IDENTIFIKASI

BAKTERI
Na’imatul R. Faizah, S.Tr.Keb.,M.Farm
1. Metode Konvensional
a) Pewarnaan Bakteri
b) Uji Biokimia

2. Metode PCR
 Pewarnaan Bakteri
1. Pewarnaan Sederhana
2. Pewarnaan Gram
3. Pewarnaan Negatif
4. Pewarnaan Tahan Asam
5. Pewarnaan Spora
6. Pewarnaan Kapsul
 Pewarnaan Sederhana

 Untuk membedakan berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus,

basil, spirilum, dsb)
 Hanya menggunakan 1 macam zat pewarna saja
 Zat-zat warna pada pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
 sehingga mudah bereaksi dengan sitoplasma bakteri yang bersifat
basofil
 Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana
ialah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan
fukhsinkarbol (5 detik)
Prosedur Pewarnaan Methylene Blue:

1) Dibuat preparat bakteri

2) Warnai dengan methylene blue selama 30-60 detik
3) Cuci dengan air kran, keringkan pada suhu kamar
4) Lihat dengan mikroskop menggunakan minyak imersi
5) Bakteri-bakteri berwarna biru.
 Pewarnaan Gram

 Pertama kali diuraikan dan dipublikasikan oleh seorang

ahli bakteriologi Denmark, Hhans Christian Gram pada
tahun 1884
 Pewarnaan Gram bertujuan untuk membedakan bakteri
gram positif dan gram negatif yang memiliki struktur
berbeda terutama pada dinding selnya  memudahkan
analisis terhadap suatu bakteri
 Prinsip pewarnaan Gram berdasarkan jenis dinding
sel bakteri:

Gram (+)
 Peptidoglikan bakteri yang tebal dan lapisan lemak yang tipis pada dinding
bakteri berikatan kuat dengan Gentian Violet
 Lugol memperkuat ikatan tersebut, lalu diberikan alkohol sehingga melunturkan
lemak
 Karena pada bakteri Gram (+) lemaknya tipis sehingga warna ungu pada Gentian
Violet yang luntur pun sedikit dan bakteri tetap dipenuhi warna ungu
 Karena sudah dipenuhi dengan warna ungu maka tidak bisa lagi berikatan dengan
fuchsin
Gram (-)
 Peptidoglikan bakteri yang tipis dan lapisan lemak yang tebal pada
dinding bakteri maka saat berikatan dengan Gentian Violet, ikatan
yang terjadi adalah ikatan lemah
 Diberi Lugol yang memperkuat ikatan tersebut dengan Gentian
Violet, namun tidak terlalu memberikan arti yang signifikan
 Bakteri Gram (-) yang memiliki lemak tebal ketika diberi alkohol
maka lemak luntur dan warna Gentian Violet pun luntur
 Karena tidak terwarnai maka bakteri akan menyerap warna fuchsin
yaitu merah
 Prosedur Pewarnaan Gram

1) Buat preparat melingkar diameter 2-3 cm

2) Fiksasi di atas api sampai kering
3) Genangi Gentian Violet 3 menit, dicuci dengan air
4) Genangi dengan Lugol selama 2 menit
5) Genangi dengan alkohol hingga jernih
6) Cuci dengan air dan genangi dengan fuchsin selama 1 menit,
lalu cuci dengan air
7) Keringkan dan periksa di mikroskop pembesaran
 Pewarnaan Negatif

• Bertujuan untuk mewarnai beberapa jenis bakteri yang sulit untuk

diamati morfologinya dengan pewarnaan sederhana
• Pewarnaan dilakukan bukan untuk mewarnai bakterinya namun
untuk mewarnai latar belakang dari bakteri  bakteri akan terlihat
berwarna bening, latar belakangnya hitam (akibat warna dari tinta
cina)
• Digunakan untuk identifikasi bakteri spirochaetales (Treponema
pallidum, leptospira), kapsul pada bakteri tertentu seperti pada
Diplococcus pneumoniae, Klebsiella, dll.
 Prosedur Pewarnaan Negatif

a. Diteteskan 1 tetes tinta cina pada kaca objek

b. Diteteskan 1 tetes sampel, campur homogen
c. Dibuat apusan sehingga ada bagian tipis
d. Dikeringkan kemudian diperiksa dengan mikroskop
 Pewarnaan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen)

 Pewarnaan khusus untuk mengidentifikasi bakteri-bakteri yang

memiliki sifat tahan asam khususnya genus Mycobacterium
 Mycobacterium dikatakan tahan asam sebab jika diwarnai dengan
karbol fuchsin, sifat kimianya yang unik menahan zat warna
walaupun olesan yang terwarnai telah dicuci dengan alkohol-asam
bakteri tahan asam akan tampak berwarna merah
 Prosedur Pewarnaan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen)

 Dibuat sediaan dengan cara coiling ukuran 2x3 cm

 Sediaan dilewatkan 3x melalui api spiritus
 Sediaan digenangi dengan karbol fuchsin
 Dari bawah sediaan dipanasi dengan menggunakan spiritus sampai keluar uap (jangan sampai
mendidih)
 Diamkan minimal 5 menit. Lebih lama diperbolehkan tetapi cat sediaan jangan sampai kering
 Sediaan dibilas hati-hati dengan air mengalir
 Sediaan dimiringkan dengan menggunakan pinset untuk membuang air
 Sediaan digenangi dengan asam alkohol sampai tidak tampak warna merah karbol fuchsin
 Digenangi methylene blue selama detik
 Sediaan dibilas dengan air mengalir, keringkan sediaan pada rak pengering. Jangan keringkan dengan
tisu.
 Pewarnaan Spora
• Bertujuan untuk mengamati dan mempelajari spora yang dimiliki
oleh bakteri tertentu
• Tidak semua bakteri memiliki spora, umumnya bakteri yang
berbentuk batang yang bisa menghasilkan spora
Spora: alat pelindung yang dikeluarkan bakteri bila keadaan sedang
tidak baik untuk dirinya (disebut endospora, karena dihasilkan
bakteri di dalam tubuhnya)
• Pengamatan spora penting karena bakteri yang memiliki spora
cukup berbahaya, walaupun tidak semuanya
 Prosedur Pewarnaan Cara Klein
 1 ml suspensi bakteri umur 24 jam dalam suspensi kuman pada agar-miring yang telah berumur 48 jam,
dicampur dengan karbol fuchsin yang sama banyaknya di dalam tabung reaksi
 Campuran ini direndam pada penangas air 80 °C kira-kira 10 menit (untuk membunuh bakteri-bakteri
yang tidak membentuk spora)
 1 ose dari campuran dibuat sediaan pada 1 kaca objek yang bersih dan bebas dari lemak
 Keringkan dan fikasi 3x di atas api bunsen
 Celupkan dalam asam-sulfat 1% selama 1-2 detik.
 Cuci dengan air kran dan diwarnai dengan methylene blue kira-kira selama 2-3 menit
 Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.

 *Hasil pewarnaan:
Spora: berwarna merah, Bakteri: berwarna bir
 Pewarnaan Kapsul

 Kapsul tidak mempunyai afinitas yang besar terhadap bahan-bahan

zat warna yang bersifat basa
 Beberapa kapsul dapat dirusak oleh gangguan mekanik atau larut
bila dicuci dengan air
 Kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-zatnya 
tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan
yang sama
 Contoh bakteri berkapsul: Bacillus anthracis, Diplococcus
pneumonia, Klebsiella, dll
 Prosedur Pewarnaan Kapsul
 Diletakkan 1 suspensi bakteri dan 1 ose tinta cina pada kaca objek
 Campurkan kedua suspensi tersebut hingga menjadi lapisan kaca film
tipis
 Keringkan preparat dan difiksasi 3x
 Preparat ditetesi dengan zat warna fuchsin selama 5 menit
 Zat warna kemudian dibuang, tetapi jangan dicuci, kemudian
dikeringkan
 Preparat ditetesi dengan minyak imersi dan diamati di bawah
mikroskop.
 UJI BIOKIMIA
 Merupakan bagian dari prosedur identifikasi untuk menentukan
genus atau spesies bakteri tertentu.
 Pada prinsipnya, uji biokimia dilakukan untuk mengetahui
kemampuan bakteri dalam mereaksikan senyawa kimia sehingga
menghasilkan senyawa kimia yang lain yang dikaitkan dengan
sifat bakteri itu sendiri.
 Untuk mengetahui adanya reaksi tertentu diperlukan suatu
senyawa indikator atau reagen yang berbeda-beda tergantung
bahan kimia yang ditambahkan.
 1. Uji Gram
 Uji gram merupakan langkah awal dalam identifikasi bakteri.
 Uji gram bertujuan untuk mengetahui kelompok bakteri gram negatif atau
positif.
 Uji gram dilakukan dengan meneteskan larutan KOH 3% pada koloni bakteri di
atas obyek glass steril, kemudian koloni diangkat ke atas pelan-pelan dengan
menggunakan jarum ose.
 Apabila koloni bakteri membentuk benang (elastis), maka bakteri tersebut
bersifat gram negatif, jika sebaliknya bakteri tersebut gram positif
 2. Uji Katalase

o Katalase adalah enzim yang dimiliki oleh mayoritas bakteri dan

terlibat dalam dekomposisi hidrogen peroksida menjadi air dan
oksigen.
o Hidrogen peroksida dan oksigen digunakan untuk transport
elektron dalam fermentasi bakteri aerobik maupun aerobik
fakultatif.
o Uji katalase bertujuan untuk mengetahui enzim katalase yang
dihasilkan bakteri dengan cara meneteskan larutan hidrogen
peroksida (H2O2) 3% pada koloni bakteri di atas obyek glass steril.
jika terdapat gelembung maka bakteri tersebut positif mengandung
enzim katalase
3. Uji Indol

o Uji indol dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri memecah

triptofan asam amino membentuk senyawa indol. Uji indol digunakan
untuk membedakan Enterobacteriaceae dan genera lainnya

o Prosedur uji indol adalah dengan menginokulasikan biakan bakteri

pada medium SIM, kemudian diinkubasikan selama 24-48 jam pada
suhu 370 C.

o Kultur ditetesi dengan 0,5 ml reagen Kovac’s.

o Reaksi positif ditandai jika terdapat warna merah pada permukaan

medium yang menunjukkan bahwa bakteri mampu memecah asam
amino triptofan.
 4. Uji Merah Metil
 Uji merah metil dapat digunakan untuk mengetahui
kemampuan mikroba dalam memfermentasikan asam
campuran ketika disuplai glukosa.
 Jenis dan proporsi produk fermentasi yang dihasilkan oleh
fermentasi glukosa secara anaerob sangat membantu untuk
membedakan berbagai genera enterik bacteria.
 Uji merah metil dilakukan dengan menginokulasikan biakan
murni ke dalam tabung reaksi yang berisi MR-VP medium
kemudian diinkubasikan pada suhu 35-370 C selama 24-48
jam atau hingga medium terlihat keruh, kemudian 5 tetes
metil merah diteteskan ke dalam tabung.
 Reaksi positif terjadi jika terbentuk warna merah pada
media (pH 4,4) dan sebaliknya jika media berwarna kuning
(pH diatas 5,1).
 UJI PCR (Polymerase Chain Reacton)

 PCR adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan suatu

sekuen nukleotida tertentu secara eksponensial dalam waktu yang relatif
singkat dengan cara in vitro tanpa menggunakan organisme hidup
seperti E. coli atau khamir
 Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B.
Mullis, seorang peneliti di perusahaan CETUS Corporation.
 PCR digunakan untuk mengamplifikasi suatu bagian kecil yang telah
ditentukan dari utas DNA yang dapat berupa gen tunggal atau hanya
bagian dari gen.
 Kegunaan PCR
 Penelitian biologis dan medis mencakup diagnosis penyakit hereditas
atau cacat pada gen, identifikasi penyakit baru dan deteksi keberadaan
virus AIDS dalam sel manusia
 Bidang kehakiman. Potensi penggunaan sumber DNA untuk
meyakinkan identitas seseorang dalam ilmu kehakiman adalah bukti
akurat
 Pada bidang ilmu pengetahuan dan kesehatan, PCR dapat digunakan
sebagai metode yang sangat cepat dan akurat untuk skrining atau
sekuensing suatu koloni bakteri. Hal ini disebabkan karena PCR
sangat sensitif. Sensitivitas tersebut membuatnya dapat digunakan
untuk melipatgandakan satu molekul DNA.
 Komponen utama pada proses PCR

1) Cetakan DNA, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan;

2) Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek
(15 – 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis
rantai DNA;
3) Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP,
dTTP, dan;
4) DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis
rantai DNA
Komponen lain yang juga penting adalah senyawa dapar
 Proses PCR
 Tahap pertama dimulai dengan melakukan denaturasi cetakan DNA sehingga rantai DNA yang
berantai ganda akan terpisah menjadi rantai tunggal. Denaturasi DNA dilakukan dengan
menggunakan panas (95ºC) selama 1-2 menit.

 Tahap kedua adalah annealing, yaitu penempelan primer kepada untai DNA yang telah terdenaturasi.
Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer
dengan sekuen primer. Primer dapat melekat pada sekuen komplementernya dengan cara menurunkan
suhu sampai 40ºC - 60ºC.

 Tahap terakhir yaitu proses perpanjangan primer yang menempel pada cetakan DNA dengan
melibatkan DNA polymerase sebagai katalis. Tahap ini dilakukan dengan menaikkan suhu antara
70ºC – 75ºC.
 Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:

 Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand

DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).
 Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer
akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded
DNA.
 Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan
membentuk strand DNA baru.