ANALISIS KAFEIN dengan HPLC

1. Penentuan kuantitatif dengan ekstraksi sederhana.

Pada banyak kasus, ekstraksi kafein hanya dilakukan dengan pemanasan kopi dengan
air yang diikuti dengan filtrasi dan injeksi ke dalam kolom HPLC. Pada HPLC
menggunakan fase diam Bondapak, fase gerak air:methanol:asam asetat (74:25:1)
dengan deteksi pada 280 nm.

Sumber : Spiller, A.Gene. 1998. Caffeine. United States of America: CRC Press LLC.
(halaman 23)

2. Analisis kafein pada minuman

Fase balik HPLC digunakan untuk menentukan konsentrasi kafein pada kopi, the, dan
minuma bersoda. Metode tradisional untuk determinasi kafein melalui ekstraksi
dengan kuantitasi spektrofotometri. Penggunaan sistem kromatografi cairan
memungkinkan pemisahan secara cepat dan mudahdari kafein dari senyawa lain
seperti asam tanat, asam kafeat, dan sukrosa yang ditemukan dalam minuman.
Larutan standar kafein disediakan dan diinjeksikan ke dalam HPLC. Selain itu,
minuman kopi, kopi ter-dekafeinasi juga disiapkan dan diinjeksikan ke HPLC. Dari
hasil kromatogram, pengukuran waktu retensi, tR, dan peak area ditentukan. Jika
kecepatan aliran dan tekanan pompa dijaga konstan selama percobaan, tR dapat
digunakan sebagai ukuran kualitatif dan peak area sebagai ukuran kuantitatif. Kurva
kalibrasi peak area terhadap konsentrasi kafein standar dapat dipakai untuk
menentukan konsentrasi kafein pada minuman. Pelarut (fase gerak) pada percobaan
ini adalah 47% methanol/53% air.
Penyiapan larutan standar kafein:
Timbang 10 mg kafein secara akurat yang kemudian dipindahkan ke labu takar 100
mL. encerkan hingga tanda batas dengan air ber-grade HPLC. Lakukan pengenceran
terhadap larutan stok 0,1 g/L untuk memperoleh masing-masing 10 mL larutan
standar 0,01g/L, 0.025 g/L, 0,05 g/L, dan 0,075 g/L. Kocok kelima larutan standar
kafein.
Penyiapan sampel:
1. Minuman kopi
Pipet 5 mL kopi ke dalam labu takar 50 mL yang kering dan bersih kemudian
encerkan sampai tanda batas dengan menggunakan air ber-grade HPLC. Pastikan
sampel disaring ke dalam vial yang bersih. Simpan tiga kromatogram untuk
masing-masing sampel kopi.
2. Kopi ter-dekafeinasi
Pipet 25 mL kopi ter-dekafeinasi ke dalam labu takar 50 mL yang kering dan
bersih kemudian encerkan sampai tanda batas dengan menggunakan air ber-grade
HPLC. Pastikan sampel disaring ke dalam vial yang bersih. Simpan tiga
kromatogram untuk masing-masing sampel kopi.

Sumber :
chemwiki.ucdavis.edu/wikitexts/UC_Davis/UCD_Chem_115_Lab_Manual/Lab_2
%3A_High_Performance_Liquid_Chromatography

3. Standar French
 Sesuai dengan ISO 10095 yang dikeluarkan pada tahun 1992, menspesifikasi
metode penentuan kafein pada kopi bakar, hijau atau pada ekstrak kopi (ter-
dekafeinasi atau tidak). Kafein diekstraksi dengan air pada 90C dengan
keberadaan MgO. Ekstrak disaring dan dibersihkan pada kolom kecil yang
dikemas dengan derifat gugus fenil silica, kemudian dianalisis dengan HPLC pada
kolom C18 dengan fase gerak methanol/air (30:70) dengan detector UV pada
254-280 nm.

Sumber : Spiller, A.Gene. 1998. Caffeine. United States of America: CRC Press
LLC. (halaman 24)

4. Standar British
Kafein diekstraksi dari sampel dengan air pada 90C dengan keberadaan MgO.
Campuran kemudian disaring dan aliquot dimurnikan pada mikrokolum silica
yang dimodifikasi dengan gugus fenil. Kandungan kafein kemudian ditentukan
dengan HPLC menggunakan detector UV.

Sumber : Spiller, A.Gene. 1998. Caffeine. United States of America: CRC Press
LLC. (halaman 24)

5. Analisis kafein pada kopi

Percobaan:
Semua reagen yang digunakan dalam percobaan analisis ini ber-grade HPLC dan
semua larutan disiapkan dengan menggunakan air distilasi.
Penyiapan larutan standar:
Larutan standar kafein 1000 ppm disiapkan dengan melarutkan 0,1 gram standar
kafein (Sigma-Aldrich) dalam 80 mL air distilasi dan disonikasi selama 10 menit.
Kemudian larutan dipindahkan ke labu takar 100 mL dan volume digenapkan
hingga tanda batas dengan air distilasi. Larutan stok kemudian ditempatkan pada
tempat yang gelap pada suhu +4C.
Larutan standar kemudian disiapkan dengan mengencerkan larutan stok.

Penyiapan sampel kopi:

Sebanyak 2 gram sampel kopi ditimbang dan diletakkan pada gelas kimia 250 mL.
sebanyak 100 mL air distilasi mendidih ditambahkan dan dibiarkan selama lima
menit dengan pengadukan, larutan didinginkan dan disaring ke dalam conical
flask. Sebanyak 5 mL filtrate dipipet ke dalam 50 mL labu takar yang bersih dan
digenapkan hingga tanda batas dengan air distilasi. Sampel kemudian difiltrasi
melalui syringe filter 0,45 m dan sampel dengan konsentrasi 20 ppm kemudian
disuntikkan ke dalam sistem HPLC.

Instrumentasi :
Sistem HPLC yang digunakan pada analis ini adalah air isokratik HPLC, yang
terdiri dari model pompa isokratik 1515, vacuum degasser dan detektor PDA 2996
(USA). Injector dengan model Rheodyne 7725i dengan jarum injeksi 20 L.
komol analisis yang digunakan adalah Shim-pack VP-ODS dengan diameter
dalam 4,6 mm dan panjang 250 mm (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan).
Semua hasil kromatografi diproses melalui software empower (Waters
Corporation).

Item Kondisi
Eluen Methanol: Air distilasi (30:70)
Kecepatan aliran eluen 1.3 mL/min
Volume injeksi 20 L
Kolom analitik Shim-pack VP-ODS (250 4,6)mm
Suhu Kolom Ambient
Detektor PDA
Deteksi UV 270 nm
Table 1: Kondisi percobaan

Hasil:
1. Presisi: presisi analitik dari metode diprediksi dari keberulangan dari 6
penentuan larutan kafein 40 ppm dan standar deviasi relative 1,25% dihitung
pada peak area. Waktu retensi kafein adalah 7,347 menit dengan standar
deviasi relative RSD = 0,5% sehingga pada larutan standar, metode HPLC
memberikan waktu retensi yang stabil.
2. Linearitas: grafik kalibrasi dibuat dengan menggunakan jarum injeksi 20 L.
sebanyak 6 konsentrasi kafein dari 10 hingga 100 ppm dianalisis berdasarkan
kondisi percobaan. Hasil grafik menunjukkan hubungan linearitas yang baik
dengan R2 = 0,999
3. Konsentrasi sampel dapat diperoleh dengan menggunakan persamaan dari
kurva kalibrasi yaitu dengan memasukkan nilai AUC pada persamaan sebagai
sumbu y, sehingga nilai x dapat diketahui sebagai konsentrasi sampel

Gambar 1: Kurva kalibrasi AUC vs Konsentrasi larutan standar kafein

 Gambar 2: Kromatogram kafein standar 20 ppm

Sumber : pakista Journal of Nutrition 11. Determination of Caffeine in Some

Sudanese Baverages by HPLC