LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

(Identifikasi dan Determinasi Sel Bakteri : Uji Biokimiawi )

Disusun Oleh : Nama NIM Kelompok : Indah Kertawati : 098114039 : B3

Tgl. Praktikum : 24 Maret 2010 Pj Laporan :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKUTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2010

ACARA V IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI SEL BAKTERI: UJI BIOKIMIAWI

I.

UJI BIOKIMIAWI

A. Tujuan : Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat sifat biokimianya.

B. Dasar Teori:

Aktivitas aktivitas enzimatis pada mikroba sangat berguna untuk membedakan mikroba yng satu dengan mikroba yang lain. Atas dasar ini dapat diketahui bahwa beberapa bakteri yang sangat erat kekerabatannya sering dipisahkan dalam golongan yang berlainan dengan menguji kemampuan mirobia tersebut untuk dapat mengadakan fermentasi sejenis hidrat arang. ( Tarigan, 1988) Untuk mengidentifikasi bakteri dengan pengujian biokimia, diambil dari koloni yang terpisah. Pengujian berdasarkan kerja hasil metabolisme yang disebabkan oleh daya kerja enzim. Pengujian biokimia memerlukan berbagai media untuk mendapatkan berbagai sifat mikroorganisme.

Tes Oksidasi, uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidasi sitokrom pada mikroorganisme tertentu. ( Brock, 1979)

Test Katalase, Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrigen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen hidrogen peroksida yang bersifat toksis terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel.

Pengujian katalase berguna dalam identifikasi kelompok bakteri tertentu. ( Lay, 1994)

Test O-F ( Oksidasi- Fermentasi ), Untuk menguji metabolism bakteri oksidatif atau fermentatif. Oksidasi terjadi dalam tabung oleh organism aerob dan fermentasi oleh organism anaerob. Pada fermentasi Glikosa akan diubah menjadi glukosa G- Phospat yang kemudian dirombak menjadi asam piruvat. Begitu juga oksidase akan merubah glukosa menjadi asam pirufat. ( Lay, 1994 )

Test penggunaan sitrat, uji ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini digunakan medium sitrat, koser, berupa medium cair atau medium sitrat simon berupa medium padat. Bila organism mampu menghaasilkan sitrat maka asam sitrat akan dihilangkan dari lingkungan sehingga Ph naik dan suasana basa ( indikator beruah menjadi biru ) ( Lay, 1994)

Test Dekarboksilase lisin, Beerapa asma amino dapat didekarboksilase oleh mikroorganisme. Dekarboksilase paling banyak terdeteksi adalah lisin, ornithin, dan arginin. Dekarboksilasi melepaskan produk produk yang netral, dan proses ini dapat dideteksi secara langsung dengan menggunakan indicator PH seperti bromocresol ungu yang berwarna kuning pada kondisi asam dan berwarna ungu pada kondisi alkalis. ( Lay, 1994 )

Hidrolisis Gelatin, gelatin adalah suatu protein hewani bila digunakan membentuk gel. Beberapa mikroorganisme dapat menguraikan gelatin sehingga asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin oleh mikroba dilakukan oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan sifatnya cair. Uji glikolisis gelatin

dilakukan untuk mengidentifikasi Pseudomonas Flavobacterium, Serrana ( Lay, 1994 )

Pembentukan H2S, sulfur ditemukan pada berbagai senyawa seperti asam amino sistein dan tiosulfat inorganik dapat direduksi menjadi gas H2S oleh beberapa mikroorganisme. Gas tersebut dapat dideteksi karena kemampuannya dalam bereaksi dengan garam ferro untuk menghasilkan ferrous sulfida, suatu endapan berwarna hitam. Biasanya digunakan untuk bakteri seperti salmonella, Arizona, Edwardsiella, dan proteus.( Lay, 1994 )

Pembentukan Indol,

indol adalah produk yang dilepaskan dari oksidasi

asam amino ripofan. Indol dideteksi pada medium kultur dengan menggunakan dimetilaminobenzaldehid (warna keruh) digunakan untuk membedakan Eszhericia ( + ), dari eschericia ( - ) untuk mengkarakterisasi anggota genus bacillus ( Lay, 1994 )

Test Voges- Proskaver,

pengujian ini digunakan untuk mengidentifikasi

mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butadianol. Bila bakteri memfermentasikan karbihidrat menjadi 2,3-butadianol sebagai produk utama akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Perubahan warna diperjelas dengan menggunakan larutan alfa-naftol. Digunakan untuk memisahkan klebsiella dan enterobacter (+), dari eschericia (-) untuk mengkarakterisasi anggota genus bacillus ( Lay, 1994 )

C. Prosedur Kerja : Akat dan Bahan :

1. Isolat murni bakteri tanah sludge ( hasil percobaan acara III ) dalam NA miring dan NB ( Nutrien cair ) 2. Reagen untuk tes oksidase : Tetramethyl-paraphenyldiamine 3. Reagen untuk tes katalase : 10 % atau 30 % H2O2 4. Bahan untuk O- F yang mengandunng 0,5 1 % karbohidrat, paraffin cair 5. Bahan untuk test sitrat : simmons Citrate agar yang mengandung indicator Brom Thymol Blue-BTB 6. Bahan untuk dekarboksilase Lisin : Media lysine iron agar ( LIA ) yang mengandung Lysin dan indicator Brom Cresol Purple-BCP, media tanpa Lysin 7. Media nutrient agar ( NA ) 8. Gelatin 9. Media TSIA ( Triple Sugar Iron Agar ) 10. Bahan untuk tes pembentukan indol : media Trypton Water, reagen konvacs 11. Bahan untuk pembentukan : MR VP, larutan 40 % KOH, larutan 5 % alpha-naphthol 12. Buku Panduan Determinasi Bakteri : Bergeys Manual of Determinative Bacteriology ( Holt et al., 2000 ) 13. Jarum Ose 14. Pipet volum steril

Cara Kerja : 1. Test Oksidase Meletakan 2 3 tetes larutan tetrametyl paraphenyldiamine pada kertas saring

Mengambil isolate murni bakteri dalam nutien cair dan inokulasikan pada kertas saring yang telah ditetesi reagen. Mengamatii dan laporkan hasil pengujian Terjadi reaksi positif jika timbul endapan berwarna ungu tua atau hitam setelah didiamkan selama beberapa lama. Kadang kala perubahan warna memakan waktu lebih lama sampai 10 30 menit. Membandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

2.

Test Katalase Meletakan 1 2 tetes larutan 10 % atau 30 % larutan H2O2 pada gelas benda Menambahkan 1 ose atau 2 3 tetes suspense isolate murni bakteri. Mengamati yang terjadi. Hasil positif ditandai dengan timbulnya buih seketika Membandingkan dengan kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )

3. Test O-F (Oksidasi Fermentasi) Menginokulasikan secara haati-hati isolate murni bakteri kedalam 4 tabung berisi media O-F yang mengandung 0,5%-1% karbohidrat ( glukosa, laktosa, manitol, maltose, atau sukrosa) secara tusukan. Menutup tabung I dengan paraffin lunak, tabung II tidak ditutup paraffin, tabung III dan IV sebagai kontrol ( ditutup paraffin dan tidak ditutup paraffin tanpa inokolasi bakteri)

 Mengamati setalah 24 jam pada suhu kamar Membandingkan perlakuan dengan kontrol ( Terjadi oksidasi apabila terbentuk warna kuning pada media O-F yang tidak ditutup paraffin, terjadi pada mikroba aerobik. Terjadi fermentasi apabila terbentuk warna kuning pada media O-F yang ditutup paraffin, terjadi pada mikroba anaerob) Membandingkan dengan kontrol ( Perhatikan perubahan warna media yang terjadi dan indicator yang terkandung dalam media O-F )

4. Test Penggunaan Sitrat Menginokulasikan isolate murni bakteri secara goresan menggunakan ose dan secara secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrate Agar Miring. Kemudian menginkubasi selama 24 jam pada suhu kamar Membandingkan dengan kontrol ( perhatikan perubahan warna dari hijau menjadi biru)

5. Test Dekarboksilase Lysin Pada medium yang mengandung Lysin dan kontrol ( media tanpa lysine) diinokulasikan secara tusukan dengan isolate murnii bakteri Menginkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Hasil positif jika terjadi perubahan warna dari kuning, menjadi ungu dan kembali ke ungu, sementara pada kontrol terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning.

6. Test Hidrolisis Gelatin Menginokulasi isolate murni bakteri secara tusukan pada media yang mengandung gelatin sedalam bagian dari lapisan permukaan. Menginkubasi elama 24 jam pada suhu kamar Memasukkan tabung perlakuan dan kontrol ( media tanpa inokulasi bakteri ) kedalam lemari es selama 30 menit. Terjadi hasil positif jika terjadi pencairan.

7. Uji H2S dan Fermentasi Gula-gula Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolate murni bakteri secara goresan menggunakan jarum inokulasi. Meng inokulasi selama 24 jam. Pembentukan H2S ditunjukan dengan terbentuknya endapan berwarna hitam. Perubahan arna media TSIA, dari merah menjadi kuning menunjukan adanya fermentasi gula ( glukosa, sukrosa, laktosa) Mengamati juga terbentuknya gas yang ditandai dengan pecahnya media atau terangkatnya media keatas. Membandingkan dengan kontrol ( media tanpa inokulasi bakteri.

8. Uji Indol

Menginkubasi 1 tabung media Trypton Water dengan 2 tetes isolate murni bakteri dan satu tabung media untuk kontrol ( tanpa inokulasi bakteri ) Menginkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah inkubasi, tiap-tiap tabung ditambah 5 mL larutan reagen konvacs. Terbentuknya warna merah / merah muda pada lapisan larutan reagen menunjukan terbentuknya indol. Membandingkan dengan kontrol

9. Test MR ( Methy Red ) Menginokulasikan isolate murni bakteri pada media MP-VP ( media Methy Red Voges Proskauer ) Menginkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Menambahkan 5 tetes reagen metyl red kedalam tabung berisi media MR-VP. Mengocoknya dengan hati-hati. Hasil positif terjadi jika terbentuk warna merah dalam 30 menit setelah penambahan reagen. Membandingkan dengan kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )

10. Test VP ( Voges Proskauer ) Menginokulasikan isolate murni bakteri pada media MR-VP Menginkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar

 Menambahkan 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%. Mengocok dengan hati-hati, melonggarkan tutupnya, dan kocok kembali, ulangi setiap 5 menit. Mengamati perubahan warnanya setelah 30 menit. Tes menunjukan hasil positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen.

II.

DETERMINASI BAKTERI Hasil hasil pengujian dimasukan dalam daftar pengamatan yang disebut Descriptive Chart. Untuk determinasi bakteri digunakan buku panduan determinasi bakteri Bergeys Manual of Determinative Bacteriology.