KRIOPRESERVASI DALAM TEKNOLOGI REPRODUKSI BUATAN

Oleh :

Harry Kurniawan Gondo

Program Pendidikan Dokter Spesialis I Obstetri & Ginekologi

Fakultas Kedokteran Udayana, Denpasar

ABSTRAK

Teknologi Reproduksi Bantuan (TRB) memegang peranan penting dalam penanganan infertilitas pada masa kini.
Keberhasilan IVF (In Vitro Fertilization) tahun 1978 pada awalnya ditujukan untuk indikasi kelainan pada pihak wanita.
Sekitar tahun 80-an, IVF dicoba diterapkan pada infertilitas pria tetapi hasilnya masih rendah dan memiliki
keterbatasan. Baru pada tahun 1992 dengan dipublikasikannya kehamilan pertama dengan teknik ICSI (Intra Cytoplasmic
Sperm Injection), terjadi peningkatan angka keberhasilan yang sangat nyata pada penanganan infertilitas pria berat.
Penyimpanan embrio dalam bentuk beku sebagai salah satu bank genetika merupakan upaya penyimpanan embrio
yang aman untuk bisa dimanfaatkan dimasa datang atau untuk keperluan mendadak. Hal ini sangat diperlukan
mengingat bahwa gamet mempunyai daya tahan hidup yang relatif singkat.

ABSTRACT

Assisted Reproduction Technique (ART) play a part important in handling of infertilitas is present day. Efficacy of IVF (In Vitro
Fertilization) year 1978 initially addressed for the indication of disparity on the side of woman. Around year 80-an, IVF tried to be to be
applied man infertilitas but its result still lower and have limitation. New in the year 1992 publicized of first pregnancy with technique of
ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injections), happened the make of very real efficacy number handling of heavy man infertilitas. Depository
embryo in the form of frost as one of bank of genetika represent depository effort peaceful embryo to be able to exploited a period of
coming or for is sudden. this matter very needed to see that gamet have life endurance which relative shorten.

Kata Kunci : TRB, Krioprservasi, Gamet

 PENDAHULUAN
Teknologi kriopreservasi oosit, sperma dan
embrio banyak dikembangkan pada berbagai spesies
hewan dan manusia bersamaan dengan kemajuan pesat
teknologi produksi embrio baik secara in vivo maupun
in vitro. Walaupun viabilitas sperma, oosit dan embrio
segar lebih baik daripada setelah pembekuan, namun
teknologi ini berkembang pesat untuk menangani
ketersediaan gamet (sperma dan oosit) pada saat in vitro
fertilisasi serta kelebihan embrio hasil produksi in vivo
maupun in vitro. Teknologi ini memungkinkan
penyimpanan oosit dalam jangka waktu yang relatif
lama sehingga bisa dimanfaatkan dalam kondisi
tertentu.
Pada program ART (Assisted Reproduction
Technique), pasien dengan kondisi Policystic Ovary (PCO)
dimana tidak memungkinkan dilakukan transfer
embrio (TE) pada siklus yang sedang berjalan, maka
strategi pembekuan oosit setelah fertilisasi (tahap 2PN)
maupun pembekuan embrio tahap pembelahan
(cleavage) dan blastosis menjadi solusi untuk dilakukan
transfer embrio dimasa datang pada kondisi yang lebih
baik. Sampai saat ini teknologi pembekuan embrio
telah menjadi program rutin pada banyak klinik
infertilitas untuk kepentingan transfer embrio
dikemudian hari tanpa menimbulkan pengaruh negatif
terhadap bayi yang dilahirkan.
Penyimpanan embrio dalam bentuk beku sebagai
salah satu bank genetika merupakan upaya
METODE KRIOPRESERVASI
Terdapat lima langkah penting pada prosedur
penyimpanan dengan suhu dingin ini :
1. Paparan awal dengan cryoprotectant, bahan yang
digunakan untuk mengurangi kerusakan seluler
yang disebabkan karena kristalisasi air.
2. Mendinginkan suhu sampai dibawah 0C.
3. Penyimpanan
4. Pencairan kembali
5. Dilusi dan menyingkirkan cryoprotectan,
mengembalikan fisiologi dari microenvironment,
sehingga membuat oosit ini mampu
dikembangkan lebih jauh.
Momen paling kritis untuk mempertahankan
kehidupan seluler adalah pada fase awal dari
pembekuan dengan suhu yang sangat rendah dan
pengembalian akhir ke kondisi fisiologis awal.
Apabila suhu rendah yang cukup telah dicapai
(normalnya -196C, suhu dari nitrogen cair),
penyimpanan, bahkan untuk periode waktu yang
cukup lama, tidak akan memberikan pengaruh apapun
pada survival rate dari oosit tersebut.
Pada suhu ini, faktanya, tidak tersedia cukup
energi untuk kebanyakan reaksi fisiologis dan molekul
air akan terbentuk dalam struktur kristal. Kerusakan
dari DNA yang disebabkan karena radiasi kosmik
merupakan satu-satunya kerusakan gamet dan embrio
penyimpanan embrio yang aman untuk bisa
dimanfaatkan dimasa datang atau untuk keperluan
mendadak. Hal ini sangat diperlukan mengingat bahwa
gamet mempunyai daya tahan hidup yang relatif
singkat.
Solusi untuk masalah ini adalah pengawetan gamet
wanita dalam suhu dingin. Sterilitas iatrogenik yang
timbul setelah pemberian kemoterapi atau radioterapi
pada kondisi neoplasma dapat dihindari dengan
pengawetan dari oosit, sama seperti penyimpanan
sperma dalam suhu dingin. Hal ini disebabkan karena
gambaran biologis dari oosit, dan telah muncul
sejumlah pertanyaan mengenai induksi dari aneuploidy
setelah gamet terpapar dengan cryoprotectant dan
pembekuan serta proses pencairan. Oosit, faktanya,
dihambat saat ovulasi pada metafase dari pembelahan
meiosis kedua, dimana 23 kromosom dikromatid
terikat dengan mikrotubulus dari benang meiosis. Pada
fase ini, dimana oosit amat peka terhadap perubahan
suhu dan akhirnya mengalami depolimerisasi dari
benang mikrotubulus yang disebabkan karena
cryoprotectant atau es kristal yang terbentuk selama
proses pembekuan dan pencairan, pemisahan normal
dari kromatid pada saat fertilisasi dapat mengalami
kerusakan, maka dari itu menyebabkan aneuploidy
setelah pengeluaran dari badan polar kedua.
yang disimpan pada suhu demikian. Ketika oosit
didinginkan pada suhu diantara -5C sampai -15C,
pembentukan es pertama kali diinduksi oleh media
ekstraseluler sebagai proses yang dinamakan dengan
seeding. Saat suhu menurun, maka jumlah es akan
meningkat dan terlarut pada media ekstraseluler.
Hasilnya adalah pembentukan gradien osmotik.
Sebagai hasil dari gradien ini, air akan tertarik dari
sitoplasma ke media ekstraseluler, dan sel akan
menjadi lebih kecil. Apabila proses ini berjalan cukup
lambat, maka aliran air keluar dari sel akan
menurunkan kemungkinan nukleasi es dalam sel, pada
suhu sekitar -15C. Untuk sel dengan rasio surface atau
volume yang rendah, seperti gamet, diperlukan suhu
pembekuan yang rendah agar didapatkan aliran air
yang cukup untuk mengalir keluar dari sel. Dengan
cara seperti ini, kristal es intraseluler yang terbentuk
akan menjadi cukup sedikit untuk menimbulkan
kerusakan pada komponen intraseluler. Perlu
ditekankan, bagaimanapun juga, bahwa peningkatan
angka pembekuan akan menurunkan survival rate dari
semua jenis sel.
Angka pembekuan yang optimal bergantung pada
banyak variabel : komponen air sitosolik, perubahan
permeabilitas membran, permukaan membran, dan
suhu. Komponen air intraseluler, disamping
menimbulkan kerusakan mekanik pada saat
pembekuan, juga akan menyebabkan kerusakan bahan
pada saat pencairan kembali, sebagai akibat dari
peningkatan volume selama proses ini berlangsung.
Apabila proses pencairan berlangsung lambat, maka
survival rate akan menurun karena kristal yang
terbentuk pada sitosol akan memiliki waktu yang
cukup untuk berkembang, dan maka dari itu akan
menimbulkan kerusakan pada struktur intraseluler.
Rekristalisasi dan shok osmotik, yang terjadi selama
proses pencairan dari oosit yang beku, akan
menurunkan suvival rate secara efektif.
Rekristalisasi adalah proses dimana air kembali
masuk ke dalam sel menjadi keadaan yang padat
disekitar kristal es yang telah terbentuk sebelumnya
pada sitosol. Ketika suhu meningkat menjadi -40C,
beberapa molekul air akan kembali pada sepanjang
jalur yang dilalui selama proses pembekuan, maka dari
itu molekul air akan kembali ke sitosol dan
membentuk kembali ikatan hidrogen dengan kristal es
yang telah ada dan meningkatkan dimensi sel secara
bermakna. Baik proses pencairan maupun proses
pembekuan kemungkinan akan mempengaruhi
berulangnya fenomena ini. Dehidrasi sel kemungkinan
tidak memadai setelah pembekuan cepat,
menimbulkan pembentukan masa intraseluler yang
VARIASI TEKNIK KRIOPRESERVASI
Banyak tehnik pengawetan suhu dingin yang telah
diterapkan pada oosit manusia. Penggunaan gliserol,
yang secara umum dianggap kurang toksik daripada
bahan cryoprotectant. Peranan dari equilibration oosit baik
pada Me2SO (15 oosit) atau gliserol (13 oosit) telah
dibandingkan. Setelah diawetkan dengan suhu dingin,
oosit kemudian di-inseminasi-kan, namun hanya ada
satu oosit yang membelah menjadi stadium dua sel
setelah diawetkan dengan suhu dingin pada Me2SO
dan tidak ditemukan pembelahan pada oosit yang
diawetkan pada suhu dingin dengan gliserol atau yang
terpapar dengan gliserol tanpa pendinginan.
Pembuahan dari oosit segar didapatkan setelah
pendinginan lambat pada Me2SO dan vetrification
selanjutnya yang dinamakan dengan solusi VS1, yang
mengandung 2.62 mol/l Me2SO, 2.62 mol/l
acetamide, 1.3 mol/l PrOH, dan 6% polyethlene
glycol, dan telah berhasil digunakan untuk vetrification
dari embrio murine. Hasil yang bervariasi telah
besar apabila proses pencairan berlangsung sangat
lambat. Pembentukan es intraseluler dapat dicegah
apabila pencairan cepat terjadi di inti nukleasi dari es.
Shock osmotik kemungkinan diperlukan selama proses
pencairan cepat. Faktanya, apabila cryoprotectant yang
diletakkan sebelumnya pada sel tidak berdifusi cukup
cepat untuk mencegah masuknya air, maka oosit akan
membengkak dan akhirnya pecah. Pada fase ini, dua
kebutuhan yang saling berlawanan harus dihadapi :
pada satu sisi, waktu kontak antara sel dengan bahan
cryoprotectant pada suhu kamar harus dikurangi sampai
tingkat yang paling minimal karena cryoprotectant akan
memicu sitotoksik yang bergantung pada suhu; pada
sisi lainnya, proses dilusi dari cryoprotectant pada sitosol
harus dikerjakan dengan amat lambat untuk mencegah
reduksi osmotik ekstraseluler yang berlebihan, yang
akan menyebabkan masuknya air dalam jumlah besar
ke dalam sel yang akan mengakibatkan lisisnya sel.
Keberhasilan proses pembekuan tergantung dari
jenis embrio melalui upaya pemilihan media
pembekuan (krioprotektan) yang tepat, pengaturan suhu
baik saat pendinginan (cooling), penyimpanan (storage),
dan pencairan (warming) dan manipulasi embrio sebagai
upaya pengeluaran air sebanyak mungkin dari dalam
embrio untuk menghindari terbentuknya kristal es.
didapatkan dari pengawetan oosit murine pada suhu
dingin dengan menggunakan campuran ini, dengan
malformasi fetus telah dilaporkan setelah terpapar
dengan solusi vetrification dengan atau tanpa
pendinginan. Oosit manusia terpapar dengan VS1
untuk periode waktu yang lebih singkat dibandingkan
dengan yang digunakan untuk penelitian embrio yang
sebenarnya dan sukrosa digunakan untuk membantu
agar bahan cryoprotectant dapat berdilusi. Hendaknya
dicatat bahwa komponen acetamide dari VS1
merupakan bahan karsinogen bagi manusia.
Walaupun semua kelahiran hidup yang dicapai saat
ini menggunakan Me2SO sebagai bahan cryoprotectant,
namun perhatian beralih pada metode pendinginan
lambat dalam PrOH yang mengikuti penggunaan
PrOH untuk pembekuan embrio.
Beberapa keberhasilan telah dilaporkan
belakangan ini seiring dengan vetrification oosit manusia.
PENYIMPANAN OOSIT IMMATURE
DENGAN SUHU DINGIN
Masalah utama dari pengawetan oosit matur pada
suhu dingin berasal dari sensitifitas gelendong
mikrotubuler terhadap suhu dingin dan bahan
cryoprotectant, satu cara untuk mengatasi masalah ini
adalah dengan menyimpan oosit immatur pada
stadium germinal vesikel dimana tidak dijumpai adanya
gelendong mikrotubuler. Penggunaan oosit immatur
juga berarti bahwa pasien akan menerima rangsangan
hormonal yang lebih sedikit untuk menghasilkan oosit
atau oosit mungkin akan dihasilkan tanpa rangsangan
apapun. Oosit immatur yang mampu melakukan
pembelahan meiosis dapat diperoleh transvaginal,
walaupun prosedur ini memerlukan modifikasi dari
tehnik pengambilan oosit matur.
Penyimpanan oosit manusia yang immatur pada
suhu dingin dari pasien yang mendapat rangsangan
hormonal telah menghasilkan pemulihan dan
pematangan menjadi metafase II. Oosit manusia yang
immatur yang diperoleh dari ovarium yang tidak
dirangsang yang didinginkan secara cepat dengan 3.5
VARIABEL YANG TERKAIT DENGAN OOSIT
Ukuran dari oosit mempengaruhi survival rate
secara keseluruhan, kemungkinan pembentukan es
intraseluler juga akan bergantung pada ukuran oosit
ini. Sperma manusia merupakan contoh yang baik
untuk menjelaskan peranan volume sitoplasmik
terhadap survival rate pada penyimpanan dengan suhu
dingin ini; gamet laki-laki berukuran 180 kali lebih kecil
daripada gamet wanita, dan survival ratenya jauh lebih
tinggi.
Kualitas oosit yang optimal sangat penting untuk
menjamin survival rate selama proses pembekuan.
Seringkali, sejumlah oosit dengan kualitas yang rendah
dibekukan sehingga memberikan hasil yang rendah
pada survival rate. Beberapa peneliti berdebat
mengenai perlu atau tidaknya mempertahankan
kumulus ooporus untuk meningkatkan survival rate.
Tidak adanya kumulus ooporus ini akan memudahkan
penetrasi dari bahan cryoprotectant untuk masuk ke
dalam sitoplasma. Pentingnya kumulus yang akan
meningkatkan seluler survival pada akhir dari proses
penyimpanan dengan suhu dingin. Keberadaan
kumulus akan berfungsi sebagai lapisan pelindung
terhadap perubahan osmotik dan stres yang tiba-tiba
yang diakibatkan karena perubahan konsentrasi dan
dilusi dari cryoprotectant selama proses equilibrum dan
pemindahan setelah proses pencairan. Semua oosit
hendaknya dibekukan segera setelah dipanen, antara 38
sampai 40 jam setelah munculnya human chorionic
gonadotrophin (hCG). Oosit yang lebih tua, dikultur
terlebih dahulu secara in vitro sebelum dibekukan,
yang menghasilkan penurunan fertilisasi, dan
peningkatan fertilisasi anomalous dan polyploidy. Semua
kehamilan yang didapatkan dari oosit yang dibekukan
mol/l Me2SO ditambah dengan 0.5 mol/l sukrosa
ditemukan mampu untuk mengalami kematangan
meiosis setelah pencairan namun dijumpai adanya
kondensasi kromosom prematur dan sebagian pada
hampir setengah dari oosit yang ditangani dimana
fenomena demikian tidak pernah dijumpai pada oosit
murine.
Kerugian dari pembekuan oosit immatur pada
suhu dingin termasuk masih diperlukan prosedur
pematangan tambahan. Walaupun pematangan oosit
invitro seringkali berhasil pada beberapa spesies
binatang, namun tidak demikian halnya pada oosit
manusia. Sejauh ini hanya sedikit kehamilan yang
berhasil dicapai yang berasal dari oosit immatur.
Disamping itu immatur oosit harus disimpan bersama
dengan sel kumulus yang intak karena sel ini sangat
diperlukan agar pematangan bisa terjadi, pada kasus
yang demikian protokol penyimpanan pada suhu
dingin nampaknya perlu dilakukan kompromi antara
protokol terbaik untuk oosit dan untuk sel kumulus.
berasal dari oosit metafase II. Faktanya, oosit yang
matur pada saat diambil memiliki survival dan
fertilisasi rate yang lebih tinggi. Penyimpanan oosit
dengan suhu dingin pada profase I dianggap sebagai
pendekatan alternatif yang lain dalam usaha untuk
menyimpan gamet wanita. Pada oosit ini, meiosis
ditahan, dan kromosom berada di dalam nukleus, tidak
berjajar di sepanjang spindle. Lebih jauh, pada stadium
ini, sel berukuran kecil dan tidak berdeferensiasi,
kurang akan zona pellucida, dan relatif diam dari
metabolisme.
Pada pasien yang ingin mempertahankan potensi
reproduksinya walaupun sedang menjalani kemoterapi
atau radioterapi atau telah menjalani ovariektomi,
mungkin akan mendapat keuntungan dari tehnik ini
dikombinasi dengan IVF. Tehnik pembekuan yang
baru untuk menyimpan lapisan tipis dari parenkim
ovarium, kortek ovarium kaya akan folikel pada
berbagai macam tingkatan kematangan, khususnya
folikel primordial. Telah menjadi mungkin untuk
menyimpan lapisan dari kortek ovarium untuk periode
yang bervariasi dari 24 jam sampai lima minggu
dengan menggunakan dua protokol pembekuan yang
berbeda (DMSO 1,5 M+ PROH 1,5 M+ Sukrose
0,1M). Air dengan suhu 37C digunakan pada kedua
kasus segera menyelesaikan proses pencairan. Tehnik
penyimpanan dengan suhu dingin dan transplantasi ini
masih diperlukan, hasil yang didapatkan cukup
memuaskan, dan penyimpanan jaringan ovarium
disarankan sebagai metode yang berlaku untuk
mempertahankan fertilitas pada kasus tertentu. Apabila
autograft ortotopik cukup memadai untuk menciptakan
sebuah siklus menstruasi ovulatori, maka kebutuhan
 akan induksi ovulasi dan fertilisasi in vitro akan tidak
dibutuhkan lagi. Pasien anak-anak juga akan
diuntungkan dengan metode ini. Faktanya, kebanyakan
folikel primordial dan keadaan ovarium yang relatif
VARIABEL TEKNIK
Krioprotektan
Cryoprotectant adalah bahan yang memiliki
komposisi bahan kimia yang berbeda. Mereka memiliki
kelarutan air yang cukup tinggi yang dikaitkan dengan
toksisitas, yang proporsional secara langsung dengan
konsentrasi dan suhu. Peranan ini adalah untuk 8.
melindungi sel dari kerusakan, yang dikenal dengan
cold shock, yang mungkin terjadi selama proses 9.
pembekuan, penyimpanan, dan pencairan kembali. 10.
Cryoprotectant dibagi menjadi 2 katagori menurut
kemampuannya dalam menembus sel :
6. Krioprotektan yang dapat masuk kedalam sel (permeable
cryoprotectants) atau agen intraseluler, misalnya :
glycerol, dimethylsulfoxide (DMSO), ethylene
glycol, propanediol, diethylene glycol.
7. Krioprotektan yang tidak dapat masuk kedalam sel (non
permeable cryoprotectants) atau agen ekstraseluler,
DMSO dan Gliserol
Penggunaan glycerol sebagai krioprotektan
pertama dalam bidang kriopreservasi ditemukan secara
kebetulan pada tahun 1948 karena kesalahan
pemberian label pada bahan atau media pembekuan
sperma unggas. Sejak temuan tersebut keberhasilan
Propanediol (PROH)
PROH telah digunakan pada sebagian besar
penyimpanan blastosit dan pre-embrio dengan suhu
dingin baik pada manusia maupun spesies lainnya.
Pada kombinasi dengan agen lainnya yang
menurunkan toksisitas dan kekuatan osmotik, PROH
Sukrose
Sukrose seringkali digunakan bersama dengan
bahan cryoprotectant yang lain. Bahan ini tidak mampu
menembus membran sel, dan keberadaannya pada
media ekstraseluler akan menimbulkan efek
pengeluaran osmotik yang bermakna. Sukrose
merupakan bahan pelindung selama fase dilusi atau
setelah pencairan cepat, ketika sel mulai mengalami
rehidrasi dan membengkak.
Resiko ini dapat ditekan dengan memindahkan
cryoprotectant intraseluler (misal, PROH) pada langkah
dilusi (1,5 ; 1,0 ; 0,25M) dengan tujuan untuk
mengurangi perluasan dari sembab seluler. Suatu
metode alternatif dan lebih cepat untuk
menghilangkan cryoprotectant yang permeabel berkaitan
dengan penambahan dari molekul yang non
permeabel, seperti sukrosa, ke dalam larutan pencair.
Konsentrasi ekstraseluler yang meningkat dari
molekul ini menyeimbangkan konsentrasi intraseluler
cryoprotectant yang tinggi, menguragi perbedaan
stabil pada masa prepubertas akan meningkatkan
peluang keberhasilan, dan pada beberapa kasus,
penyimpanan jaringan ovarium merupakan pilihan
untuk mempertahankan fertilitas yang telah ada.
misalnya : sucrose, raffinose, protein, lipoprotein,
kuning telur dan serum.
Secara biokimia, dibedakan 3 kelas bahan dari
cryoprotectant :
Alkohol (methanol, ethanol, propanol, 1,2
propanediol (PROH), gliserol),
Gula (glukosa, laktosa, sukrose, strach)
Dimetilsulfoksida (DMSO).
Krioprotektan merupakan komponen utama dalam
proses pembekuan, namun demikian hampir semua
jenis krioprotektan bersifat toksik. Ketepatan dalam
menentukan jenis krioprotektan dan waktu ekuilibrasi
sebelum embrio dibekukan akan menentukan
keberhasilan pembekuan embrio.
yang pesat dilaporkan pada pembekuan sperma dan
embrio.
DMSO dan gliserol, keduanya memiliki berat
molekul yang rendah, telah dikenal sebagai bahan
cryoprotectant terhadap kerusakan dari suhu dingin
selama lebih dari 30 tahun.
nampaknya memiliki oosit survival rate yang lebih baik
setelah pencairan, karakteristik ini kemungkinan
disebabkan karena fakta bahwa PROH dapat
menembus oolema lebih cepat; disamping itu juga
lebih larut air dan kurang toksik.
osmolaitas pada kedua sisi dari membran plasma. Kini,
sukrosa adalah satu-satunya cryoprotectant non penetratif
yang secara rutin digunakan di dalam pengawetan oosit
manusia dengan suhu dingin. Mekanisme kerja dari
cryoprotectant cukup rumit dan dikarenakan beberapa
rentetan dari fungsinya. Yang pertama, adanya
cryoprotectant di dalam larutan mengijinkan
penurunan sedikit dari titik cryoscopic larutan, sekitar
pada suhu -2C atau -3C. Efek proteksi pada
prinsipnya diakibatkan oleh kapasitas dari molekul ini
untuk membentuk ikatan hidrogen yangmana
mengubah struktur ristal yang normal, sehingga
mengurangi dimensinya. Melalui gugus OH nya,
sebagai contoh, gliserol dan PROH, dapat membentuk
ikatan hidrogen denan air sama halnya dnegan DMSO
melalui atom oksigennya. Agen cryoprotectant
mengurangi efek perusakan dari konsentrasi tingggi
elektrolit di dalam porsi air cair. Pada sistem yang
terjadi dari dua fase pada tekanan yang konstan, seperti
es dan air, konsentrasi total dari cairan pada fase cair
adalah konstan untuk masing-masing konsentrasi.
Dikarenakan konsentrasi total dari cairan harus
konstan, penambahan dari cryoprotectant mengurangi
jumlah dari air yang mengkristal.
Efikasi dari senyawa ini secara langsung terkait
dengan temperatur pada saat di mana mereka
ditambahkan ke dalam media kultur. Oosit manusia
yang dipajankan terhadap DMSO pada suatu
temperatur 37C kapasitas untuk mengalami
fertilisasinya lenyap, tetapi pada suhu 4C kapasitas ini
dapat dipertahankan. Penambahan dari suatu
cryoprotectant pada media harus dilakukan pada suhu di
bawah -10C dengan tujuan untuk menghindari
kegagalan fertilisasi. Konsentrasi cryoprotectant optimal
bervariasi tergantung dari tipe sel dan tipe spesies yang
diperiksa.
Suatu langkah yang penting di dalam proses
kriopreservasi adalah pelenyapan dari cryoprotectant
permeabel dari sitoplasma. Prosedur ini terdiri dari
proses lewatnya oosit melewati suatu rangkaian larutan
yang mengandung konsentrasi yang menurun
bertahap. sebagai akibat dari efek tekanan osmotok, sel
tersebut akan segera pecah apabila ditempatkan pada
suatu medium tanpa cryoprotectant pada saat pencairan.
Penyimpanan oosit seringkali dilakukan dengan suatu
prosedur pembekuan lambat-pencairan cepat.
Walaupun tidak lazim dan jarang dilaporkan di
dalam literatur, pembekuan lambat atau pencairan
Kromosom dan Gelendong Meiosis
Gelendong meiosis terdiri dari benang-benang
rapuh berasal dari kutub yang berhadapan dari sel, dari
suatu struktur yang disebut sentriole, dan membentang
sampai kromosom. Kehilangan apapun dari
mikrotubular selama proses pembekuan dapat
memisahkan kromosom dan menyebabkan aneuploidi.
Fertilisasi normal dapat dicapai pada oosit yang
menjalani kriopreservasi, menunjukkan bahwa
integritas yang layak dipertahakan setelah
kriopreservasi. Sebagai akibat dari kariotyping dan
staining atau pengecatan DNA, kromosom terbukti
Sitoskeleton
Terdiri dari struktur sitoplasmik bersabut
kompleks, yang berguna untuk mempertahankan dan
memodifikasi bentuk, mengijinkan pergerakan dari
organela sitoplasmik, eksositosis dari protein membran
intrinsik. Mikrotubular, aktin mikrofilamen, dan
filamen intermediate adalah komponen utama dari
sitoskeleton. Keseluruhan dari komponen tersebut
Granula Granula Kortikal
Oosit yang selamat dari pencairan menunjukkan
suatu tingkat aneuploid yang tinggi ketika menjalani
fertilisasi in vitro. Normalnya, granula kortikal pada
oosit yang matur segera dialinisasi di bawah oolemma.
Reaksi zona terjadi setelah pergerakan granula ini ke
bagian perifer dari sitoplasma dan bertanggung jawab
akan hambatan dari polispermia. Ketika menggunakan
lambat terjadi pada kehamilan kedua dengan suatu
oosit beku. Penggunaan dari cryoprotectant konsentrasi
tinggi, pembekuan ultracepat atau pencairan cepat
mencegah terbentuknya kristal es dan menginduksi
terjadinya suatu medium yang amorfik dan bening.
Pada proses lainnya yang disebut vitrification, suatu
larutan sangat pekat dari cryoprotectant dipadatkan
selama proses pembekuan tanpa terbentuknya kristal
es, di dalam suatu cairan yang sangat kental, dan
superdingin. Hal ini menunjukkan beberapa
keuntungan yang sangat jelas dibandingkan dengan
pembekuan sederhana dikarenakan kerusakan yang
disebabkan oleh bentukan kristal es intraseluler yang
dapat dihindarkan. Kombinasi dari kecepatan
pendinginan yang tinggi (hampir 1500C/menit) dan
konsentrasi yang tinggi dari cryoprotectant seperti
DMSO, acetamide, propyleneglycol, dan
polyethyleneglycol dibutuhkan untuk vitrification. Dasar
teoritis dari vitrification, suatu teknik untuk
mempreservasi embrio. Namun demikian, hasilnya
tidak sesuai, dan toksisitas dari cryoprotectant
dikonfirmasi dengan penelitian eksperimental.
Hambatan pembelahan mungkin dikaitkan dengan
kerusakan ireversibel yang terjadi di dalam sitoskeleton
terkait dengan cairan pendinginan dan vitrifikasi.
Vitrifikasi oosit manusia dengan tujuan untuk
membuktikan kemungkinan berhasilnya prosedur ini.
Proses dari pembekuan dan pencairan dan
cryoprotectant dapat merusak beberapa struktur sel.
tidak hilang dari gelendong selama fertilisasi dari oosit
beku, tidak terbukti untuk oosit manusia. Mungkin
hilangnya kromosom ditambatkan melalui kynetochores
terkait dan tidak bebas bergerak di dalam sitoplasma.
Mungkin juga bahwa gelendong oosit manusia lebih
tidak sensitif untuk membeku dibandingakn dengan
gelendong tikus. Kehilangan kromosomal dari
gelendong minimal pada oosit manusia setelah
pembekuan atau pencairan dan fertilisasi,
menunjukkan bahwa kerusakan krio yang dicatat pada
binatang tidak sama seringnya pada oosit manusia.
cukup sensitif terhadap berbagai stimuli dan
mempunyai kemampuan untuk depolimerisasi cepat
subunit. Cryoprotectant DMSO menghasilkan kerusakan
pada mikrofilamen dari oosit tikus, yang secara
langsung proporsional terhadap konsentrasinya. Ketika
DMSO digunakan pada temperatur mendekati 0C,
efek ini nampaknya berkurang. Perubahan pada
komponen sitoskeleton, diakibatkan oleh kristal es
atau cryoprotectant di dalam oosit beku atau cair.
mikroskop elektron untuk mempelajari oosit manusia
dan tikus, suatu reduksi yang bermakna terdapat dalam
hal jumlah dan perubahan morfologi granula kortikal
setelah pencairan. Pengamatan ini mungkin dapat
menjelaskan insiden yang tinggi dari aneuploidi dalam
oosit beku atau cair. Eksositosis prematur dari granula
kortikal mungkin dikarenakan kerusakan diakibatkan
kristal es atau cryoprotectant pada mikrofilamen aktin
Zona Pellucida
Suatu karakteristik umum dari semua oosit
mamalia adalah adanya suatu lapisan glikoprotein, zona
pellucida, di sisi luar dari oolemma. Fungsi dari zona
pellucida adalah majemuk dan hanya sebagian yang
sudah dimengerti. Yang paling dimengerti dengan baik
antara lain adalah: adanya reseptor terhadap sperma,
induksi dari reaksi zona, blokade dari polispermia, dan
Aktivasi Parthenogenetik
Sejak tahun 1940 telah ditunjukkan bahwa aktivasi
parthenogenetik dapat diinduksi oleh kondisi fisik
seperti pembekuan. Secara sukses, ditemukan bahwa
syok termal dalam bentuk panas dan dingin dapat
bertindak secara efektif sebagai aktivator
parthenogenetik pada beberapa spesies binatang.
Kemungkinan dengan mengubah ultrastruktur dan
respon integral dari berbagai komponen oosit, akan
mengganggu fertilisasi dan pertumbuhan embrio.
Secara khusus,
Kemungkinan untuk timbulnya kelainan genetik
yang menyertai distribusi kromosom yang abnormal
selama dan setelah fertilisasi merupakan perhatian
utama. Hampir 15% oosit manusia yang baru
diperoleh (pada metafase II dan secara morfologi
nampak normal dengan mikroskop cahaya)
menunjukkan satu atau lebih gelendong yang tidak
dikaitkan dengan kromosom. Pada oosit murine yang
diawetkan dengan suhu dingin, yang selama
pendinginan lambat dengan menggunakan DMSO
sebagai cryoprotectant menunjukkan bahwa oosit
kemudian akan mengalami pembuahan dan mencapai
stadium pembelahan pertama, polyploidy mengalami
peningkatan, namun hal ini nampaknya tidak berkaitan
dengan polispermia. Retensi dari polar body nampaknya
menjadi penyebab utama peningkatan poliploidy yang
mirip dijumpai juga pada oosit tikus yang diawetkan
dengan suhu dingin dengan menggunakan tahnik
ultrarapid, ini juga dinamakan dengan triploidy, walaupun
nampaknya tidak mungkin untuk menentukan apakah
berasal dari diandric atau digynic.
yang terdapat tepat di bawah oolemma.
proteksi fisik dari embrio. Bahaya dari perusakan zona
pellucida pada saat kriopreservasi, secara khusus, dapat
terjadi 20-29% oosit. Kerusakan pada zona pellucida
diperkirakan akibat dari pembentukan dari bidang
pembelahan di dalam es atau akibat pembentukan dari
kristal yang besar, yang mana dapat mengurung sel dan
membuat sel mengalami perforasi pada saat proses
pembekuan atau pencairan.
Pada oosit manusia, hanya terdapat sedikit
informasi mengenai kemungkinan penyebab dari
kelainan kromosom, karena fertilisasi yang berhasil
dicapai setelah diawetkan dengan suhu dingin hanya
ada beberapa kasus. Perbandingan antara pengawetan
suhu dingin pada oosit segar dan pada oosit manusia
yang telah matur yang dilakukan dengan menggunakan
1,2-propanediol sebagai bahan cryoprotectant, bahwa
distribusi kromosom yang normal akan diketahui dari
karyotipe setelah pembuahan dari oosit segar yang
diawetkan dengan suhu dingin. Apabila oosit yang
telah berumur diawetkan dengan suhu dingin dan
kemudian dilakukan inseminasi, maka akan terdapat
peningkatan angka fertilisasi yang abnormal, hal ini
menunjukkan bahwa oosit yang telah matur hendaknya
segera diawetkan dengan suhu dingin pada hari oosit
ini diambil. Tingginya angka fertilisasi yang abnormal
nampaknya dikaitkan dengan penuaan in-vitro
daripada prosedur pengawetan suhu dingin ini.
Tidak ada peningkatan yang bermakna dari
frekuensi aneuploidy pada populasi oosit matur setelah
pengawetan dengan suhu dingin, pada oosit immatur,
yang diambil dari keadaan beku dan dikultur pada suhu
37C untuk mencapai kematangan, juga tidak
menunjukkan adanya bukti pembentukan kromosom
yang abnormal. Apabila oosit manusia diawetkan pada
suhu dingin pada stadium germinal vesikel,
dikembalikan lagi, dan dikultur sampai mencapai
kematangan, dan kemudian didinginkan kembali untuk
kedua kalinya, maka aneuploidy akan ditemukan pada
25% dari populasi yang dipulihkan kembali, hal ini
menunjukkan masalah yang mungkin timbul dari
pengawetan suhu dingin yang berulang kali.
KESIMPULAN
Sesungguhnya, sebelum penerapan klinis dari
pengawetan oosit dengan suhu dingin menyebar luas,
penting untuk merencanakan penelitian prospektif
lebih jauh dan untuk memeriksa dengan hati-hati oosit
manusia yang telah matur, baik sebelum dan sesudah
pembuahan dan dengan cara yang dapat diterima
secara etis, untuk membuktikan hipotesis bahwa
pengawetan dengan suhu dingin tidak menyebabkan
aneuploidy.
Hasil terbaik diperoleh dengan pemindahan
embryo dalam suatu siklus penggantian hormonal
lambat. Pengawetan oosit dengan suhu dingin dapat
digunakan untuk berbagai pemakaian klinis. Sindrom
hiperstimulai ovarium merupakan kondisi klinis yang
berbeda dimana pengawetan dengan suhu dingin
elektif dari seluruh oosit merupakan alternatif yang
berlaku tanpa adanya implikasi etis dibandingkan
dengan embryo beku.
Pengawetan oosit dengan suhu dingin pada masa
lalu dipertimbangkan sebagai tehnik yang tidak efisien,
memberikan hasil, fertilisasi dan pembelahan sel yang
buruk. Dengan pengenalan tehnik ICSI, hasil fertilisasi,
perkembangan embryo dan implantasi menjadi serupa
dengan yang dihasilkan oleh oosit segar. Satu-satunya
langkah yang kritikal dari proses akhirnya tampak
menjadi survival rate dari oosit beku dan hal ini harus
dikembangkan lagi selanjutnya.
Keamanan tehnik ini telah dibicarakan secara luas.
Satu dari permasalahan yang terpenting menganggap
kerusakan yang mungkin terjadi pada benang meiosis
dan induksi berikutnya dari aneuploidi. Oleh karena
hal ini, sangatlah mungkin bahwa di dalam proses
pembekuan hanya oosit yang terbaik dan yang paling
kebal yang terpilih, hal tersebut memungkinkan untuk
bertahan dalam berbagai jenis stress yang berbeda.
DAFTAR PUSTAKA
Anwar NC, Jamaan T, Manual Inseminasi
Intrauterus (IIU). Klinik Fertilitas Morula
RS Bunda Jakarta. Jakarta, 2002.

Boediono. A., Kriopreservasi sperma, oosit dan

embrio, Laboratorium Embriologi,
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor, dibacakan pada PIT III
HIFERI 24-27 januari 2007, Yogyakarta

Darmasetiawan MS, Anwar Indra. Fertilisasi In

Vitro Dalam Praktek Klinik, Kelompok
Seminat Kedokteran Reproduksi dan
Embriologi. Jakarta, 2006.

Decherney A, Polan ML (Alih Bahasa : Widjaya

kusuma, Lydon Saputra), Skema
Diagnosis dan Penatalaksanaan
Infertilitas. Binarupa Aksara, Jakarta,
1997.

Larsen WJ. Human Embriology. Churchill

Livingstone. Singapore, 1993.

Marcelle I, Practical Pathways In Infertility.

McGraw-Hill, United of State, 2005.

Porcu. E., Oocyte cryopreservation. In

Textbook of Assested Reproductive
Techniques Laboratory and Clinical
Perspectives. Martin Dunitz Ltd. United
Kingdom, 2001 : 233-241

Rao KA, brinsden PR. The Infertility Manual.

Jaypee Brothers, New Dehli, 2001.

Simson, Elias. Genetic In Obstetri And

Gynecology 3rd edition. Saunders, United
States of America, 2003.

Sperof L, Fritz MA. Clinical Gynecologic

Endocrinology And Infertility 7th edition,
Assited Reproductive Technologies, p
1215 74. Lipincott Williams & Wilkins.
Phildelphia, 2005.