Anda di halaman 1dari 12

ACARA V IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI : UJI BIOKIMIAWI A. TUJUAN Mengidentifikasi biokimiawinya.

dan mendetermiasi bakteri berdasarkan sifat-sifat

B. DASAR TEORI

Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni berarti hasil isolasi perlu ditentukan morfologi individual, sifat-sifat pengecatan, morfologi koloni, sifat-sifat biokimia (fisiologi)m patoenitas dan serologinya. Untuk bakteribakteri tertentu, kadang-kadang tidak diperlukan pengujian selengkap di atas (Bibiana, 1994). Identifikasi bakteri adalah suatu tugas yang dilakukan di Laboratorium. Setelah melakukan identifikasi kita dapat menentukan pengobatan ataupun pencegahan secara tepat dan sedini mungkin terhadap bakteri tersebut (Hadioetomo, 1985) Mikroorganisme yang akan diisolasi dapat berupa biakan murni maupun populasi campuran. Bila biakan tercemar, maka perlu pemurnian dengan cara menggoreskan suspensi mikroba yang akan diisolasi pada agar lempengan dan diperoleh koloni terpisah. Lalu dibuat pewarnaan gram untuk melihat kemurnian biakan. Setelah diperoleh biakan murni dapat dilakukan serangkaian uji untuk memperoleh mirfologi dan biokimia (Bibianan, 1994). Pada pengujian yang lengkap untuk determinasi bakteri, hasil-hasil pengujian dimasukkan dalam daftar pengamatan yang disebut Discriptive chart. Untuk determinasi bakteri digunakan buku pedoman Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Buku tersebut memuat semua sifat-sifat bakteri yang telah dikenal.

Uji identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan : 1. Test Katalase Uji ini dapat menunjukkan adanya respirasi aerob. Katalase adalah salah satu enzim yang digunakan mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen peroksida yang bersifat toksik dalam sel karena menginaktifkan enzim dalam sel. Uji katalase berguna untuk mengidentifikasi kelompok bakteri tertentu. Pada bakteri bentuk coccus uji katalase digunakan untuk membedakan staphylococcus dan streptococcus. Kelompok staphylococcus bersifat katalase positif sedangkan streptococcus bersifat katalase negatif. Penentuan adanya katalase diuji dengan larutan 3% H2O2 pada koloni terpisah (Bibiana, 1994). 2. Pengecatan gram Termasuk pengecatan differensial karena zat warna yang digunakan adalah pewarna differensial, karena dapat membagi bakteri sejati menjadi 2 kelompok fisiologi yang memudahkan identifikasi jenisnya. 3. Fermentasi karbohidrat Kemampuan memfermentasikan karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi bakteri. Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba, media yang digunakan, serta faktor lingkungan. Untuk menentukan adanya fermentasi, di laboratorium digunakan media MRVP. Pembentukan asam dapat diketahui dengan menambahkan indikator

ke dalam media. Kaldu karbohidrat digunakan untuk uji pembentukan asam (Bibiana, 1994). 4. Uji oksidase Uji ini berguna untuk identifikasi mikroorganisme pathogen. Bakteri yang bersifat oksidase positif diberi reagen oksidase (dimetil-pfenilendriamin oksalat), maka warna koloni berubah menjadi hitam dalam waktu 30 menit. Perubahan warna ini disebabkan oksidase sitokrom mengoksidasikan larutan reagens. Reagen yang dioksidasi bewarna hitam namun bila terjadi reduksi tidak terjadi perubahan warna (Bibiana, 1994). 5. Uji indol Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan penambahan berbagai reagen seperti : Kovacs, Ehrlich, dan Ehrlich bihme. Semua reagen tersebut mengandung para-dimetilaminobenzaldehida. Reagen akan bereaksi dengan indol dan akan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium. Untuk uji ini digunakan media semi padat yang kaya akan triptofan. Penggunaan media semi padat ini sekaligus untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan di sekotar tusukan dan permukaan media (Bibiana, 1994). 6. Uji VP (Voges-Poskauler) Uji ini digunakan untuk mengidentifikasikan mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3 butanadiol. Bila bakteri mengidentifikasikan karbohidrat menjadi 2,3 butadional sebagai produk utama akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5 % larutan alfanaphtol dalam etanol dapat menentukan adanya aseoin (asetil metal karbinol), suatu senyawa permukaan dalam sintesi 2,3 butadional. Pada

penambahan KOH adanya asetoin oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Yang kemudian diperjelas dengan penambahan larutan alfanaphtol (Bibiana, 1994). 7. Uji Hidrogen sulfide Pembentukan asam sulfida oleh mikroorganisme menunjukkan adanya penguraian asam amino yang mengandung sulfur. Mikroorganisme yang menghasilkan desulfurase sewaktu dibiakkan dalam media yang kaya akan asam amino yang mengandung sulfur akan menghasilkan H2S dan senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak larut dalam air. Pembentukan H2S dapat terlihat dengan menggunakan media yang mengandung polipeptida dan kaya akan asam amino yang mengandung sulfur dan ion Fe2+. Jika digunakan lead acetate agar, maka H2S beraksi dengan PG dan PG5 yang berwarna hitam (Bibiana, 1994). 8. Uji dekarboksilase lisin Proses dekarboksilase lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam biakan yang mengandung lisin. Karbohidrat yang dapat difermentasikan (glukosa) dan indikator pH untuk melihat perubahan pH (lazimnya BCP). Uji ini digunakan dalam pencirian mikroorganisme terutama yang menempati saluran pencernaan (Bibiana, 1994). 9. Uji sitrat Digunakan untuk menguji kemampuan mikroorganisme

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk menguji ini dpaat digunakan medium sitrat korer yang berupa cairan dan tidak mengandung indikator pH bromthymol blue (Bibiana, 1994). 10. Hidrolisis urea

Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang menguraikan urea menjadi ammonium dan CO2. Aktifitas enzim urease ini dapat diamati dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam media biakan yang mengandung urea dan indikator pH. Bila urea dihidrolisis NH4+ terakumulasi dalam media biakan dan menyebabkan pH menjadi basa. Perubahan warna dari merah jingga menjadi merah ungu menunjukkan terjadi hidrolisis. Urea bersifat labil sehingga media urea tidak dapat disterilkan dengan autoklaf tetapi dengan filtrasi (Bibiana, 1994).

C. PROSEDUR KERJA 1. Alat dan Bahan a. Isolat murni bakteri tanah (hasil percobaan Acara III) dalam NA miring dan NB (nutrien cair). b. Reagen untuk test oksidase : tetramethyl-paraphenyldiamine c. Regen untuk test katalase : 10% atau 30% H2O2 d. Bahan untuk test O-F : media O-F yang mengandung 0,5-1 % karbohidrat, parafin cair e. Bahan untuk test sitrat : Simmons Citrate Agar yang mengandung indikator Brom Thymol Blue-BTB f. Bahan untuk test dekarboksilase lisin : media Lysin Iron Agar (LIA) yang mengandung Lisin dan indikator Brom Cresol Purple-BCP, media tanpa Lisin

g. Media Nutrien Agar (NA) h. Gelatin i. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) j. Bahan untuk test pembentukan indol : media Tryptone Water, reagen Kovacs k. Bahan untuk test MR-VP : media MR-VP, larutan 40% KOH, larutan 5% alphanaphtol l. Bahan utnuk test Urease : media Urea Broth, idikator Phenol Red
m. Buku panduan determinasi bakteri : Bergeys Manual of Determinative

Bacteriology (Holt et al., 2000) n. Jarum ose o. Pipet volume steril

2. Cara Kerja a. Test oksidase Letakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada keras saring. Ambillah suspensi isolat murni bakteri dalam nutrien cair dan inokulasikan pada kertas saring yng telah ditetesi reagen. Amati dan laporkan hasil pengujian, reaksi positif terjadi jika timbul warna ungu tua atau hitam setelah didiamkan selama beberapa menit.

Kadangkala perubahan warna memakan waktu lebih lama sampai 10-30 menit. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

b. Test katalase Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan tambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri. Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih seketika. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

c. Test O-F (Oksidasi Fermentasi) Inokulasikan secara hati-hati isolat murni bakteri ke dalam 4 tabung berisi media O-F yang mengandung 0,5-1% karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa atau sukrosa) secara tusukan. Tabung I ditutup dengan parafin lunak, tabung II tidak ditutup parafin, tabung III dan IV sebagai kontrol (ditutup paraffin dan tidak ditutup paraffin tanpa inokulasi bakteri). Amati setelah 24 jam pada suhu kamar.

Bandingkan perlakuan dengan kontrol. Oksidasi (terbentuk warna kuning pada media O-F yang tidak ditutup paraffin) terjadi pada mikroba aerobik dan fermentasi (terbentuk warna kuning pada media OF yang ditutup paraffin) terjadi pada mikroba anaerob. Bandingkan dengan kontrol. Perhatikan perubahan warna media yang terjadi dan indikator yang terkandung dalam media O-F

d. Test pengunaan sitrat Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Perhatikan perubahan warna dengan melihat perubahan warna dari hijau menjadi biru. Bandingkan dengan kontrol

e. Test dekarboksilase lisin Pada medium yang mengandung lisin dan kontrol (media tanpa lisin) diinokulasi secara tusukan dengan isolat murni bakteri, inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam.

Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning dan kembali ke ungu, sementara pada kontrol (media tanpa lisin) terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning

f. Test hidrolisis gelatin Dengan cara tusukan, inokulasikan isolat murni bakteri pada media yang mengandung gelatin sedalam bagian dari lapisan permukaan. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Pada saat pengamatan, masukkan tabung perlakuan dan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri) dalam almari es selama 30 menit. Positif berarti terjadi pencairan

g. Test H2S dan fermentasi gula-gula Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolat murni bakteri secara goresan menggunakan jarum ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi.

Inkubasikan selama 24 jam Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warna hitam. Perubahan warna media TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula (glukosa, sukrosa, laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya media atau terangkatnya media ke atas. Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri)

h. Test indol Inokulasikan 1 tabung media Tryptone Water dengan 2 tetes isolat murni bakteri dan 1 tabung media untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

Inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah inkubasi, tiap-tiap tabung ditambah 5 ml larutan reagen Kovacs. Terbentuknya warna merah/merah muda pada lapisan larutan reagen menunjukkan terbentuknya indol.

Bandingkan dengan kontrol

i. Test MR (Methy Red) Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP (media Methyl Red-Voges Proskauer) dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Tambahkan 5 tetes reagen Methyl Red ke dalam tabung berisi media MR-VP. Kocoklah hati-hati, Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

j. Test VP (Voges Proskauer) Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Tambahkan 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%.

Kocoklah hati-hati, longgarkan tutupnya, kocok kembali, ulangi setiap 5 menit, bacalah perubahan warnanya setelah 30 menit. Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

k. Test urease Inokulasikan media Urea Broth yang mengandung indikator fenol merah dengan 1 tetes kultur murni bakteri. Amatilah perubahan warna menjadi merah (phenol red) setelah 24 jam pada suhu kamar. Bandingkan dengan kontrol