IDENTIFIKASI MIKROBA

BEBERAPA CARA IDENTIFIKASI DAN KLASIFIKASI

BAKTERI

o KONVENSIONAL TAXONOMY
Didasarkan pada Morfologi, Pertumbuhan, Sifat Fisiologi Biokimia.
Fisiologi : Uji pH, NaCl, OF, Suhu, Biovar, Bacteriocin
Biokimia: Uji Gram, Katalase, Oksidase
o NUMERICAL TAXONOMY
Didasarkan pd Kesamaan Dr Sejumlah Besar Karakter Fenotipik
Secara Keseluruhan. Metode Ini Prosesnya Lebih Lengkap Dari Pada Pd
Klasifiaksi Konvensional, Lebih Dari 50 Karakter Fenotipik Diuji Dan Data
Diprogram Di Komputer
o MOLEKULER TAXONOMY
Didasarkan Pada Parameter DNA, Seperti Komposisi Dasar Guanine
Cytosine (G+C) Homolog, Restriksi Framen-length Polymorphism (RFLP)
Dan Tranfer Gen.
o CHEMOTAXONOMY
Didasarkan Pada Pembentukan Komponen Sel, Profil Metabolik,
Pigmen.
Misal : Komposisi Kimia Dr Peptidoglykan, Komponen Gula Dan Asam
Amino.
• Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi
tiga macam :

– Pengecetan sederhana
o Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain
dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada
lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi.
– Pengecetan diferensial
o Pewarnaan gram
o Teknik dengan pewarnaan gram dibagi menjadi dua golongan
yaitu gram positif ( bila warna zat pewarna pertama karbol gelatin
violet tetap bertahan, dengan demikian warna bakteri tesebut
tampak ungu tua, dan untuk gram negatif ( bila warna zat pewarna
pertama tidak bertahan atau luntur kemudian tercat oleh zat
pewarna tandingnya, misal : air fuchsin, safranin dll.
o Pewarnaan tahan asam
– Pengecetan struktural atau khusus
o Pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan
kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat
komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser
(granula volutin), pewarnaan yodium (granula
glikogem) dan pewarnaan negatif.
Bentuk dan Susunan Sel
Karakteristik Kultural

Kultur pada Agar Miring

DD sel bakteri Gram (+) dan Gram (-)
Hasil pengecatan Gram S. aureus dan E. coli
 Uji Gram
Uji gram dilakukan dengan meneteskan larutan KOH 3% pada koloni
bakteri di atas obyek glass steril, kemudian koloni diangkat ke atas pelan-
pelan dengan menggunakan jarum ose.
Gram Negatif  koloni bakteri membentuk benang (elastis)
Gram positif  tidak ada lisis sel

Pengujian gram dengan KOH didasarkan pada pelisisan lipid oleh KOH
• Bakteri gram negatif memiliki lapisan lipid bilayer, peptidoglikan yang
tipis, dan sebagian besar dinding selnya tersusun atas lipoprotein yang
akan lisis ketika ditetesi KOH, sehingga menyebabkan DNA keluar sel.
Adanya viskositas tinggi dari DNA yang keluar sel tersebut
menghasilkan substansi mucus yang nampak seperti lendir jika ditarik ke
atas.
• Bakteri gram positif dinding selnya tersusun atas lapisan peptidoglikan
yang tebal sehingga tidak mudah lisis akibat KOH.
 Uji Katalase

Katalase adalah enzim yang dimiliki oleh mayoritas bakteri

dan terlibat dalam dekomposisi hidrogen peroksida menjadi
air dan oksigen. Hidrogen peroksida dan oksigen digunakan
untuk transport elektron dalam fermentasi bakteri aerobik
maupun aerobik fakultatif.

Uji katalase bertujuan untuk mengetahui enzim katalase yang

dihasilkan bakteri dengan cara meneteskan larutan hidrogen
peroksida (H2O2) 3% pada koloni bakteri di atas obyek glass
steril. jika terdapat gelembung maka bakteri tersebut positif
mengandung enzim katalase.
 Uji Indol
• Uji indol dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri
memecah triptofan asam amino membentuk senyawa indol.
• Triptofan dihidrolisis oleh triptofanase untuk menghasilkan tiga
kemungkinan produk akhir, salah satunya adalah indol.
• Produksi indol terdeteksi oleh reagen Kovac atau Ehrlich yang
tersusun atas 4-p-benzaldehid dimethylamino, reagen ini
bereaksi dengan indol, sehingga menghasilkan senyawa
berwarna merah.
• Uji indol adalah uji biokimia yang umum digunakan untuk
membedakan Enterobacteriaceae dan genera lainnya

Prosedur uji indol adalah dengan menginokulasikan biakan bakteri pada

medium SIM, kemudian diinkubasikan selama 24-48 jam pada suhu 37 oC.
Kultur ditetesi dengan 0,5 ml reagen Kovac’s. Reaksi positif ditandai jika
terdapat warna merah pada permukaan medium yang menunjukkan bahwa
bakteri mampu memecah asam amino triptofan.
 Uji Merah metil
Uji merah metil dapat digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroba dalam
memfermentasikan asam campuran ketika disuplai glukosa.

Jenis dan proporsi produk fermentasi yang dihasilkan oleh fermentasi glukosa
secara anaerob sangat membantu untuk membedakan berbagai genera enterik
bacteria. Sejumlah besar asam menghasilkan penurunan yang signifikan
terhadap pH media di bawah 4,4.
Indikator pH, metil merah (asam p-dimethylaminoaeobenzene O-karboksilat),
berwarna kuning  pH > 5.1
Berwarna merah  pH < 4,4. yang mana metil merah mendeteksi asam
jauh lebih rendah dari pH indikator lain yang digunakan
dalam media kultur bakteri.

Uji merah metil dilakukan dengan menginokulasikan biakan murni ke dalam

tabung reaksi yang berisi MR-VP medium kemudian diinkubasikan pada suhu
35-37 °C selama 24-48 jam atau hingga medium terlihat keruh, kemudian 5
tetes metil merah diteteskan ke dalam tabung. Warna merah (reaksi positif),
warna kuning (reaksi negatif).
 Uji Voges-Proskauer
Organisme seperti anggota kelompok Enterobacter menghasilkan
asetoin sebagai produk akhir metabolisme glukosa dan
membentuk jumlah yang lebih kecil dari asam campuran.
Adanya oksigen dan 40% kalium hidroksida, asetoin diubah
menjadi diacetyl, dan alpha-naftol berfungsi sebagai katalis untuk
mengeluarkan kompleks merah.

Uji Voges-Proskauer dilakukan dengan menginokulasikan biakan

murni ke dalam tabung reaksi yang berisi MR-VP medium,
kemudian diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24-48 jam atau
hingga medium terlihat keruh. Teteskan 0,6 ml reagen Baritts A
dan reagen Baritts B / naphtol 5% dan KOH 40%.
Reaksi positif  warna merah-kehitaman di permukaan media
setelah 30 menit, jika media dikocok, maka
warna media menjadi merah-kehitaman
seluruhnya.
 Media SIM
Untuk diferensiasi anggota Enterobacteriaceae
berdasarkan produksi H2S, produksi indole, dan
motilitas.
 Uji Sitrat
Media yang dipakai adalah Simons citrat.
Media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol Blue).
Bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media
berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.

Interpretasi hasil :
negatif (-) : tidak ter!adinya perubahan warna media dari hijau.
artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu
enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga
bakteri tidak menggunakan citra sebagai salah satu/satu-satunya
sumber karbon.
Positif (+) : terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi
biru.
 Uji Motilitas
Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan
kandungan agar-agar 0,2-0,4%. Bisa memakai media MO
(Motilitas Ornitin) atau SIM (Sulfida Indol Motility)
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak kuman.

Pada media SIM selain untuk melihat motilitas bisa juga untuk
test indol dan pembentukan H2S.
Interpretasi hasil :
Negatif (-) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih
seperti akar hanya pada bekas tusukan inokulasi.
Positif (+) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih
seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan
adanya pergerakan dari bakteri, yang berarti bahwa
bakteri ini memiliki flagel.
 Uji Urenase
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui bakteri
menghasilkan enzim urease yang dapat menguraikan urea
membentuk amoniak.

Media urea berisi indikator phenol red.

Interpretasi hasil :
Negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi
pink/merah jambu.
Positif (+) : terjadi perubahan warna media menjadi pink
 Uji TSA / KIA
Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri
untuk memfermentasikan karbohidrat.

Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) berisi  glukosa, laktosa,

sukrosa.

Indikatornya adalah phenol red yang menyebabkan perubahan

warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam.
Glukosa berada di dasar media
Laktosa dan sukrosa berada di bagian lereng.

media KIA (Kligers Iron Agar)  glukosa dan laktosa.

Interpretasi hasil :
 hanya memfermentasi glukosa
Dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan
lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa) (Al/Ac atau K/A)
 Memfermentasi semua karbohidrat
Dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan
lereng (slant) berwarna kuning (bersifat asam) (Ac/Ac atau
A/A)
 Tidak memfermentasi semua karbohidrat :
Dasar (butt) media berwarna merah (bersifat basa) dan lereng
(slant) berwarna merah (bersifat basa) (Al/Al atau K/K)
Fermentasi TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2
yang dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar.

Media TSIA  identifikasi terbentuk H2S hasil melihat

fermentasi metionin dan sistein (AA yang bergugus S).
Gugus S dari metionin dan sistein akan bereaksi dengan H2O
membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+
membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap
 Uji GULA-GULA
• Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah bakteri
memfermentasi masing-masing gula (L-arabinose, D-mannitol,
sukrosa, trehalose, lactose)
• Media gula-gula ini terpisah dalam tabung yang berbeda dan
media yang digunakan adalah masing-masing gula dengan
konsentrasi 1% dalam pepton. Masing-masing gula gula
ditambahkan indikator phenol red.
• Interpretasi hasil :
Negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media dari
merah menjadi kuning
Positif (+) : terjadi perubahan warna media dari merah
menjadi kuning.

Mikroba yang memfermentasi gula membentuk asam dan gas.

Gas yang diperhitungan minimal 10% dari tinggi tabung durham
Eosin metilen biru agar media diferensial digunakan untuk
deteksi dan isolasi patogen Gram-negatif usus (fecal bacteria).
(Eosin dan metilen biru  indikator fermentasi laktosa dan yang
tidak memfermentasi laktosa. & metilen biru bertindak sebagai
inhibitor untuk organisme Gram-positif.

E coli koloni ungu gelap dengan

kemilau hijau metalik,
Enterobacter aerogenes  koloni
merah muda ke unguan.
Bakteri non-fermentasi  koloni
tanpa warna atau terlihat
trnasparan.
Tugas Individu

Carilah media-media spesifik yang digunakan dalam

mengidentifikasi suatu jenis bakteri

Dikumpulkan pada 22 Maret 2022 dalam bentuk file pdf

 Identifikasi Bakteri secara Molekuler

Komponen Reaksi PCR

 Buffer (containing Mg++)

 Template DNA
 dNTPs
 Taq DNA Polymerase (or another thermally stable
DNA polymerase)
 2 Primers (forward and reverse )  suatu
oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan
nukleotida DNA templat
Komponen
Ribosom Subunit
kecil

Prokariot Subunit
besar

Eukariot
5S rRNA
16S rRNA
23S
18S 5.8S 5S
30-38 protein
45-50 protein 28S
 PCR DNA pengkode 16S rRNA
Isolat bakteri yang terlihat pita DNA genomnya diamplifikasi
dengan menggunakan primer DNA pengkode 16s rRNA yaitu
• 27F (5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’),
• 533F (5’ GTG CCA GCM GCC GCG GTA A 3’) dan
• 907R (5’ CCG TCA ATT CMTTTG AGT TT 3’),
• 1492R (5’ GGT TACCTT GTT ACG ACT T 3’) (Lane,1991).

PCR dilakukan dengan mereaksikan

• 15 µl aquabidest steril,
• 25 µl 2x PCR Master mix (Qiagen Kit),
• 1,25µl forward primer (10 pmol/µl, konsentrasi akhir 0,25
pmol/µl),
• 1,25 µl reverse primer (10 pmol/µl, konsentrasi akhir 0,25
pmol/µl) dan
• 2 µl ekstrak DNA.
Siklus PCR (Total siklus 35 kali)
• Denaturasi 98°C dalam 5 menit dan 95 °C
dalam 35 detik ;
• Annealing dengan suhu 55°C selama 35
detik
• Elongasi pada suhu 72°C dalam 90 detik.
PCR

Temperature
100 Melting
94 oC

50

0
T i m e

3’ 5’
5’ 3’
PCR

Temperature
100 Melting
94 oC

50

0
T i m e
3’ 5’

Heat

5’ 3’
PCR

Temperature
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
T i m e
3’ 5’
5’

5’
5’ 3’
PCR

Temperature
100
Melting Melting 30x
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
T i m e
3’ 5’

Heat
5’

5’

Heat
5’
5’ 3’
PCR

Temperature
100
Melting Melting 30x
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
T i m e
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’
PCR

Temperature
100
Melting Melting 30x
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ T i m e
5’
5’
5’ 3’

Heat
5’

5’

Heat
5’
PCR

Temperature
100
Melting Melting 30x
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ T i m e
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’
PCR

Temperature
100
Melting Melting 30x
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’ 5’ 5’ T i m e
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’
Fragments of
defined length 5’
5’

5’
5’
Verification of PCR product
Analisis data sekuen DNA pengkode 16s rRNA
BLAST NCBI

Untuk mengetahui urutan nukleotida dari genom bakteri tersebut

 Hasil PCR dilakukan metode sekuensing

Analisis urutan DNA melalui program pelacakan database Basic

Local Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for
Biotechnology Information, National Institute for Health, USA
(www.blast.ncbi.nlm.nih.gov)