Lembar kerja praktikum

7/25/2019
analisis mikrobiologi
XI APL

AMBARINI RORONINGTYAS, SPd

SMKN 9 KOTA TANGERANG
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

1. KD : Menerapkan pewarnaan mikroba

 Teknik Pewarnaan GRAM (Pewarnaan Differensial)

TUJUAN PRAKTIKUM :
1. Mempelajari cara menyiapkan apusan bakteri dengan baik sebagai prasyarat untuk
mempelajari teknik pewarnaan;
2. Mempelajari prosedur Pewarnaan Gram, memahami tahapan prosedur dan reaksi
kimiawi yang terlibat dalam prosedur.

TINJAUAN PUSTAKA :
Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya
walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih
jelas dikembangkan teknik pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan bakteri adalah
pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel.
Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu :
(1) bersifat Asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam
natrium.
(2) bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk klorida.
Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil
rekasi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan
istilah zat Pematek yang akan melekatkan zat warna pada plasma sel.

Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu :

Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam zat
warna seperti : Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.
Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.

Pengamatan morfologi bakteri hasil pewarnaan dilakukan di bawah pengamatan

mikroskop.

1
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Berdasarkan Pewarnaan GRAM, bakteri diklasifikasikan ke dalam 2 (dua) kelompok

besar yaitu : Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Perbedaan utama di antara
keduanya adalah struktur dan komposisi dinding selnya. Bakteri Gram Positif
mampu mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram, yaitu Gentian
Violet, sehingga nampak berwarna ungu saat pengamatan dikarenakan dinding sel
kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian besar Peptidoglikan, yang mampu
mengikat zat warna dan tidak rusak saat dicuci dengan alcohol. Sementara itu, bakteri
Gram negatif memiliki komposisi dinding sel yang sebagian besar tersusun dari
lapisan lipid, sehingga pada saat pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat
warna utama terutama saat dicuci dengan alcohol (lipid rusak saat dicuci dengan
alcohol), akibatnya kelompok bakteri ini memberikan kenampakan warna merah
(warna dari zat warna ke dua : safranin atau air fuchsin) di akhir kegiatan pewarnaan
Gram.

Seri reagen yang digunakan dalam Teknik Pewarnaan Gram meliputi : Zat Warna I
(Gentian/Crystal Violet), Larutan Iodine, Alcohol, dan Zat Warna II (Safranin/ Air
Fuchsin). Adapun ilustrasi kondisi sel bakteri saat pewarnaan Gram tampak seperti
pada Gambar berikut :

2
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM :

1. TEKNIK PEMBUATAN APUSAN BAKTERI
Alat : Bahan :
Jarum Ose Biakan (Agar Culture/ Broth Culture)
Gelas Object NaCl Fisiologis
Bunsen Spiritus

Sumber dari biakan Cair (Broth Culture)

1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop Biakan Cair (Broth Culture),
tempatkan di atas Object Glass;
2. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan;
3. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit;
4. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan.
Ilustrasi Teknik Pembuatan Apusan bakteri dapat dilihat pada Gambar

TEKNIK PEWARNAAN GRAM

Alat :

1. Objek glass

3
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

2. Cover glass
3. Pipet tetes
4. Botol semprot
5. Bunsen

Bahan :

1. Apusan Bakteri
2. Zat warna gentian violet
3. Iodine
4. Alkohol
5. Zat warna safranin
6. Aquades
7. Spritus

Prosedur :
1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya;
2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan, biarkan selama
20 detik;
3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik;
4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1 menit;
5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna (sekitar
10 – 20 detik);
6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;
7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20 detik;
8. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;
9. Keringkan di suhu ruang;

4
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

KD 2 : Menerapkan analisis mikrobiologi dalam bahan alam dan produk industri

dengan metode TPC

Tujuan :

1. Siswa dapat melakukan analisis mikrobiologi menggunakan metode TPC

2. Siswa dapat menerapkan analisis mikrobiologi menggunkan metode TPC

Tinjaun pustaka :

Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC) adalah
menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada media agar, sehingga
mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode ini
merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jumlah
mikroorganisme.Dengan metode ini, kita dapat menghitung sel yang masih hidup,
menentukan jenis mikroba yang tumbuh dalam media tersebut serta dapat
mengisolasi dan mengidentifikasi jenis koloni mikroba tersebut.
Pada metode ini, teknik pengenceran merupakan hal yang harus dikuasai.Sebelum
mikroorganisme ditumbuhkan dalam media, terlebih dahulu dilakukan pengenceran
sampel menggunakan larutan fisiologis.Tujuan dari pengenceran sampel yaitu
mengurangi jumlah kandungan mikroba dalam sampel sehingga nantinya dapat
diamati dan diketahui jumlah mikroorganisme secara spesifik sehingga didapatkan
perhitungan yang tepat.Pengenceran memudahkan dalam perhitungan koloni
(Fardiaz, 1993). Menurut Waluyo (2005), tahapan pengenceran dimulai dari membuat
larutan sampel sebanyak 10 ml (campuran 1 ml/1gr sampel dengan 9 ml larutan
fisiologis). Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan kedalam 9 ml
larutan fisiologis sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dari pengenceran 10-2
diambil lagi 1 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis
sehingga didapatkan pengenceran 10-3, begitu seterusnya sampai mencapai
pengenceran yang kita harapkan.Secara keseluruhan, tahap pengenceran dijelaskan
dalam gambar berikut ini.

5
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Teknik pengenceran Sampel

Setelah dilakukan pengenceran, kemudian dilakukan penanaman pada media
lempeng agar.Setelah diinkubasi, jumlah koloni masing-masing cawan diamati dan
dihitung.Koloni merupakan sekumpulan mikroorganisme yang memiliki kesamaan
sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu
diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah sebagai berikut:
 Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya berupa satu titik, namun ada pula
yang melebar sampai menutup permukaan medium.
 Bentuk. Ada koloni yang bulat dan memanjang. Ada yang tepinya rata dan tidak
rata.
 Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata dengan permukaan medium, ada
pula yang timbul diatas permukaan medium.
 Halus kasarnya pemukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang
permukaannya kasar dan tidak rata.
 Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat da nada yang
permukaannya suram.
 Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.
 Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lender, ada yang keras dan kering.

6
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Selanjutnya perhitungan dilakukan terhadap cawan petri dengan jumlah koloni bakteri
antara 30-300.Perhitungan Total Plate Countdinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri
hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer.
Keuntungan dari metode TPC adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang
dominan. Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat
dalam contoh.Adapun kelemahan dari metode ini adalah:
 Memungkinkan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba,
seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel.
 Memungkinkan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya.
Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena
penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama
masa inkubasi.
 Memungkinkan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh
permukaan media,sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan
mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung.
 Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya
antara 30 – 300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan
menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih
dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan
diantara koloni.
 Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang
umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.
Uji Total Plate Count menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni
yang dapat diamati secara visual dan dihitung. Sebelum Untuk melaporkan analisis
mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut “Standard Plate Count” yang
menjelaskam cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada
untuk menghitung jumlah koloni dalam suatu contoh. Cara menghitung koloni pada
cawan harus memperhatikan hal-hal berikut ini :diuji di media padat, sampel terlebih
dahulu harus diencerkan. Pengenceran sampel dilakukan terhadap sediaan yang
akan didentifikasi kemudian ditanam pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri
yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang
sesuai.Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-
300.Total Plate Countdinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan
dikalikan faktor pengencer.
Teknik pengenceran sampel dilakukan pada metode cawantuang (pour plate). Pada
metode tuang, sejumlah sampel dari hasil pengenceran sebanyak 1 ml dimasukkan
kedalam cawan petri, kemudian ditambahkan media yang telah disterilkan sebanyak
15-20 ml. Kemudian cawan petri digoyang agar media dan sampel tercampur rata dan
biarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada
permukaan media yang kaya oksigen, tetapi ada pula yang tumbuh didalam media
yang tidak begitu banyak mengandung oksigen.

Perhitungan

 Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara
25 sampai 250.
 Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan
koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai
satu koloni.

7
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

 Suatu deretan atau rantai koloni yang terlihat seperti suatu garis tebal dihitung
sebagai satu koloni.
Sedangkan data yang dilaporkan sebagai Standard Plate Count (SPC) harus
mengikuti peraturan sebagai berikut (SNI 01-2897-1992):
 Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni
antara 25-250 koloni.
Contoh:
Pengenceran Cawan I Cawan II Keterangan
10-2 150 350 Yang memenuhi syarat
perhitungan adalah
cawan 1
10-3 20 35 Yang memenuhi
syarat perhitungan
adalah
cawan II
Jumlah koloni rata-rata Jumlahkedua cawan yang memenuhi syarat dikalikan
dengan faktor pengencerannya.
Perhitungan Total Plate Countadalah :
(150 x 1/10-2) + (25 x 1/10-3) =(150 x 102) + (25 x 103)
2 2
= 15.000 + 25.000 =20.000
2
Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 20.000 cfu/ml
 Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni ≤25 atau ≥250
maka hitunglah jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor
pengencerannya .
Contoh :
Pengenceran Cawan I Cawan II Jumlah Koloni Rata-
Rata
10-2 200 300 =(200 + 300) x 10-2
2
= 250 x 10-2
10-3 15 25 = (15 + 25) x 10-3
2
= 20 x 10-3

Perhitungan Total Plate Count adalah :

= (250 x 1/10-2) + (20 x 1/10-3) = (250 x 102) + (20 x 103)
2 2
= 25.000 + 20.000
2
= 22.500
Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 22.500 cfu/ml
 Bila cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan
jumlah koloni antara 25-250 hitunglah jumlah koloni dari masing-masing

8
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

tingkat pengenceran, dikalikan dengan faktor pengencerannya dan rata-rata

jumlah koloni dari kedua pengenceran tersebut.
Contoh:
Pengenceran Cawan I Cawan II Jumlah Koloni Rata-rata
10-2 215 225 = (215 + 225) x 10-2
2
= 220 x 10-2
10-3 55 45 = (55 + 45) x 10-3
2
= 50 x 10-3
PerhitunganTotal Plate Countadalah :
= (220 x 1/10-2) + (50 x 1/10-3) = (220 x 102) + (50 x 103)
2 2
= 22.000 + 50.000
2
= 36.000
Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 36.000 cfu/ml
 Bila hasil perhitungan diatas, pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi
diperoleh jumlah koloni rata-rata ≥2kali jumlah koloni rata-rata pengenceran
dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran yang lebih rendah.

 Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Total Plate
Countdinyatakan sebagai <1 dikalikan faktor pengenceran terendah.

 Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni ≥250, dipilih cawan dari tingkat
pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa bagian atau sector
(2,4, atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sektor

9
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Selanjutnya ,Total Plate Count didapatkan dari hasil jumlah koloni dikalikan dengan
jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan
faktor pengenceran .
Contoh:
Jumlah sektor : 4
Pengenceran Cawan I Cawan II Jumlah Koloni
Rata-rata
10-2 Jumlah Jumlah 500 x 102
koloni 100 x 4= koloni 150 x 4 =
400 600
10-3 Jumlah Jumlah 750 x 103
koloni 175 x 4 = koloni 200 x 4 =
700 800

PerhitunganTotal Plate Countadalah :

= (500 x 1/10-2) + (750 x 1/10-3) = (500 x 102) + (750 x 103)
2 2
= 50.000 + 750.000
2
= 400.000 = 40 x 104
Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 40 x 104cfu/ml

Prosedur pelaksanaan praktikum :

Alat :

1. Cawan petri : 12
2. Labu Erlenmeyer : 2
3. Pipet Ukur : 6
4. Tabung reaksi : 4
5. Rak tabung

Bahan :

1. Sample Susu steril da basi

2. PCA sebanyak 250 ml
3. Air steril sebanyak 200 ml

Langkah kerja :

10
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

1. Buatlah media PCA sebanyak 250 ml

2. Buatlah sumbat untuk tabung reaksi dan erlemeyer juga air steril
3. Sterilkan alat-alat seperti cawan petri, pipet ukur, tabung reaksi
4. Sterilkan PCA yang sudah dibuatdan air steril
 Pengenceran
1. Isi tabung reaksi sebanyak 9 ml dengan air steril lalu tempatkan pad arak
tabung
2. Masukan 10 ml sample susu kedalam air steril sebnyak 90 ml pada labu
Erlenmeyer 10 -1
3. Dari 10 -1 ambil 1 ml lalu masukkan kedalam tabung reaksi 1 10 -2 setelah
itu masukan lagi 1 ml kedalam cawan petri
4. Langkah no 3 dilakukan sampai mendapat 10 -5
5. Sample yang berada dicawan petridituang PCA sebanyak 15-20 ml
6. Langkah no 3 dilakukan sampai mendapat 10 -5
7. Buatlah blanko : air steril + PCA
8. Setelah semua cawan petri memadat, posisikan terbalik lalu taruh di inkubasi
pada suhu 37 0 selama 24-48 jam
9. Setelah 48 jam masukan kedalam tabel pengamatan
10. Foto cawan petri kalian sebelum dimasukkan dan sesudah dimasukkan
kedalam incubator

11
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

KD 3 : Mengevaluasi data hasil analisis mikrobiologi dalam bahan alam dan produk
industri dengan metode TPC

Setelah kalian melakukan pengamatan TPC menggunakan sample susu pada KD 2,

lalu datanya dimasukan kedalam tabel dibawah ini !

Jumlah koloni
10_
10_2
Pengenceran 1 10_3 10_4 10_5
Susu Steril
Susu Basi

Syarat jumlah bakteri 25-250 koloni, apabila lebih dari 250 koloni maka
disebut TBUD atau TTH

a. Hitunglah koloni bakteri pada susu ! Perhitunngan dapat kalian lihat

pada tinjaun pustaka pada KD 2
b. Buatlah pembahasan pada praktikum tersebut !
c. Buatlah kesimpulaN pada praktikum tersebut !

Latihan !
1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan TPC ?
2. Jelaskan indicator keberadaan koloni kapang ?
3. Jelaskan langkah kerja TPC menggunakan sampel susu ?
4. Nanda dan teman-teman melakukan pengujian terhadap jamu serbuk yang
dijual di pasar, Tujuan pengujian ini adalah untuk melihat jumlah koloni
kapang pada jamu serbuk yang dijual di pasar, mereka melakukan
pengujian jamu serbuk menggunkan metode TPC. Dari hasil pengujian
TPC Nanda mendapatkan data hasil pengamatan seperti tabel dibawah
ini !

Jumlah koloni / gram

Hari
Sampel pengenceran tingkat Blanko
Tgl
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Senin,
Jamu tbu 69 18 1 1 1 0
06-05-
serbuk d 48 12 1 0 0
2018

12
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Rabu, 08- Jamu tbu 74 26 2 3 3 2

05-2018 serbuk d 59 15 3 2 2

a. Buatlah pembahasan pada data tersebut ?

b. Buatlah kesimpulan pada data tersebut ?
c. Hitunglah koloni pada pengenceran 10-2 dan 10 -3 ?

13
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

KD 4 : Menerapkan pemeriksaan coliform dan identifikasi bakteri E. coli

 Metode MPN
Tujuan praktikum :
1. Siswa dapat menerapkan pemeriksaan coliform dan identifikasi bakteri
2. Siswa dapat memahami proses MPN dalam pemeriksaan coliform

Tinjaun Pustaka

Metode MPN biasanya biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk
padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut (Fardiaz,
1993).
Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya
dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad
renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif
dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam
tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad
renik pembentuk gas.
Dalam metode MPN, pengenceran harus dilakukan lebih tinggi daripada pengenceran
dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang
diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel,
beberapa tabung yang lainnya mengandung lebih dari satu sel atau tabung lainnya
tidak mengandung sel. Dengan demikian setelah inkubasi, diharapkan terjadi
pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan sebagai tabung positif,
sedangkan tabung lainnya negatif.
Pada pengenceran pertama kesembilan tabung menghasilkan pertumbuhan positif
yaitu dengan seri tabung 3-3-3 pada ukuran 10 ml, 1 ml dan 0,1 ml menghasilkan 2-
1-2 tabung yang positif ditumbuhi jasad renik dan pada pengenceran kedua,
kesembilan tabung menghasilkan 1-0-1 tabung yang positif ditumbuhi jasad renik.
Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik tertentu yang
terdapat diantara campuran jasad renik lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan
Lactosa Broth, maka adanya bakteri yang dapat memfermentasi laktosa ditunjukkan
dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasa digunakan untuk
menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman karena bakteri Coliform
termasuk bakteri yang dapat menfermentasi laktosa. (Fardiaz, 1992).
Dalam metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam
praktikum digunakan kelompok koliform sebagai indikator. Metode MPN merupakan
uji deretan tabung yang menyuburkan pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai
untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji. Uji ini diawali dengan
memasukkan 10 ml cairan dari sampel ke dalam lauryl tryptose broth, uji awal ini
disebut uji duga (presumtive test). Dalam uji duga, setiap tabung yang menghasilkan
gas dalam masa inkubasi diduga mengandung bakteri koliform. Uji dinyatakan positif
bila terlihat gas dalam tabung Durham. Tabung yang memperlihatkan gas diuji lebih
lanjut dengan uji peneguhan. Untuk uji peneguhan dilakukan untuk meneguhkan
bahwa gas yang terbentuk disebabkan oleh kuman koliform dan bukan disebabkan
oleh kerja sama beberapa spesies sehingga menghasilkan gas. Uji peneguhan

14
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

menggunakan BGLB (Briliant Green Bile Lactose Broth) yang diinokulasikan dengan
satu mata ose media yang memperlihatkan hasil positif pada uji duga (Lay, 1994).

Prinsip yang digunakan dalam metode MPN

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari
hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang
ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau
diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah
mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.
Contoh :
Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif
dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.
Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu
sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam
dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang
tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah
pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul.
Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang
dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah
sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-
kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung
dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam
media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi
positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada
sampel sebelum diencerkan.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

- bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel
- sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan
(bakteri coliform termasuk E.coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk
rantai).
- media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan
waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung
positif selama masa inkubasi tersebut.
- jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang
terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel
individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa
banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih
cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh
karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi
umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya.
Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus
diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga
akan mempertinggi biaya analisa.

15
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan.

Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk
pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi faecal coliform dan
E coli dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di
dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya
mengizinkan faecal coliform dan E.coli untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian
jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan
bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate
Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC
(Escherichia coli) broth. Berdasarkan prinsip diatas apakah mungkin metode MPN
dapat untuk menghitung jenis bakteri selain jenis-jenis coliform ?

Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang PALING
MUNGKIN.

Aspek peluang dalam metode MPN

Berdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada

pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan
mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil
kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang
didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210
(lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak
pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga

menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel
dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada
gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu
diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang
dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin.

Perbandingannya dengan plate count

Telah disebutkan diatas bahwa MPN cocok untuk sampel dengan konsentrasi
mikroorganisme rendah khususnya dari jenis sampel air, susu, atau makanan

16
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

terutama yang memiliki partikel-partikel yang larut didalamnya. Partikel-partikel

tersebut dimungkinkan mampu mempengaruhi keakuratan perhitungan bakteri jika
menggunakan metode penanaman pada cawan petri. Hal ini karena sel bakteri yang
terpisah dapat mengelompok pada partikel makanan dan mungkin tidak terpisah pada
proses homogenisasi dalam pengenceran bertingkat sehingga saat diplating satu
kumpulan tersebut menjadi satu koloni dan membuat data plate count menjadi bias.
Metode MPN dapat mengeliminasi kekurangan ini.

Prinsip pengujian MPN

Berdasarkan kepada sifat bakteri coli yang sanggup mengahasilkan laktosa hingga
menghasilkan asam dan gas, dapat tumbuh pada media yang mengandung empedu
brilian green dan gram negative bentuk batang .

Bakteri fekal koliform adalah bakteri coli khusus berasal dari usus manusia terutama
yaitu Escherichia coli dapat tumbuh pada suhu 44,50 C.

Alat :

1. Pipet ukur 1 dan 10 ml

2. Cawan petri
3. Incubator
4. Tabung durham
5. Tabung Erlenmeyer

Bahan :

1. Laktosa broth :
Laktosa btoth dengan konsentrasi ganda dan normal. Disiapkan di dalam
tabung reaksi yang dilengkapi tabung durham, isi setiap tabung 10 ml.
2. BGLB :
Isi tiap tabung 10 ml dan dilengkapi tabung durham
3. EMB :
Isi dalam cawan petri

Cara pengujian :

i. Tahap uji prduga ( Presumtive test )

Contoh air dikocok 25 kali, dipipet masing-masing 10 ml kedalam tiap
tabung dari 5 buah tabung media laktosa broth ganda, masing-
masing 1 ml ke dalam tiap tabung dari 5 tabung media laktosa broth
konsentrasi normal dan masing-masing 0,1 ml kedalam tiap tabung
dari 5 buah tabung media laktosa broth konsentrasi normal, semua
tabung diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam. Diamati
terbentuknya gas pada tabung durham

ii. Tahap uji penegasan ( confirmed tes ) untuk coliform

17
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Dari setiap tabung laktosa broth yang terdapat gas, diambil dengan
sengkelit dan diinokulasikan pada media BGLB dan diinkubasi pada
suhu 370C selama 48 jam. Dari BGLB yang terdapat gas diambil
dengan sengkelit dan digoreskan pada permukaan media EMB atau
endo agar dan diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam. Koloni
yan tumbuh dengan ciri-ciri cembung, licin berlendir berwarna merh
atau agak datar, licin berwarna merah berkilat logam pada media
endo atau kecoklatan pada EMB menunjukkan adanya bakteri
coliform. Jumlah tabung yang positif tersebut dicoocokan kepasa
tabel MPN dan dinyatakan sebagai MPN coliform/ 100 ml air.
iii. Tahap uji penegasan ( confirmed test ) untuk fecal coliform
Dari setiap tabung laktosa yang terdapat gas, diambil dengan
sengkelit dan diinokulasikan pada media EC dan diinkubasikan 44,5
0c selama 24 jam. Dari media EC yang terdapat gas diambil dan

digoreskan pada permukaan media EMB agar atau endo agar dan
diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam . Koloni Escherichia
coli mempunyai ciri0ciri licin, datar berkilat legm dan berwarna
kecoklatan pada EMB atau merah pada endo agar.
Koloni coliform pada umurnya lebih cembung, lici, berlendir dan
sedikit berkilat logam. Hasil yang positif baik Escherichia coli atau
coliform pada suhu 44,5 0 tersebut dicocokkan pada tabel MPN dan
dinyatan sebagai MPN fecal coliform/100 ml air.
iv. Uji lengkap ( Complete tes )
Dari pertumbuhn koloni pada agar cawan EMB, dipilih masing-
masing satu koloni yang mewakili Coliform fekal dan satu koloni yang
mewakili coliform non fekal. Uji lengkap dilakukan untuk melihat
apakah isolate yang diambil benar merupakan bakteri coliform. Dari
masing-masing koloni tersebut dibuat pewarnaan gram, dan sisanya
masing-masig dilarutkan ke dalam 3 ,l larutan pengencer steril. Dari
suspense bakteri tersebut masing diinokulasikan menggunakan
jarum ose kedalam tabung berisi laktosa broth dan tabung durham,
dan digoreskan pada agar miring nutrient agar. Tabung
diinkubasikan pada suhu 350C selama 24 jam , dan di amati
pertumbuhan dan pembentukan gas didalam latosa broth
merupakan uji lengkap adanya coliform.

18
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

KD 5 : Mengevaluasi data hasil pemeriksaan coliform dan identifikasi bakteri E. coli

Setelah kalian melakukan praktikum pada KD 4, masukan datanya kedalam tabel, lalu
buatlah !

a. Langkah kerja yang dilakukan !

b. Buatlah pembahasan atas praktikum yang dilakukan !
c. Buatlak kesimpulan atas praktikum yang dilakukan !

Latihan !

1. Keke dan teman-teman melakukan pemeriksaan air isi ulang di kelurahan

kutabaru, Tujuan pemeriksaan ini adalah melihat air isi ulang yang ada di
kelurahan tersebut aman dikonsumsi dan bebas dari bakteri coliform. Sample
yang digunakan adalah 3 sample air isi ulang dari depot isi ulang yang
berbeda, yaitu Sample A diambil pada perumahan tomang baru, Sample B
pada perumahan pondok indah, dan Sample C pada perumahan pondok
permai. Pada pemeriksaan air yang dilakukan menggunakan metode MPN .
Namun karena keterbatasan waktu, Keke dan teman-teman hanya melakukan
2 tes pada sample tersebut.
Dari hasil pemeriksaan sample air menggunakan MPN, Rizki mendapatkan data
pengamatan seperti tabel dibawah ini !

Tabel 1

Sampel LB 100 ml LB 1 ml LB 0,1 ml Pembaca

kombina
si
1 2 3 4 5

Sampel - - + - - - - 1,0,
A 0
Sampel - - - - - - - 0,0,
B 0
Sampel - - - - - - - 0,0,
C 0

19
 Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

Tabel 2

Sampel BGBL pada T 35ºC BGLB pada T 44ºC

Sampel + Ada gas Ada gas

Tabel MPN

5 tabun 1 1 MPN/ 95 bata ……

g tabung % s
tabun 100ml Lebih Lebih
10ml
0,1 ml renda tinggi
g 1ml
h
0 0 0 <2 0 59

0 1 0 2 0,050 13

1 0 0 2,2 0,050 13

1 1 0 4,4 0,5 14
2
2 0 0 5 0,5 19
4
2 1 0 7,6 1,5 19

3 0 0 8,8 1,6 29

3 1 0 12 3,1 30

4 0 0 15 3,3 46

4 0 1 20 5,9 48

4 1 0 21 6,0 53

5 0 0 38 6,4 330

5 0 1 96 12 370

5 1 0 240 12 370

5 1 1 >240 - -

20
Lembar kerja praktikum analisis mikrobiologi | Ambarini roroningtyas, SPd

a. Tabel 1 menunjukkan data hasil tes …. Pada MPN

b. Tabel 2 menunjukkan data hasil tes …. Pada MPN
c. Buatlah langkah kerja yang dilakukan oleh Keke?
d. Buatlah pembahasan pada pemeriksaan air diatas ?
e. Buatlah kesimpulan pada pemeriksaan air diatas ?

21