TUGAS TERSTRUKTUR

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Oleh:
Nindiaswari Putri A1D115048
Nabila Nurhuda A1D115051

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO
2017
 Plasmid dan Penggunaannya dalam Rekayasa Genetika

A. Pengertian Plasmid Sebagai Vektor dalam Rekayasa Genetika

Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing

kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat

terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk

membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid

digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa

diperoleh secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga

disebut sebagai rekayasa genetika.

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai

ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-

gen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi

yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada

organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai

pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid

memilki ciri-ciri antara lain :

a. berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda

b. dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti
c. terdapat di luar kromosom
d. secara genetik dapat ditransfer secara stabil

Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-syarat

diantaranya sebagai berikut :

1. ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya

2. mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk

tidaknya plasmid ke dalam sel inang

3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu

marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing
4. memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel inang

Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu :

1. plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan pBR

322
2. plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid

Ti

Gambar plasmid pBR 322 dengan tempat pengenalan pemotongan DNAnya

dapat dilihat pada gambar 1

Gambar plasmid pUC 19 dan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat

dilihat pada gambar 2

 B. Kegunaan Plasmid
Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal

ini plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing

masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami

replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat

yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.

C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika
Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan

kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses

penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai

berikut :
1. penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada

beberapa jenis plasmid seperti pBR 322 dan pUC19 yang bisa digunakan untuk

prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot

2. bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat

pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai tempat

penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada

sel inang
3. apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah

selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid. Enzim

yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA

asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal : EcoR1

4. langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai

pada daerah potongannya

5. plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang

telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong plasmid
D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid
Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi

adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim

restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi

yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA

asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing

yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:

1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim

pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut
2. Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom,

artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang

sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya

3. Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif

(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

 Gambar 3. Pemotongan enzim restriksi pada DNA

Gambar proses terbentuknya Plasmid rekombinan sebagai hasil

penyambungan plasmid dengan DNA asing dengan sifat tertentu dapat dilihat

pada gambar 6 berikut ini:

Gambar 4. Penyambungan Plasmid dengan DNA asing

E. Metode yang digunakan dalam transformasi DNA

Metode yang digunakan dalam transformasi plasmid DNA, antara lain:
1. Metode Elektroporasi
Elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik untuk

memperbesar pori-pori membran sel sehingga dapat meningkatkan permeabilitas

 membran. Untuk melakukan metode ini, sel harus terlebih dahulu ditumbuhkan

pada media hingga mencapai masa di sekitar pertengahan fase log. Lalu sinyal

elektrik akan menginduksi perbesaran pori-pori membran sehingga molekul yang

berukuran kecil seperti DNA dapat masuk. Efisiensi dari metode ini berbanding

terbalik dengan peningkatan ukuran plasmid. Jadi metode transformasi adalah

metode yang paling efisien. Metode ini juga dapat digunakan untuk

mentransformasikan DNA ke dalam bakteri gram negatif dan positif lainnya (tidak

hanya E. coli).

2. Metode CaCl2
Transformasi sel kompeten E. coli dengan metode CaCl 2 pertama kali

diperkenalkan oleh Mandel dan Higa (1970). Metode ini cukup efisien dan tidak

membutuhkan alat khusus. Dagert dan Ehrlich (1974) memodifikasi metode ini

dengan meningkatkan lama paparan sel terhadap CaCl2. Kushner (1978) berusaha

meningkatkan efisiensinya dengan menggantikan kalsium dengan kation lainnya.

Sedangkan Hanahan (1983) menambahkan beberapa senyawa lain untuk

meningkatkan efisiensinya.
3. Metode Kalsium Fosfat
Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Wigler dkk (Wigler et al, 1979)

dan disempurnakan oleh Chen-Okayama (Chen and Okayama, 1987). Kelebihan

dari metode ini adalah relatif murah dan mempunyai transformasi efisiensi yang

cukup tinggi, baik untuk transfeksi transien maupun transfeksi stabil.