LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI ( PEWARNAAN GRAM )

Laporan pewarnaan gram

A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
B. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui
bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana
ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
a.

pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru
dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transpv aran (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gramnegatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan
Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram
negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid)
kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna
merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.
Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi
oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria,
2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
Komposisi dinding sel
Ketahanan terhadap
penisilin
Penghambatan oleh
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
(Manurung, 2010).

Bakteri garam (+)

Kandungan lipid rendah (14%)
Lebih sensitif

Bakteri gram negatif(-)

Kandungan lipid tinggi

Lebih dihambat

Kurang dihambat

Kebanyakan spesies relatif

kompleks
Lebih tahan

Relatif sederhana

Lebih tahan

Kurang tahan

Pewarna an tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler.

Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk
mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung
pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna
tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam
alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat
intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur
pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu
dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau
lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkoholasam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh
terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru
(Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan,
kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau
kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat
warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol
3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci
dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1%
dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci
dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu
dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan
Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang
memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel
vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan
kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan
endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak
jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak
sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana,
endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)
a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat

melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru
gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga
terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

A. Alat dan Bahan

NO

Alat

Jumlah

Jarum ose

Pembakar
spirtus
Kaca preparat

Pipet tetes

Mikroskop

6
7
8

Gelas kimia
Kaca objek
Tabung reaksi

3
1
1

B.
Kaca Objek
Cara Kerja

Bahan
Biakan murni B.
cereus dan E.colipa
da medium NA
yang berumur 24
jam
Aquades steril
Larutan huckers
crystal violet
Larutan mordan
lugol iodine
Larutan alkohol
96%
Larutan safranin

Dibersihkan dengan menggunakan alkohol

Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api
Kaca objek yang telah steril
Ditetesi aquades
Jarum ose

Dibakar sampai merah

Dicelupkan pada alkohol
Jarum ose yang steril
Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api
Sampel e.coli dan Bacillus

Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).

Disimpan di atas kaca objek
Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca objek
Kaca objek yang telah berisi sampel
Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.

Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)

Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Dikeringkan pada udara terbuka
Hasil
Diamati dibawah mikrosko

A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Tabel pengamatan
Gambar 1. Fiksasi
Sumber : dokumentasi Pribadi

Gambar 2. Pada saat ditetesi violet

Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 3. Penambahan lugol

Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%

Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin

Sumber : dokumentasi pribadi

Bakteri yang telah di ambil kemudian di

simpan pada kaca objek yang dicampur
dengan setetes aquades. Setelah itu
difiksasi di atas api sampai kering.
Pemanasan tidak boleh terlalu panas
karena bisa merusak sel bakteri.
Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet.
Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan
selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Hasilnya terdapat warna
ungu pada kaca objek.
Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai
terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di
air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca
objek tetap berwarna ungu akibat dari
tetesan violet.
Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri
ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan
selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Setelah dicuci, warna
ungu pada kaca objek menghilang akibat
penambahan dari alkohol.
Setelah warna ungu pada bakteri hilang,
kemudian bakteri ditetesi safranin sampai
terendam dan biarkan selama 1 menit.
Kemudian cuci di air yang mengalir.
Hasilnya, bakteri yang dihasilkan
berwarna merah muda.
Gambar 6. Hasil pewarnaan
Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)

Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar B. cereus pada pembesaran 16x10
Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah
awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri
gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung,
2010).
Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal
violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme
target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang
bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna
ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya
tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna
ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan
warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme
gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan
didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih
kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan
selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95%
merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan
kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung
pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak

akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna
akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua
krikemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi
tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1
menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan
pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat
atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi
dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran
menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu
yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan
komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat
warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung
cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca
objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat
warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak
tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,
gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka
termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka
termasuk golongan bakteri gram negatif.

B. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan
gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan gram positif.

Daftar Pustaka

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.

http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November 2010
Fitria,
Bayu.
2009. Pewarnaan
Gram
(Gram
positif
dan
Gram
Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gramnegatif. 11 November 2010.
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia,
dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai
Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara
Kesehatan Vol. 9 No. 1.
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November
2010.
Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi
UNS.