I.

Tujuan
Mahasiswa dapat menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui
menggunakan teknik pengkulturan dan uji biokimia.
II. Dasar Teori
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang membutuhkan lebih
dari 1 pewarna (butuh 4 pewarna). Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan
struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram + (terdiri dari membrane sel dan
peptidoglikan) akan berwarna ungu. Bakteri gram (terdiri dari membrane,
peptidoglikan, membrane/LPS) akan berwarna merah.
Uji fermentasi karbohidrat (lactose, dextrose, sucrose) bertujuan untuk
mengetahui apakah bakteri dapat memfermentasi karbohidrat dalam media dan
membentuk asam / gas. Media uji menggunakan NB. Indikatornya adalah fenol
red. Jika + maka media akan berwarna kuning dan ada gas dalam durham.
Uji indol bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri dapat menghasilkan
senyawa indol dari degradasi triptofan. Media yang digunakan adalah SIM.
Reagennya kovac. Uji + akan ditandai dengan terbentuknya cincin merah setelah
ditetesi oleh reagen kovac. Media SIM juga bisa untuk uji H2S yg dihasilkan oleh
bakteri. Reagennya FeSO4. Uji + bila terbentuk warna hitam pada media.
Uji MR-VP . medianya MRVP Broth. MR bertujuan untuk mengetahui apakah
bakteri tersebut dapat menghasilkan asam yang cukup banyak hingga dapat
menurunkan pH hingga pH 5. Indikatornya Metil Merah. Uji + jika media menjadi
merah setelah ditetesi metil merah. VP bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri
menghasilkan asetil metil karbinol sebagai produk antara dari proses metabolism
karbohidrat. Indikatornya Barrit A & Barrit B. uji + bila terbentuk warna pink pada
media.
Uji simmon citrate agar bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri
menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya. Medianya SCA.
Indikatornya BTB. Uji + bila warna media berubah menjadi biru.
Uji reduksi nitrat bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan
nitrat sebagai akseptor elektronnya. Medianya NB+KNO3. Reagennya as salisilat
(A) & -naftilamin (B). uji + bila setelah ditambah reagen A&B media menjadi
berwarna merah, tetapi jika tidak berubah warna ada 2 kemungkinan: pertama,
nitrat memang tidak direduksi oleh bakteri; kedua, nitrat telah direduksi lebih
lanjut. Cara untuk mengkonfirmasinya dengan menambahkan bubu Zn, bila setelah
ditambah Zn media menjadi merah, maka hasilnya (-), tetapi jika ditambah Zn
hasilnya tdk berubah maka uji dianggap (+).
Uji katalase bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri mampu memproduksi
enzim katalase. Medianya adalah trypticase soy agar. Uji (+) ditandai dengan
adanya gelembung pada saat ditetesi dengan H2O2. Gelembung tersebut
merupakan O2 hasil dari reaksi H2O2 H2O + O2.
Uji urease bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri mampu memproduksi
enzim urease. Medianya adalah urea broth. Indikatornya phenol red. Uji + bila
media berubah menjadi pink tua.
Uji litmus milk bias dilakukan untuk mengetahui 6 jenis reaksi, yaitu :
fermentasi laktosa, produksi gas, reduksi litmus, pembentukan curd, proteolysis
dan alkaline. Biasanya bakteri yang memiliki galaktosidase bias
memfermentasikan laktosa dengan produk akhir berupa asam, sehingga media
litmus milk akan menjadi merah muda (sekitar pH 4). Pembentukan gas biasanya
ditandai dengan munculnya retakan pada curd (dadih) yang terbentuk, biasanya
gas nya adalah CO2 & H2. Dalam uji reduksi litmus, bakteri menggunakan litmus
sebagai akseptor elektronnya, tanda bahwa litmus telah tereduksi adalah media
susu yg berwarna ungu berubah menjadi putih. Reaksi pembentukan curd, curd ada
2 jenis, yaitu :(1) curd yang terbentuk karena adanya asam organic, tekstur
gumpalannya keras & tidak larut, tidak bisa berpindah dari dinding tabung yang
biasa disebut acid curd. (2) rennet curd, yaitu curd yang terbentuk karena bakteri
memiliki renin yang dapat membentuk paracasein dan bereaksi dengan Ca
membentuk Ca-paracaseinat yang gumpalannya lembut, semi-solid, dan bias
berpindah dr dinding tabung jika dimiringkan. Pada reaksi proteolysis, bakteri
akan memecah protein menjadi AA menghasilkan NH3 yang basa, sehingga media
akan berubah warna dari ungu menjadi jernih kecoklatan da nada pita ungu di
bagian atas media. Reaksi alkaline. pada reaksi ini, bakteri akan mendegradasi
kasein menjadi polipetida dan produk akhir lain yang sifatnya basa, sehingga
warna media akan menjadi biru tua.
 Uji gelatinase bertujuan untuk mengetahui apakah bekteri memiliki enzim
gelatinase. Medianya gelatin. Uji + bila media telah dibekukan namun media
masih tetap cair.
Uji amylase bertujuan untuk mengetahu apakah bakteri memiliki enzim
amylase untuk menghidrolisis pati. Medianya starch agar. Uji positif bila setelah
ditetesi iodin ada zona bening pada media,
III. Skema Kerja
A. Pewarnaan Gram B. Uji Biokimia
i. Media Cair
Fenol red (sucrose,
1 ose bakteri dari biakan padat 2-3 ose NaCl 0,9%
Kaca objek
lactose, dextrose)
disuspensikan broth.
MRVP Broth
Dibiarkan kering udara NB-KNO3
Urea Broth
Litmus milk
Difiksasi
Gelatin deep tube

Preparat olesan bakteri

Media Cair yang sesuai (ditanam)
Karbolgentian violet
1 ose bakteri
Didiamkan 3 menit & bilas dgn air

Diinkubasi pada 37Oc (24 jam)

Lugol
Didiamkan 1 menit & bilas dgn air

Diamati dan dicatat

Alcohol 96%
ii. Media Agar Slant
Dicuci hingga warna tidak luntur iv. Media agar petri
Trypticase soy agar slant
Simmons citrate agar slant
Fuchsin Tripticase soy agar plate
Didiamkan 3 menit & bilas dgn air Starch agar plate
Media agar petri yang sesuai
(digores zigzag)
Media agar slant yang sesuai
(digores zigzag)
1 ose bakteri
1 ose bakteri

Dikeringkan & diamati

Diinkubasi pada 37Oc (24 jam)
Diinkubasi pada 37Oc (24 jam)

Media agar padat yang sesuai(ditusuk)

iii. Media padat tabung1 ulir
ose bakteri Diamati dan dicatat
Diamati dan dicatat
SIM Agar deep tube
Diinkubasi pada 37Oc (24 jam)

Diamati dan dicatat

IV. Hasil

liqueficationGelatin
Gram Agar Slant Litmus Fermenta

H2S prod

VP reaction

Starch hydrolysis
NO3 red
Indole prod
MR reaction

Citrate use
Urease activity
Catalase activity
Organisme
Stain Cultural milk si
Characteristic reaction

Dextrose
Sucrose
Bakteri A Rod Tipis, abu- Lactose
Alkaline - A - + + - + - - - + - -
- abu, merata G
Salmonella Rod Tipis,abu- Alkaline - A A + + - + - + - + - -
typhimurium - abu, merata G

V. Pembahasan
Pada percobaan kali ini kami melakukan pewarnaan gram dan bermacam-
macam uji biokimia untuk mengidentifikasi bakteri. Bakteri yang diberikan adalah
bakteri A. bakteri A tersebut ketika diuji pewarnaan gram, bakterinya berwarna
merah dan berbentuk basil, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah
bakteri gram - . Pada uji litmus milk bakteri A menghasilkan warna ungu
cenderung biru hal ini menunjukkan bahwa bakteri A dapat menghasilkan produk
akhir basa (alkaline), setelah itu kami menguji fermentasi laktosa,
dextrose,sukrosa. Bakteri A hanya positif (baik asam maupun gas) pada media
yang mengandung dextrose, sedang yang lain negative, hal itu berate bakteri A
hanya bias memfermentasi dextros. Bakteri A juga positif di uji produksi H2S,
yang ditandai dengan menghitamnya media SIM yang telah ditusuk dengan 1 ose
 bakteri A, begitu juga dengan uji reduksi nitrat, bakteri A juga menunjukkan hasil
positif dengan terbentuknya warna merah ketika diberi asam sulfanilat+-
naftilamin, hal ini berarti bakteri bias mereduksi nitrat menjadi nitrit. Pada uji
indol, bakteri A memberikan hasil negative, hal ini berarti bakteri A tidak dapat
merubah triptofan menjadi senyawa indol. Pada uji MRVP bakteri A positif pada
uji MR namun negative pada uji VP, hal itu menunjukkan bahwa bakteri A dapat
membentuk asam yang cukup banyak sehingga pH berada pada kisaran 5, namun
bakteri tidak memproduksi asetilmetil karbinol sebagai produk antara dalam
metabolismenya. Pada uji sitrat bakteri A menunjukkan hasil negative dengan
tetapnya warna SCA (warna hijau), hal ini berarti bakteri A tidak menggunakan
sitrat sebagai sumber sitrat satu-satunya. Pada uji urease, media tidak berubah
menjadi warna pink yang berarti bakteri A tidak memiliki enzim urease untuk
memecah urea pada media. Pada uji katalase bakteri A muncul gelembung setelah
ditetesi oleh H2O2, hal ini menunjukkan bakteri memiliki enzim katalase untuk
mengubah H2O2 H2O + O2. Pada uji gelatinase, media gelatin yang sudah
ditanami oleh bakteri A tetap beku meskipun sudah didinginkan, hal ini
menunjukkan bahwa bakteri A tidak memiliki enzim gelatinase dan tidak berhasil
menghidrolisis gelatin yang ada pada media sehingga gelatinnya tetap bisa
membeku ketika sudah didinginkan. Pada uji starch hidrolisis, bakteri A juga
memberikan hasil negative, dibuktikan dengan warna media menjadi biru gelap
ketika ditetesi iodin, hal ini membuktikan bahwa bakteri A tidak memiliki enzim
amylase untuk memecah pati yang terkandung dalam media, sehingga pati yang
ada pada media akan tetap bias bereaksi dengan iodin dan membentuk warna biru
gelap.
Dari semua uji-uji diatas, hamper semua hasil sama dengan literature hasil
dari bakteri Salmonella typhymurium kecuali pada uji sitrat, Bakteri A (-),
Salmonella typhymurium (+), hal tersebut dapat disebabkan oleh
factor..?
VI. Kesimpulan
Dari hasil percobaan dan setelah dicocokkan dengan hasil literature, maka kami
menyimpulkan bahwa bakteri A tersebut adalah bakteri Salmonella typhymurium.
VII. Lampiran