepat dan optimum
disebut juga suhu inkubasi.

3.

Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada di atasnya maka pertumbuhannya tidak
terjadi.

c.

Keasaman atau kebasaan (pH)

Setiap organisme memiliki pH masing-masing dan memiliki pH optimum yang berbedabeda. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 8 dan nilai pH di luar

d.

kisaran 2 sampai 10 biasanya bersifat merusak.

Ketersediaan oksigen
Mikroorganisme memeilki karakteristik sendiri-sendiri di dalam kebutuhannya akan
oksigen. Faktor-faktor yang memungkinkan terjadinya kontaminasi medium adalah:

1.
2.
3.
4.

Sterilisasi medium yang kurang sempurna.

Medium memenuhi semua kebutuhan nutrient.
Proses prkatikum yang tidak aseptis.
Lingkungan laboratorium yang kurang steril.

Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus
dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang
sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril,
hal ini untuk menghindarkan kontaminasi, yakni masuknya mikroorgasnisme yang tidak
kita inginkan. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba adalah
sebagai berikut:

1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah
menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali

bila meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan
di dalam suatu kotak berkaca (enkas).

2. Pemindahan dengan Kawat Inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung kawat boleh
lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini
dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin
kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu juga
dipanasi setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (sampel bakteri)
selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang
membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca
benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.

3. Pemindahan dengan Pipet

Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu.
Untuk itu diambillah 1 ml sampel untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang
disterilkan. Dalam pengenceran ini tergantung dari keadaan air atau susu yang diselidiki.
Kemudian diambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur-adukkan dengan medium agaragar yang masih dalam keadaan cair. Lalu agar-agar yang masih encer dituangkan di cawan
petri. Setelah agar-agar membeku, maka cawan petri yang berisi piaraan baru itu disimpan
dalam tempat yang aman, misalnya dalam inkubator.

4. Teknik biakan murni (Cara Menyendirikan Biakan Murni)

Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang
lain. Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saproba
(saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh
suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari
luar. Medium untuk membiakkan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran
(kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak
mikroorganisme. (3;64-65)

Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu:
a.

Cara Pengenceran
Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran
bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari
pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, diambil lagi untuk
disebarkan pada suatu medium padat. Kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa
koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita memperoleh satu koloni
saja. Dalam hal demikian, kita telah memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnua spesies
ini dapat kita jadikan piaraan murni (biakan murni).

b. Cara Penuangan
Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah
diencerkan, dan sampel itu kemudian disebarkan dalam satu medium dari kaldu dan gelatin

encer. Setelah medium mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni
yang masing-masing dapat dianggap murni.

c.

Cara Penggesekan / Penggoresan

Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan ketrampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri
anaerob tidak dapat tumbuh.
Ada beberapa teknik penggesekkan, yakni :

o Goresan T
Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan Petri
Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung
Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan
teruskan goresan di daerah II
Pijarkan kembali ose, Prosedur di atas diulangi untuk daerah III

o Goresan kuadran
Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4.

o Goresan radian
Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan
Pijarkan sengkelir dan dinginkan kembali

 Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan
Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya
Pijarkan ose

o Goresan sinambung
Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar
Jangan pijarkan ose,putar lempengan 1800 ,gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada
sisa permukaan lempengan agar

d. Cara penyebaran
Pengenceran sampel seperti pada cara penuangan.,Dengan memipet sebanyak 0,1 ml
cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.Cairan
sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelkas. Pada teknik ini sterilisasi
penyebar dilakukan dengan mencelupkan alkohol terbakar habis. Penyebar didinginkan
dahulu sebelum digunakan untuk menyebarkan cairan sampel pada permukaan agar.
Penyebaran cairan contoh(sampel)dilakukan dengan memutar agar lempengan tersebut.

e.

Cara pengucilan satu sel(sinle cell isolation)

Cara ini dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari
sekian banyak bakteri,dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain.,Alat semacam ini tidak

mudah untuk menggunakannya.Alat iu berupa mikropipet yang ditempatkan pada suatu

mikromanipulator.(3;65-69)

Flora mikroba di lingkungan mana saja pada umumnya terdapat dalam populasi
campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di
alam. Untuk mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies tersebut harus dapat dipisahkan
dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi
biakan murni. Sesungguhnya ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari
suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan yaitu: Metode
cawan gores dan Metode cawan tuang (4;62-69)
Suspensi mikrobmikroba digoreskan pada agar lempengan, agar miring atau media
cair. Sifat biakan dari suatu mikroorganisme tergantung pada penampilannya pada berbagai
media. Ciri berikut ini digunakan untuk mengevaluasi biakan:
Agar Miring
Sifat pertumbuhan pada agar miring terlihat sebagai tidak ada, sedikit, atau subur.
Pengamatan pembentukan warna koloni. Mikroba yang tumbuh dengan subur diatas
permukaan suatu media akan telihat lebih buram dibanding dengan pertumbuhan yang tidak
subur.

 Media Cair
Sifat pertumbuhan pada bagian permukaan, dibawah permukaan dan dasar tabung
dapt terlihat dengan jelas. Pada beberapa mikreoba terlihat pembentukan partikelyang tebal
pada lapisan pemukaan. Dibawah lapisan permukaan dapat terlihat pertumbuhan yang
keruh,bergranula, atau flokulen, sedangkan pada bagian dasar kadangkala terlihat
sedimenberupa granula kental atau terdiri dari partikel besar.
Agar lempengan
Koloni yang tumbuh diatas lempeng perlu diperhatikan warna, sifat tembus cahaya,
pinggiran, sifat permukaan dan bentuknya. (5;78-79)
Kunci pokok dalam mempelajari identifikasi mikroorganisme termasuk bakteri
adalah adanya kultur murni hasil isolasi mikroorganisme, sehingga identifikasi dapat
berhasil dengan baik, apabila diperoleh isolat yang telah murni. Kultur murni adalah suatu
koloni yang berasal dari satu sel mikroorganisme atau bakteri. Kebanyakan identifikasi
sangat tergantung dari raksi-reaksi positif atau negatif yang spesifik yang disebabkan oleh
suatu kultur murni. Adanya pencemaran mikroorganisme lain, akan menyebabkan hasil uji
dapat positif atau negatif palsu. Sehingga dalam mikrobiologi klinik akan memperoleh hasil
diagnosa salah atau palsu. (6;322)

Begitu pentingnya kultur murni dalam identifikasi mikroorganisme (bakteri), maka

cara-cara untuk memperoleh kultur menjadi sangat fundamental bagi bidang mikrobiologi.
Cara termudah untuk memperoleh kultur murni adalah dengan cara penanaman dalam plat

agar secara goresan atau dengan taburan. Sel inokulum akan tersebar diatas media agar
sedemikian rupa, sehingga koloni yang tumbuh merupakan koloni yang berasal dari satu
sel. Koloni-koloni tersebut selanjutnya digoreskan kembali pada medium agar yang lainnya
untuk mengecek kemurniannya. (6;323)
Cara lain untuk mempermudah mengenal kultur murni adalah dengan menggunakan
media differensial. Suatu reaksi dengan medium memungkinkan differensiasi antara dua
atau lebih mikroorganisme. Mikroorganisme yang diinginkan mungkin tidak terbedakan,
tetapi kemungkinan-kemungkinan akan memperkecil kelompok yang dicari. (6;325)
Bacillus Subtilis diasosiasikan dengan keracunan makanan dan bermacam infeksi,
seperti septicemia, Panophthalmitis, Pneumonia, infeksi luka dan seritonitis. Koloni
bacillus subtilis adalah besar dan biasanya berpigmen kuning atau merah jambu sampai
oranye atau coklat.
Bacillus merupakan sel berbentuk batang dengan ukuran 0,3-2,2 m x 1,27-7,0 m.
sebagian besar motif flagellum khas lateral membentuk endospora; tidak lebih dari satu
dalam satu sel sporangium. Gram positif. Metabolism dengan respirasi sejati-Fermentasi
sejati atau kedua-duanya yaitu respirasi dan fermentasi. Aerobik sejati atau anaerobic
fakultatif. Umum dijumpai dalam tanah.

Identifikasi mikroba
Identifikasi mikroba merupakan salah satu tugas yang lazim dilakukan di laboratorium
mikrobiologi.Bakteri memiliki beberapa macam bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, dan
spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan
pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus
pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Mikroorganisme yang ada di
alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan
bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri
sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Uji biokimiawi bakteri adalah salah satu uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi
jenis bakteri. Hal ini karena setiap jenis bakteri memiliki sifat biokimia yang berbeda.
Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena
itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam
identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai
mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin
dilakukan. Manusia tidak dapat melihat dan mengidentifikasi bakteri tanpa diadakan
percobaan.
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif
dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat

tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya
sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel sepertiMycoplasma sp .Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat
ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang
baik adalah 24 jam : Biakan muda). Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan
penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan
pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat
keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif
dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan crystal violet sehingga
terlihat sebagai bakteri gram negatif. Umumnya zat warna yang digunakan adalah garamgaram yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu
ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang
bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna
tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif
maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat
warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan
memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan
karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma,
sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan
muatan

negatif

dalam

sel,

sehingga

mikroorganisme

lebih

jelas

terlihat

(Dwidjoseputro.1998).Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan

untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar
belakang sediaan pewarnaan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat
warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses
pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif
yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai
bagian sel yang bermuatan Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu: Isolasi Pada

Cawan Agar :Prinsip metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan
mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari
mikroorganisme lain. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut
setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi
pada cawan agar, yaitu: metode gores kuadran dan metode agar cawan tuang. Metode gores
kuadran bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya
mikroorganisme dimana setiap koloni berasal dari satu sel. (Dwidjoseputro.1998)
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut
pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang
bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada
pewarnaan

negatif

latar

belakang

disekeliling

mikroorganisme

diwarnai

untuk

meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup

penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas Sebelum dilakukan pewarnaan
dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang
terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat .Kesalahan yang sering
kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi
tersebut berasal dari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu
encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya .Metode
agar tuang berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar
yang dicairkan dan didinginkan 50oC, yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu
dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah
di atas permukaan/di dalam cawan. -Isolasi Pada Medium Cair : Metode ini dilakukan bila
mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat
tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa
serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran, peluang untuk mendapatkan satu sel
semakin besar.-Isolasi Sel Tunggal :Metode ini dilakukan untuk mengisolasi sel
mikroorganisme

berukuran

besar

yang

tidak

dapat

diisolasi

dengan

metode

cawan atau medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran
sekitar 100 kali. (Waluyo, 2004).