I.

Tujuan

Mahasiswa dapat menggunakan kunci dikotomus untuk menentukan

spesies kultur bakteri yang belum diketahui menggunakan teknik
pengkulturan dan uji biokimia.
II. Dasar Teori

Kunci Dikotomi adalah kunci determinasi suatu spesies yang terdiri atas 2
keterangan yang berlawanan dari ciri-ciri yang dimiliki oleh suatu jenis mahkluk
hidup. Dengan identifikasi spesies bakteri melalui kunci dikotomi memungkinkan
kita untuk tidak melakukan semua uji biokimia yang ada (hanya perlu melakukan
uji yang sesuai dengan kunci dikotomi). Hal pertama yang harus dilaksanakan
adalah pewarnaan gram. Langkah selanjutnya dapat disesuaikan dengan kunci
dikotomi (Fitria, 2009).

Uji-uji biokimia lain yang belum disebutkan dalam modul sebelumnya adalah :

Uji motilitas bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut motil. Media
yang digunakan adalah SIM. Uji positif jika seluruh media menjadi keruh,
negative jika hanya bekas tusukan saja yang keruh (Ratna, 2012).

Uji hemolytic bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri dapat menghancurkan

haemoglobin dari sel darah atau tidak. Media yang digunakan adalah blood agar.
Blood agar dari darah kambing biasa digunakan untuk bakteri Haemophilus
parahaemolitycus , sedangkan blood agar dari darah kelinci digunakan untuk
bakteri Streptococcus. Ada 3 tipe hemolysis yang dilakukan bakteri, yaitu : Alpha
haemolisis, menunjukkan bahwa bakteri hanya dapat melisis haemoglobin secara
parsial saja. Positif ditandai dengan munculnya zona hijau pada media. Beta
hemolysis, menunjukkan bahwa bakteri dapat melisis haemoglobin secara total,
positif ditandai dengan munculnya zona bening pada media. Gamma hemolysis,
menunjukkan bahwa bakteri tidak melisis haemoglobin sama sekali, biasa disebut
juga control negative, biasanya media akan berwarna coklat di sekitar tempat
bakteri ditanam, hal ini merupakan respon normal darah pada kondisi suhu yang
digunakan bakteri untuk tumbuh (Burrows,2004).

1
 Uji bile solubility bertujuan untuk membedakan bakteri golongan alpha
streptococcus. Media yang digunakan adalah media yang mengandung bile salt.
Bakteri pneumococcus akan lisis oleh bile (soluble), sehingga akan muncul zona
bening pada media, sedangkan alpha streptococcus yang lain justru insoluble
terhadap bile, sehingga media akan tetap keruh (Colome, 2001).

Uji bile esculine bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri Enterococcus.

Enterococcus akan mengubah esculin menjadi esculetin dan glukosa. Kemudian
esculetin bereaksi dengan ferric sitrate dalam media dan menghasilkan iron salt
yang berwarna hitam (Buchanan, 2003).

Uji 6,5% NaCl broth bertujuan untuk membedakan bakteri Enterococcus dengan
Streptococcus. Bakteri Streptococcus lebih tahan terhadap kadar garam tinggi
disbanding dengan Enterococcus, sehingga jika terdapat kultur Streptococcus
maka broth akan menjadi keruh, sedangkan jika terdapat Enterococcus media
akan tetap jernih (Fitria,2009).

Uji pigmen biasanya muncul ketika bakteri membentuk koloni. Pigmen ada 2
macam, yaitu : pigmen larut dalam minyak dan pigmen larut dalam air. Warna
pigmen bakteri dapat muncul berbeda-beda karena factor kondisi lingkungan,
sehingga uji ini tidak dapat digunakan untuk membedakan suatu jenis bakteri
tertentu (Ratna,2012).

III. Alat & bahan

a. Alat
Spiritus
Jarum Ose
Tabung Reaksi Beaker Glass
Objek Glass Erlenmeyer
Cawan Petri
Pengaduk
b. Bahan
Kultur
Kultur yang digunakan berupa bakteri yang diberi kode dan merupakan kultur
murni yang ditumbuhkan pada trypticase soy agar slant.
Media Simmons citrate agar
SIM
Trypticase Soy Agar (TSA)
Urea broth
Litmus Milk broth
NB-KNO3 2
H2O2 3%
 Phenol red lactose broths
Phenol red glucose broths
Phenol red fructose broths
Phenol red mannitol broths
MR-VP broth
Reagen
Crystal violet Safranin
Grams iodine Methyl Red
Ethanol 96% Barrit A dan B
Fuschin Reagen Kovacs
Malachite green Solution A dan B
Bubuk Zn
IV. Skema Kerja

Media Agar Slant Media agar petri

Tripticase soy agar plate
Simmons citrate agar slant

Media agar slant yang sesuai

(digores zigzag) Media agar petri yang sesuai
(digores zigzag)
1 ose bakteri 1 ose bakteri

Diinkubasi pada 37Oc (24 jam) Diinkubasi pada 37Oc (24 jam)

1 ose bakteri dari biakan padat 2-3 ose NaCl 0,9%

Kaca objek
Media padat tabung ulir Media Cair

disuspensikan

Diamati dan dicatat Diamatidan dicatat

Fenol red
Dibiarkan kering udara
SIM Agar deep tube (mannitol,
lactose, glucose,
Difiksasi
Media agar padat yang sesuai(ditusuk)
1 ose bakteri fructose) broth.
MRVP Broth
Preparat olesan bakteri
NB-KNO3
Diinkubasi pada 37Oc (24 jam)
Karbolgentian violet Urea Broth
Didiamkan 3 menit & bilas dgn air Litmus milk

Lugol
Diamati dan dicatat
Didiamkan 1 menit & bilas dgn air Media Cair yang sesuai (ditanam)
Pewarnaan Gram 1 ose bakteri
Alcohol 96%
Dicuci hingga warna tidak luntur Diinkubasi pada 37Oc (24 jam)

Fuchsin
Didiamkan 3 menit & bilas dgn air
Diamati dan dicatat 3

Dikeringkan & diamati

 Pewarnaan Spora
1 ose bakteri dari biakan padat 2-3 ose NaCl 0,9%
Kaca objek

disuspensikan

Dibiarkan kering udara

Difiksasi

Preparat olesan bakteri

Malachite green

Didinginkan dan dibilas dengan air hingga bersih

fuchsin
0

Dicuci hingga warna tidak luntur

Dikeringkan & diamati

4
 V. Hasil
VI. Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami bertujuan untuk mengidentifikasi suatu bakteri
dengan mengggunakan kunci dikotomi. Pertama-tama kami melakukan
pewarnaan gram terhadap kultur bakteri A dan didapatkan kultur tersebut
berwarna merah yang merupakan bakteri gram negative, serta bentuknya adalah
basil (Fitria, 2009). Setelah itu kami melakukan uji sesuai dengan bagan kunci
dikotomi, yaitu uji lactose, setelah inkubasi 24 jam ternyata bakteri tidak dapat
memfermentasikan lactose, ditandai dengan tidak adanya gas dalam tabung
durham pada media PRLB, sehingga dapat diperkirakan genus kultur bakteri A
adalah Proteus spp. / Pseudomonas spp. Setelah itu kami melakukan uji glucose
terhadap bakteri A dan memberikan hasil positif dengan ditandai munculnya
perubahan media dari warna merah menjadi warna kuning, dari situ dapat
diperkirakan genus kultur bakteri A adalah Proteus spp. Langkah selanjutnya
adalah menanam kultur bakteri A pada media SIM dan di uji Indol. Saat Bakteri A
di beri reagen kovac, tidak terbentuk cincin merah dipermukaan media (uji Indol
Negatif) sehingga dapat diperkirakan spesies bakteri A adalah Proteus mirabilis /
Proteus inconstans. Pada uji selanjutnya menurut kunci dikotomus, kami
melakukan uji urea untuk dapat memastikan apakah Bakteri A tersebut adalah
bakteri Proteus mirabilis / Proteus inconstans , namun setelah dilakukan inokulasi
dan inkubasi selama 24 jam, hasil dari seluruh anggota KP-B untuk uji urea
menunjukkan hasil negative dikarenakan adanya kesalahan saat pembuatan media.
Media urea sebelum dilakukan inokulasi seharusnya berwarna kuning, namun
media yang kami gunakan, sebelum diinokulasi sudah berwarna ungu, sehingga
karena kesalahan tersebut, kami tidak dapat memastikan apakah kultur bakteri A
tersebut adalah bakteri Proteus mirabilis / Proteus inconstans .

VII. Kesimpulan

Menurut kunci dikotomus, dapat diperkirakan kultur bakteri yang kami dapatkan
(Kultur bakteri A) adalah bakteri dengan genus Proteus spp. Dengan perkiraan
spesies yaitu : Proteus mirabilis / Proteus inconstans . Kami tidak dapat

5
 menyebutkan dengan pasti spesies bakteri yang kami terima, dikarenakan adanya
kesalahan dalam membuat media urea.

VIII. Daftar pustaka

Adam,MR.2001. Microbiology of Fermented Food .Elsivier Applied Science

Publisher,Ltd. New York.
Buchanan,RE. & Gibbons,NE.2003. Bergeys Manual of Determinative
Bacteriology. The William & Wilkins Company Baltimore.USA.
Burrows, W., J.M. Moulder, and R.M. Lewert. 2004. Texbook of Microbiology.
W.B. Saunders Company. Philadelphia.
Colome,JS. Et al. 2001. Laboratory Exercises in Microbiology. West Publishing
Company.New York.
Ratna, Siri .2012. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur dasar
Laboratorium. PT Gramedia,Jakarta.
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram
Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-
positif-dan-gram-negatif. Diakses pada 26 februari 2017.

6
Lampiran

Uji PRLB Uji SIM

Uji Urea
Pewarnaan Gram, Hasilnya
Gram Negatif

Uji PRDB