BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tumbuhan Jengkol
2.1.1. Morfologi Tumbuhan Jengkol

Tumbuhan Jengkol atau lebih dikenal dengan tumbuhan Jering adalah termasuk dalam
Famili Fabaceae (suku biji-bijian). Tumbuhan kulit buah jengkol atau Jering dengan
nama latinnya yaitu (Pithecellobium lobatum Benth.) dengan sinonimya yaitu A.
Jiringa, Pithecollobioum jiringa dan Archindendron pauciflorum adalah tumbuhan
khas di wilayah Asia Tenggara. Jengkol merupakan salah satu tumbuhan dengan
ukuran pohon yang tinggi yaitu 20 m , tegak bulat berkayu, licin, percabangan
simpodial, cokelat kotor. Bentuk majemuk, lonjong, berhadapan , panjang 10 - 20 cm,
lebar 5 - 15 cm, tepi rata, ujung runcing, pangkal membulat, pertulangan menyirip,
tangkai panjang 0,5 1 cm, warna hijau tua. Struktur majemuk, berbentuk seperti
tandan, diujung dan ketiak daun, tangkai bulat, panjang 3 cm , berwarna ungu
kulitnya, bentuk buah menyerupai kelopak mangkok, benang sari kuning, putik
silindris, kuning mahkota lonjong, putih kekuningan. Bulat pipih berwarna cokleat
kehitaman, berkeping dua dan berakar tunggang. Pohon Jengkol sangat bermanfaat
dalam konservasi air disuatu tempat hal ini dikarenakan ukuran pohonnya yang sangat
tinggi.

2.1.2. Klasifikasi Ilmiah Jengkol adalah sebagai berikut :

Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Divisi

: Magnoliophyta (berbunga)

Kelas

: Magnoliopsida (dikotil)

Ordo

: Fabales

Famili

: Mimosaceae (polong-polongan)

Genus

: Pithecollobium

Spesies

: Pithecollobium lobatum (Benth.) (Steenis, V., 2005)

Universitas Sumatera Utara

2.1.3. Manfaat kulit buah tumbuhan Jengkol

Salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai tumbuhan obat adalah kulit buah
tumbuhan Jengkol (Pithecollobium lobatum Benth.). Bagian dari Jengkol yang
digunakan adalah kulit buahnya yang dapat dimanfaatkan sebagai obat diabetes (gula
darah).(id.wikipedia.org/wiki/Jering) dan dapat digunakan sebagai herbisida alami
untuk menekan pertumbuhan gulma yang mengganggu pertanian.
(http://bdpunib.org/bdp/abstrak/2005/budinur.html)

2.2. Senyawa Flavonoida

2.2.1. Pendahuluan

Istilah senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari tumbuhan,
yang mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua
penyulih (pengganti) hidroksil. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air
karena umumnya mereka sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan
biasanya terdapat vakuola sel (membran sel).

Beberapa ribu senyawa fenol alam telah diketahui strukturnya. Flavonoida

merupakan golongan terbesar, tetapi fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoida, dan
kuinon fenolik juga tertdapat dalam jumlah besar. Beberapa golongan bahan polimer
penting alam tumbuhan lignin, melanin, dan tanin adalah senyawa polifenol dan
kadang-kadang satuan fenolik dijumpai pada protein, alkaloida, dan diantara
terpenoida. Peranan beberapa golongan senyawa fenol sudah diketahui (misalnya
lignin sebagai bahan pembangun dinding sel, antosianin sebagai pigmen bunga),
sedangkan peranan senyawa yang termasuk golongan lain masih merupakan hasil
dugaan belaka. Flavonol. Misalnya, tampaknya penting pada pengaturan pengendalian
tumbuh pada tanaman kacang, Pisum sativum. Pengaruhnya yang merugikan terhadap
kebiasaan makan serangga telah menunjukkan bahawa flavonoida mungkin
merupakan faktor pertahanan alam.

Universitas Sumatera Utara

Bagi biokimiawan tumbuhan, senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan

gangguan besar karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein melalui
ikatan hidrogen. Bila kandungan sel tumbuhan bercampur dan membran menjadi
rusak selama proses isolasi, senyawa fenol cepat sekali membentuk kompleks dengan
protein. Akibatnya, sering terjadi hambatan terhadap kerja enzim pada ekstrak
tumbuhan kasar. Sebaliknya, fenol sendiri sangat peka terhadap oksidasi enzim dan
mungkin hilang pada proses isolasi akibat kerja enzim fenolase yang terdapat dalam
tumbuhan. Ekstraksi senyawa fenol-tumbuhan dengan etanol mendidih biasanya
mencegah terjadinya oksidasi enzim, dan prosedur ini seharusnya dilakukan secara
rutin.

Cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah dengan

menambahkan larutan besi (III) klorida 1% dalam air atau etanol kepada larutan
cuplikan, yang menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat.
Cara ini, yang dimodifikasi dengan menggunakan campuran segar larutan besi (III)
klorida 1% dalam air dan kalium heksasianoferat (III) 1%, masih tetap digunakan
secara umum untuk mendeteksi senyawa fenol pada kromatogram kertas. Tetapi,
kebanyakan senyawa fenol (terutama flavonoida) dapat dideteksi pada kromatogram
berdasarkan warnanya atau fluoresensinya dibawah lampu UV, warnanya diperkuat
atau berubah bila diuapi amonia. Pigmen fenolik berwarna dan warnanya ini dapat
terlihat

jadi,

mudah

disimak

(dipantau)

selama

proses

isolasi

dan

pemurnian.(Harborne, 1987)

Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang

mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzene yang dihubungkan
menjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon. Senyawa-senyawa
flavonoida adalah senyawa 1,3 diaril propana, senyawa isoflavonoida adalah 1,1 diaril
propana. Istilah flavonoida deiberikan pada suatu golongan besar senyawa yang
berasal dari kelompok senyawa yang paling umum, yaitu senyawa flavon; suatu
jembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto, dan atom karbon
benzil yang terletak disebelah cincin B. Senyawa heterosiklik ini, pada tingkat
oksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk

Universitas Sumatera Utara

yang mempunyai cincin C dengan tingkat oksidasi paling rendah dan dianggap
sebagai struktur induk dalam nomenklatur kelompok senyawa-senyawa ini. (Manitto,
1981)

Semua varian falvonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama,
yang memasukkan substrat dari alur sikimat dan alur asetat-malonat (Hahlbrock &
Grisebach, 1975; Wong, 1976), flavonoida pertama dihasilkan segera setelah kedua
alur itu bertemu. Sekarang, flavonoid yang dianggap pertama kali terbentuk pada
biosintesis ialah khalkon (Hahlbrock, 1980), dan semua bentuk lain diturunkan
darinya melalui berbagai alur. Modifikasi flavonoida pengurangan) hidroksilasi;
metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; isoprenilasi gugus hidroksil atau inti
flavonoida;

metilenasi

gugus

orto-

dihidroksil;

dimerisasi

(pembentukan

biflavonoida); pembentukan bisulfate; dan

3'
2'
8

(8a) 1
9 O

5'

1'
6'

4'

6
5

10
(4a)

4
O

yang terpenting, glikosilasi gugus hidroksil (pembentukan flavonoida O-glikosida)

atau inti flavonoida (pembentukan flavonoida C-glikosida). (Markham, 1988)

2.2.2. Struktur dasar Senyawa Flavonoida

Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti
fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat
digambarkan sebagai berikut :

Universitas Sumatera Utara

B
C
C

Kerangka dasar senyawa flavonoida

Cincin A adalah karakteristik phloroglusinol atau bentuk rosorsinol tersubstitusi.

HO

HO

A
C3

C6 (B)

OH

C3

C6 (B)

Namun sering terhidroksilasi lebih lanjut :

HO

O
OCH3

A
C3

HO

H3CO
A

C6 (B)

C3

H3CO

OH

C6 (B)

OCH3

Cincin B adalah karakteristik 4-,3,4-,3,4,5- terhidroksilasi

R

(A) C6

C3

R = R' =H, R' = OH

R = H, R' = R" = OH
R = R' = R" = OH
(juga, R = R' = R"= H)

(Sastrohamidjojo, 1996)

2.2.3. Klasifikasi Senyawa Flavonoid

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita

serapan yang kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,
umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida.
(Harborne, 1996). Pada flavonoida O-glikosida, suatu gugus hidroksil flavonoida (atau

Universitas Sumatera Utara

lebih) terikat pada satu gula (lebih) dengan ikatan yang tahan asam. Glukosa
merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat
adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan rutinosa. Waktu yang diperlukan
untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoida O-glikosida dengan hidrolisis
asam ditentukan oleh sifat gula tersebut.

Pada flavonoida C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoida dan
dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzene dengan suatu ikatan
karbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan
pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoida, misalnya pada orientin. (Markham,
1988).

Flavonoid memiliki dua cincin benzene yang dipisahkan oleh sebuah unit
propane dan diturunkan dari senyawa flavone. Secara umum merupakan golongan
senyawa yang mudah larut dalam air. Kebanyakan senyawa terkonjugasi yang pada
umumnya berwarna cerah. Secara umum dapat dijumpai pada tumbuhan sebagai
glikosidanya yang meiliki struktur yang rumit. Perbedaan kelas antara golongan
senyawa flavonoida ini adalah adanya tambahan oksigen yang terikat pada cincin
heterosiklik dan gugus hidroksil. Senyawa yang termasuk dalam golongan tersebut
adalah katekin, leukoantosianidin, flavanone, flavanonol, flavone, antosianidin,
flavonol,

khalkone,

aurone,

dan

isoflavone.

Struktur

antara

katekin

dan

leukoantoasianidin memiliki struktur yang mirip dan jarang dijumpai bentuk

glikosidanya. Dan akan mengalami polimerisasi membentuk tanin yang terkandung
pada daun teh.

Flavanon dan flavanonol jarang dijumpai dalam bentuk glikosidanya. Flavon

dan flavonol secara luas terdistribusi sebagai senyawa fenolik. Antosianin adalah
pigmen tumbuhan yang secara umum berwarna merah dan jarang dijumpai berwarna
biru pada suatu bunga. Dan dapat dihasilkan sebanyak 30% dari bunga kering. Dapat
dijumpai sebagai glikosida. Khalkone termasuk butein, dengan cincin furan ditemukan
dalam senyawa flavonoid, meskipun hal ini sering digunakan sebagai titik pengkontrol

Universitas Sumatera Utara

untuk pH. Auron merupakan pigmen berwarna kuning emas yang secara umum
dijumpai pada bunga. (Kaufman,P. 1999).
Isoflavone yang lebih dikenal sebagai 3- phenylkromon Dapat diketahui ada
sekitar 35 jenis isoflavone yang dikenal, yang mana contoh umumnya sebagai berikut
:Daidzein, Genistein, Tianlancuayin. Isoflavone dapat mengalami degradasi dengan
danya penambahan basa sehingga menghasilkan Desoxybenzoin dan asam formiat
selanjutnya Desoxybenzoin terpisah dan mengalami fusi (penggabungan dua inti
ringan menjadi inti yang lebih berat molekulnya) basa dan metilasi. Isoflavone banyak
digunakan sebagai estrogenic, insectidal, dan sebagai anti jamur, beberapa dari
senyawa itu adalah berpotensi dihasilkan dari racun ikan. (Raphael,I. 1991)

Menurut Robinson (1955), flavonoid dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman

pada rantai C3 yaitu :

1. Flavonol
Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon
flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai
antioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan
merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana
basa dioksidasi oleh udara tetapi begitu cepat sehingga penggunaan basa pada
pengerjaannya masih dapat dilakukan.

H
O

OH
H
O

Struktur Flavonol

Universitas Sumatera Utara

2. Flavon
Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi
warnaya. Flavon terdapat juga sebagai glikosidanya lebih sedikit daripada jenis
glikosida pada flavonol. Flavon yang paling umum dijumpai adalah epigenin dan
luteolin. Luteolin merupakan zat warna yang pertama kali dipakai Eropa. Jenis yang
paling umum adalah 7-glikosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula
melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggap
sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoid.

3'
2'
1
8

4'

1'

5'

6'

10

5
O

Struktur Flavon

3. Isoflavon
Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai
fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai
pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya
tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein)
memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi ammonia, tetapi
kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan ammonia
berubah menjadi cokelat.

Universitas Sumatera Utara

Struktur Isoflavon
4. Flavanon

Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga.
Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah
jeruk; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat
dalam buah anggur dan jeruk.

Struktur Flavanon

5. Flavanonol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika
dibandingkan dengan flavonoid lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena
konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.

OH
O

Struktur Flavanonol

Universitas Sumatera Utara

6. Katekin
Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu.
Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir
dan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai
antioksidan.
OH
OH

HO

OH
HO

Struktur Katekin

7. Leukoantosianidin
Leukoantosianidin merupakan senyawa tidak berwarna, terutama terdapat pada
tumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat glikosida, contohnya melaksidin,
apiferol.

OH
HO

OH

Struktur Leukoantosianidin

8. Antosianin
Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam
tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab
hampir semua warna merah jambu, merah marak, ungu,. dan biru dalam daun, bunga,
dan buah pada tumbuhan tingkat tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan
turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari

Universitas Sumatera Utara

pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau
dengan metilasi atau glikosilasi.
O

OH

Struktur Antosianin

9. Khalkon
Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna cokelat kuat dengan sinar UV
bila dikromatografi kertas. Aglikon flvon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena
hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas
dalam pengembang air. (Harborne, 1996).

Struktur Khalkon

10. Auron
Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita.
Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi
kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah
menjadi merah jingga bila diberi uap amonia. (Robinson, 1995)

O
HC

Struktur Auron

Universitas Sumatera Utara

Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana

semua flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan
semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni :
Golongan
Flavonoida

Penyebaran

Ciri Khas

Antosianin

Pigmen bunga merah marak, dan Larut dalam air, maks 5 1 5-545
biru juga dalam daun dan jaringan nm, bergerak dengan BAA pada
lain.
kertas.

Proantosianidin

Terutama tidak berwarna dalam Menghasilkan

antosianidin
tumbuhan berkayu.
(warna dapat diekstraksi dengan
amil alkohol) bila jaringan
dipanaskan dalam HCl 2M
selama setengah jam.
Terutama
ko-pigmen
tidak Setelah hidrolisis, berupa bercak
berwarna dalam bunga sianik dan kuning murup pada kromatogram
Forestal bila disinari dengan sinar
asianik; tersebar luas dalam daun.
UV; maksimal spektrum pada
330-350.
Seperti flavonol
Setelah hidrolisis, berupa bercak
cokelat redup pada kromatogram
Forestal maksimal spektrum pada
330-350 nm.
Seperti flavonol
Mengandung gula yang terikat
melalui ikatan C-C; bergerak
dengan pengembang air, tidak
seperti flavon biasa.
Tidak
berwarna;
hampir Pada kromatogram BAA berupa
seluruhnya
terbatas
pada bercak redup dengan Rf tinggi.
gimnospermae(tumb.berbiji
terbuka)
Dengan
ammonia
berwarna
merah; maksimal spektrum 370410 nm.

Flavonol

Flavon

Glikoflavon

Biflavonil

Khalkon dan Auron

Flavanon
Isoflavon

Kadang-kadang terdapat juga

dalam jaringan lain.
Tidak berwarna; dalam daun dan
buah (terutama dalam Citrus) tidak
berwarna; sering kali akar; hanya
terdapat
dalam
satu
suku,
Leguminosae(tumb.
Kacangkacangan).

Berwarna merah kuat dengan

MgHCl kadang-kadang sangat
pahit.
Bergerak pada kertas dengan
pengembang air, tak ada uji
warna yang khas.

Universitas Sumatera Utara

2.2.4. Metoda Isolasi Senyawa Flavonoida

Isolasi konstituen flavonoida dari tumbuhan akar serabut Glyccyrrhiza glabra pada
isolasi ini yang diisolasi adalah senyawa licoagrodin dan turunannya. Pada dasarnya
ekstrak methanol akar serabut tumbuhan G. glabra yang dipartisi antara air dan etil
asetat.Ekstrak etil asetat diteruskan untuk dipisahkan dengan menggunkan
kromatografi kolom dengan menggunakan silika gel dan selanjutkan dimurnikan
dengan menggunakan Fase-Normal HPLC untuk menghasilkan 5 jenis flavonoida
baru, licoagrodin, licoagrokalkone B, licoagrokalkone C, licoagrokalkone D ,
licoagroaurone dan 4 flavonoid yang dikenal lainnya ialah licoakalkone C. Lapisan
air dilanjutkan untuk dianalisa dengan kromatografi kolom Daion HP-20, yang dielusi
dengan menggunakan methanol. Eluate methanol dievaporasi vakum untuk
menghasilkan sebuah fraksi glikosida. Fraksi tersebut akan dianalisa dengan
kromatografi kolom ODS. (Yoshikawa,T.2000).

2.2.5. Sifat Kelarutan Flavonoida

Aglikon Flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa
fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat,
bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang
terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih(terganti), atau
suatu gula, flavonoida merupakan senyawa polar, dan seperti kata pepatah lama
mengatakan suatu golongan akan melarutkan golongannya sendiri maka
umumnya flavonoida larut cukupan dalam pelarut polar seperti etanol (EtOH),
methanol(MeOH),

butanol(BuOH),

aseton,

dimetilsulfoksida(DMSO),

dimetilformamida(DMF), air, dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida
(bentuk yang umum ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah
larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut diatas dengan air merupakan
pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti
isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih
mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.

Universitas Sumatera Utara

2.3. Teknik Pemisahan

Tujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang akan
ditentukan berad dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen
lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan :
1. Pemisahan Kimia
Pemisahan ini berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat
fisika
komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
2. Pemisahan Fisika
Pemisahan ini berdasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat
fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan.
(Muldja, 1995).

2.4. Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara 2 fase, satu dari fase-fase ini membentuk lapisan
stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang
merembes lewat.
Fase

stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fase yang

bergerak mungkin suatu cairan atau suatu fase gas. Cara-cara kromatografi dapat
digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam, yang dapat berupa zat padat atau
zat cair. Jika fase diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zat
cair atau gas maka ada empat macam system kromatografi yaitu :
1. Fase gerak cair-fase diam padat (kromatografi serapan)
a. Kromatografi Lapis Tipis
b. Kromatografi Penukar Ion
2. Fase gerak gas-fase diam padat, yakni kromatografi gas padat
3. Fase gerak cair-fase diam cair (kromatografi partisi), yakni kromatografi
kertas
4. Fase gerak gas-fase diam zat cair, yakni :
a. Kromatografi Gas-Cair
b. Kromatografi Kolom Kapiler

Universitas Sumatera Utara

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawasenyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam dalam
perbandingan yang sangat berbeda-beda dari suatu senyawa terhadap senyawa yang
lain. (Sastrohamidjojo, 1991).

2.4.1. Kromatografi Lapis Tipis

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Egon Stahl dengan
menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis.
KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi
partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera popular
karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang diperlukan sedikit,
murah, sederhana, waktu, analisis cepat dan daya pisah cukup baik. (Sudjadi, 1986)

2.4.1.1 Pembuatan Lapisan Tipis

Dalam pembuatan lapisan tipis digunkan plat-plat kaca yang memiliki ukuran 20 x 5
cm atau 20 x 20 cm, dan ukuran ini dianggap standart. Plat ini dicuci terlebih dahulu
dengan air dan detergen kemudian dikeringkan dengan aseton. Selanjutnya membuat
penyerap menjadi bubur dengan air, biasanya dalam perbandingan x gram penyerap
dan 2x ml air. Bubur diaduk dengan baik dan dibentangkan di atas plat kaca dengan
berbagai cara. Tebal standart adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal
(0,5 2,0 mm) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, dengan
menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm. Salah
satu keukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bila
kering.(Sastrohamidjojo, 1985)

Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalam

kromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut :

Universitas Sumatera Utara

1. Silika gel
Ada beberapa jenis silika gel, yaitu :
a. Silika gel G
Silika gel G adalah silika gel yang mengandung 13 % kalsium sulfat sebagai
perekat. Jenis silika gel ini biasanya mengandung ion logam, terutama ion besi.
Kandungan ion besi dapat dihilangkan dengan mengembangkan plat TLC silika gel G
dengan sstem pelarut metanol : asam HCl pekat 9 : 1.

b. Silika gel H
Perbedaan silika gel G dan silika gel H ialah, bahwa silika gel H tidak
menngandung perekat kalsium sulfat. Silika gel H dipakai untuk pemisahan yang
bersifat spesifik, terutama lipida netral.

c. Silika gel PF
Jenis silika gel ini diketemukan belakangan, yang dibuat sedemikian rupa
sehingga senyawa-senyawa organik terikat pada plat ini dapat mengadakan
fluoresensi. Oleh karena itu visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkan plat
yang telah dikembangkan di dalam ruangan gelap atau dengan sinar ultra violet yang
bergelombang pendek.

2. Alumina
Penggunaan alumina dalam TLC, yang semula diperkenalkan oleh peneliti dari
Cekoslowakia, tidak sesering silika gel. Sebenarnya alumina netral mempunyai
kemampuan untuk memisahkan bermacam-macam senyawa, seperti terpena, alkaloid,
steroid, dan senyawa-senyawa alisklik, alifatik, serta aromatik. Sebagai zat perekat
alumina tidak mengandung zat perekat, memepunyai

sifat alkalis dan dapat

digunakan baik tanpa maupun dengan aktivasi.

Universitas Sumatera Utara

3. Kieselguhr
Kieselguhr merupakan adsorben yang lebih lemah dari silika gel dan alumina,
oleh karena itu lebih cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa polar. (Adnan, M.,
1997)

Nilai utama KLT pada penelitian flavonoid ialah sebagai cara analisis cepat
yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, KLT memiliki peranan
penting dalam metoda pemisahan dan isolasi yaitu :
a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom
c. Menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi
d. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi
e. Isolasi flavonoida murni skala kecil.

2.4.2. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom atau tabung merupakan salah satu jenis pemisahan dengan
menggunakan prinsip aliran zat cair (pelarut) yang dipengaruhi oleh gaya tarik bumi
(gravitasi bumi) atau dikenal dengan sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari
kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur
aliran pelarut.(Gritter, 1991) . Pada isolasi flavonoida sebaiknya digunakan kolom
skala besar karena hal ini dapat meningkatkan proses pemisahan yang baik. Pada
dasarnya cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) di atas
kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti selulose, silika, atau poliamida),
dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok.
Kolom yang digunakan umumnya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan keran
pada salah satu ujung, dan ukurannya sedemikian rupa sehingga nisbah garis tengah
terhadap panjang kolom dalam rentang 1:10 sampai 1:30. Kemasan kolom harus
dipilih dari jenis yang dipasarkan khusus untuk kromatografi kolom karena ukuran
partikel penting. Jika ukuran partikel terlalu kecil, laju aliran pengelusi mungkin
terlalu lambat, sedangkan bila terlalu besar, mungkin pemisahan komponen secara

Universitas Sumatera Utara

kromatografi tidak baik. Kemasan niaga biasanya dalam ukuran 100-300mesh.

(Markham, 1988)

2.4.2.1. Pengisian Kolom

Pengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam.Setelah adsorben

dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan menggunakan
vibrator atau dengan plunger (pemadat). Selain itu dapat juga dikerjakan dengan
memasukkan adsorben dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya dibiarkan
mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam akan menghasilkan rongga-rongga
di tengah-tengah kolom. Cara untuk mengatasi masalah ini adalah dengan
mengadakan back fushing , sehingga terjadi pengadukan, yang seterusnya dibiarkan
lagi mengendap. Pada bagian bawah (dasar) dan atas dari isian kolom diberi wol kaca
(glass wool) atau sintered glass disc untuk menyangga isian. Bila kolom telah diberi
bahan isian, permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah permukaan bahan
isian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya gelembung udara
masuk ke kolom. (Adnan,M., 1997)

2.4.2.2. Memilih Kemasan Kolom

Kemasan kolom yang tersedia sangatlah banyak dan senarai di bawah memberikan
pedoman mengenai pemakaian dan cirri sejumlah jenis kemasan yang berguna.
Selulosa
Pemakaian selulosa serupa dengan kertas, yaitu ideal untuk memisahkan
glikosida yang satu dengan yang lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon,
serta untuk memisahkan aglikon yang kurang polar. Kapasitasnya rendah.
Silika
Bahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang kurang polar,
misalnya isoflavon, flavanon, metal flavon, dan flavanol. Kapasitas
pertengahan.

Universitas Sumatera Utara

 Poliamida
Bahan ini cocok untuk memisahkan semua flavonoid, meski juga ideal untuk
memisahkan glikosida. Merupakan pelengkap untuk KKt karena melibatkan
penyerap dan pengembang yang berlainan. Sebelum dipakai harus dicuci
dengan MeOH dan H2O agar poliamida yang larut tidak mencemari semua
fraksi. Kapasitas tinggi.
Gel sephadex (deret G)
Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan pada
ukuran molekul (bila digunkan pelarut air); molekul besar terlebih dahulu.
Sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobot
molekulnya. Kapasitasnya lebih besar karena ukurannya lebih teratur.

2.4.3. Kromatografi Preparatif

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan yang paling

murah dan memakai peralatan yang paling dasar ialah kromatografi lapis titpis
preparatif (KLTP). Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah
gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. KLTP bersama-sama
dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi
mengenai isolasi bahan alam, terutama dari laboratorium yang tidak dilengkapi
dengan cara pemisahan modern. Akan tetapi, seperti yang akan diterangkan kemudian,
tertdapat banyak masalah pada KLTP.
Penyerap
Dalam KLTP digunakan ketebalan adsorbent yang paling sering dipakai yaitu
0,5-2 mm. ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.
Peneyerap yang paling umum ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan
campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil.
Penotolan Cuplikan

Universitas Sumatera Utara

Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP.
Pelarut yang baik ialah pelarut atsiri/organik (heksana, diklorometana, etil
asetat), karena jika pelarut kurang atsiri maka akan terjadi pelebaran pita.
Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10%.
Pemilihan Fase Gerak
Pilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai
KLT analitik. Karena ukuran partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yang
dipakai pada plat KLT dapat dipakai langsung pada KLTP. Pengembangan
pelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung
beberapa plat.
Isolasi senyawa yang sudah terpisah
Kebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang
membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang
dipisahkan menyerap sinar UV. Akan tetapi, beberapa indikator menimbulkan
masalah yaitu bereaksi dengan asam kadang-kadang bahakan dengan asam
asetat.
Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa pilihan :
a). Menyemprot dengan air (misalnya saponin)
b). Menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi dengan
pereaksi semprot
c). Menambahkan senyawa pembanding. (Hostettman,K.,1995)

2.4.4. Harga Rf ( Retension factor)

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik
dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna. Lazimnya identifikasi
menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila
dibandingkan pada kertas.

Universitas Sumatera Utara

Dapat didefenisikan sbb :

Harga Rf =

Faktor-faktor yang memepengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang
juga mempengaruhi harga Rf :

1). Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan

2). Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya
3). Tebal keraataan dari lapisan penyerap
4). Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa gerak
5). Derajat kejenuhan dari uap
6). Jumlah cuplikan yang digunakan
7). Suhu
8). Kesetimbangan
9). Teknik percobaan (Sastrohamidjojo, 1985)

2.4.5. Ekstraksi
Ekstraksi dapat dilakukan pada bahan tumbuhan yang akan diisolasi. Umumnya kita
perlu membunuh jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atau
hidrolisis. Mencelupkan jaringan daun segar atau bunga, bila perlu dipotong-potong,.
Kedalam etanol mendidih adalah salah satu cara yang baik untuk mencapai tujuan.
Selanjutnya, bahan dapat dimaserasi dalam suatu pelumat, lalu disaring. Bila
mengisolasi senyawa dari jaringan hijau, keberhasilan ekstraksi dengan alkohol
berkaitan langsung dengan seberapa jauh klorofil tertarik oleh pelarut itu. Bila ampas
jaringan, pada ekstraksi ulang, sama sekali tak berwarna hijau lagi, dapat dianggap
semua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi. (Harborne, 1987)

Universitas Sumatera Utara

2.5. Teknik Spektroskopi

Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamati
tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam
instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer.
Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut
sebagai\ spektrometer. Apabila spektrometer

tersebut dilengkapi dengan detektor

yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer. (Muldja, 1955)

Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugus

fungsi dalam suatu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi
tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi
yang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen.
Kombinasinya dan data yang ada kadang-kadang menentukan struktur yang lengkap
dari molekulnya yang tidak diketahui. (Pavia, 1979)

2.5.1. Spektroskopi Ultra Violet-Visible

Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan

intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar
ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan
electron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis
biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan.
Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak
berada pada panjang gelombang 400-800 nm. (Dachriyanus, 2004)

Spektrum flavonoida

bisanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut

methanol (MeOH, AR atau yang setara) atau etanol (EtOH), meski perlu diingat
bahwa spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan. Spektrum khas
terdiri atas dua maksimal pada rentang 240 285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I).
Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memebrikan informasi

Universitas Sumatera Utara

yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum
tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon,
dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron,
dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi.

Tabel Rentangan serapan spektrum UV-tampak flavonoida

Pita II (nm)
250-280
250-280
250-280
245-275
275-295
230-270
(kekuatan rendah)
230-270
(kekuatan rendah)
270-280

Pita I (nm)

Jenis flavonoida

310-350
Flavon
330-360
Flavonol (3-OH tersubstitusi)
350-385
Flavonol(3-OH bebas)
310-330 bahu kira- Isoflavon
kira
Isoflavon (5-deoksi-6,7-deoksigenasi)
320 puncak
Flavanon dan dihidroflavanol
300-330 bahu
Khalkon
340-390
Auron
380-430
Antosianidin dan antosianin
465-560
(Markham, 1988)

Dibawah ini daftar beberapa pengaruh substituent untuk senyawa aromatik. Hal ini
dapat menjadi catatan bahwa ion phenoxide (-O-), yang dapat dijunpai dalam larutan
basa senyawa fenol, dimana dapat menyerap panjang gelombang yang lebih panjang
dari pada senyawa induk fenol (-OH). Secara umum menyumbangkan elektron dan
substituent pasangan sunyi (lone pair) yang dapat menyebabkan pergeseran kimia
berwarna merah dan penyerapan yang lebih tinggi. Senyawa kompleks memiliki
pergeseran kimia yang meningkat saat ada sejumlah lebih substituent yang terikat.

Universitas Sumatera Utara

Tabel. Absorbsi max untuk beberapa monosubstitusi benzene Ph-R (methanol :

air)
R

maksimum (nm)

-H

204 254

-CH3

207 261

-Cl

210 264

-OH

211 270

-OCH3

217 269

-CO2-

224 271

-COOH

230 280

-NH2

230 280

-O-

235 287
(Kealey,D. 2002)

Absorbsi radiasi UV oleh senyawa aromatik yang terdiri dari cincin benzene terpadu
bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambah banyaknya
cincin itu karena bertambahnya konjugasi dan membesarnya stabilisasi-resonansi dari
keadaan eksitasi. Daerah yang paling berguna dari spektrum UV adalah daerah dengan
panjang gelombang di atas 200 nm. Dalam absorbsi yang ditimbulkan oleh senyawa
aromatik dihasilkan warna dalam spektrum tampak. Warna merupakan hasil dari suatu
perangkat kompleks (dari) respons faali maupun psikologis terhadap panjang
gelombang cahaya antara 400-750 nm, yang jatuh pada selaput jala.
Tabel. Warna dalam spektrum tampak
maks (nm)

Warna

Warna komplementer(substraksi)

400-424

Ungu

Hijau-kuning

424-491

Biru

Kuning

491-570

Hijau

Merah

570-585

Kuning

Biru

585-647

Jingga

Hijau-biru

647-700

Merah

Hijau
(Fessenden,F. 1986)

Universitas Sumatera Utara

Tabel Pita absorbsi UV dari flavonoida

No.

Jenis Flavonoida

Struktur Umum

Pita II

Pita I

3'
2'
1
8

4'

'

5'

6'

1.

Flavon

10

5
O

240-285

304-350

240-285

352-390

270-295

300-350

270-295

300-320

220-270

340-390

220-270

370-430

270-280

465-550

OH

2.

Flavonol

3.

Flavanon

R2

OH

4.

Dihidroflavonol

5.

Khalkon

R1

O
HC

6.

Auron

7.

Antosianidin

OH

(Sujata,V., 2005)

Universitas Sumatera Utara

2.5.2. Spektrofotometri Infra Merah (FT-IR)

Radiasi infra merah ditemukan oleh Sir William Hercshel pada tahun 1880, yang
melaporkan penemuannya kepada Royal Society. Pada waktu itu para saintis belum
memahami secara jelas keadaan transisi. Daerah inframerah terletak antara spektrum
electromagnetic cahaya tampak dan spektrum radio; yakni antara 4.000-400 cm-1.
Mulai tahun 1903 William dan N. Coblentz mahasiswa di Cornel University
memperbaiki teknik-teknik percobaan dan menyusun sederetan spectra serapan zat
murni.

a. Ada beberapa daerah penyerapan terpenting dalam Spektrum Infra Merah :

1. Daerah vibrasi regang hidrogen : 3.700-2.700 cm-1.

3.700 3.100 cm-1, serapan oleh vibrasi regang O-H dan N-H. Serapan
oleh vibrasi lentur

O-H biasanya terdapat pada bilangan gelombang

lebih besar dan pita serapannya dalam spektrum sering lebih lebar dari
pita serapan N-H.

3.200 2.850 cm-1, daerah vibrasi regang C-H alifatik.

2. Daerah vibrasi regang ikatan ganda tiga, 2.700 1.850 cm-1

Gugus fungsional yang menyerap di daerah ini terbatas, karena itu ada atau
tidaknya serapan tersebut dalam suatu molekul dapat dilihat.

3. Daerah ikatan ganda dua, 1.950 1.550 cm-1

Vibrasi regang untuk ikatan ganda dua, yaitu :

- C = C , - C = N -, 1690 1600 cm-1

1.650 1.450 cm-1, puncak serapan dalam daerah ini memberi keterangan
yang penting mengenai cincin aromatik.

Universitas Sumatera Utara

4. Daerah sidik jari finger print, 1.500 700 cm-1

Beberapa frekuensi gugusan (group frequency) juga bisa ditemukan di daerah sidik
jari ini : C-O-C (vibrasi regang) dalam eter, ester kira-kira 1.200 cm-1 dan vibrasi
regang C-Cl pada 700 800 cm-1 . Pada bilangan gelombang dibawah 1.200 cm-1
terdapat puncak-puncak serapan beberapa gugusan anorganik seperti : sulfat, fosfat,
nitrat dan karbonat.

b. Vibrasi kerangka suatu molekul (skeletal vibrations)

Vibrasi kerangka terletak di derah spektrum lebih dari 1.500 cm-1. Kelompikkelompok vibrasi di daerah spektrum kecil dari 1.500 cm-1 adalah :
a. Vibrasi regang (stretching) ikatan ganda yang tidak mengandung atom C
b. Vibrasi regang ikatan tunggal
c. Vibrasi-vibrasi lentur (bending) (Noerdin, 1985)
2.5.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Spektrometri Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan

alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan
informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam. Struktur NMR memberikan
informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam
setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom
hydrogen.(Cresswell,1982)

Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua

proton-proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa
kadang-kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa
memberikan

penaikan

menjadi

puncak

absorbsi

tunggal

dalam

spektrum

NMR.(Bernasconi,1995)

Senyawa yang paling lazim dan paling berguna dipakai sebagai acuan adalah
tetrametilsilana (TMS). Senyawa ini mempunyai beberapa kelebihan; lamban secara

Universitas Sumatera Utara

kimia, isotop magnet, serta larut dalam kebanyakan pelarut organik; TMS meberikan
puncak serapan tajam tunggal serta menyerap pada medan lebih tinggi daripada semua
proton organik. (Silverstein, 1974).

CH3
H3C

Si

CH3

CH3
Pada

spektormetri

NMR

integrasi

sangat

penting.

Harga

integrasi

menunjukkan daerah atau luas puncak dari tiap-tiap proton. Sedangkan luas daerah
atau luas puncak tersebut sesuai dengan jumlah proton. Dengan demikian
perbandingan tiap integrasi proton sama dengan perbandingan jumlah proton dalam
molekul. (Muldja, 1955)
Di dalam medan magnet, perputaran elektron-elektron valensi dari proton
menghasilkan medan magnet yang melawan medan magnet yang digunakan. Hingga
setiap proton dalam molekul dilindungi dari medan magnet yang digunakan dan
bahwa besarnya perlindungan ini tergantung pada kerapatan elektron yang
mengelilingnya. Makin besar kerapatan elektron yang mengelilingi inti, maka makin
besar pula medan yang dihasilkan yang melawan medan yang digunakan. Akibat
secara keseluruhan adalah inti/proton merasakan adanya pengurangan medan yang
mengenainya. (Sastrohamdijojo, 1991)

Universitas Sumatera Utara