LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR
(PENENTUAN JUMLAH BAKTERI DAN PEWARNAAN GRAM)

Nama : Kori Nur Ardani

Nim : 1884205022
Kelompok : 4 (Empat)

LABORATORIUM PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS LANCANG KUNING
PEKANBARU
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap

bahwasetiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan
menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan.
Jumlahmikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam
cara,tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Ada 2 macam cara
perhitungan jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak
langsung.Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba
dihitungsecara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup sedangkan
perhitungan jumlah miroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung
secarakeseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk
menentukan jumlah mikroba yang hidup saja, ini tergantung cara-cara yang
digunakan (Anonim, 2013).

Untuk menentukan jumlah miroba yang hidup dapat dilakukan setelah larutan
bahanatau biakan mikroba diencerkan dengan faktor pengenceran tertentu
danditumbuhkan dalam media dengan cara-cara tertentu tergantung dari macam
dansifat-sifat mikroba.Banyak metode yang digunakan dalam menaksir secara
kuantitatif dari suatupopulasi bakteri. Namun, ada dua metode yang paling sering
digunakan yaitu metode hitung koloni di cawan petri (standard/viable plate
count method) dan analisa spektrofotometer /turbidimeter (Anonim, 2013).

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik

pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram
negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah.
Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat
diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai.
Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang
nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai
kondisi menjadi baik (Rudi, 2010).

2
 Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat
mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif
sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya
mekanisme pewarnaan gram. Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba
tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat
menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin, difficidin,
subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan
Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan
penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila
terkontaminasi, dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel
vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau
(Schaechter 2006).

B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah :
1. Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba dengan cara plate count
dan counting chamber.
2. Mahasiswa mengetahui teknik pewarnaan gram.

C. Manfaat
Manfaat dari praktikum ini adalah :
1. Mahasiswa memahami perhitungan mikroba dengan cara plate count dan
counting chamber
2. Mahasiswa memahami cara teknik pewarnaan gram.

3
 II. LANDASAN TEORI

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat

yang disebut medium. Dengan adanya medium pertumbuhan, aktivitas mikrobia
dapat dipelajari dan dengan medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikrobia
dengan kultur murni, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis, dan perhitungan jumlah
mikroba (Sutedjo, 1991).

Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat hara
(nutrien) yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di
dalamnya. Untuk tujuan tersebut sangat diperlukan suatu medium sebagai tempat
tumbuh dan isolasi mikroorganisme. Pembiakan mikroba dalam laboratorium
memerlukan medium yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai
dengan mikroorganisme (Waluyo, 2008).

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan
kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol
sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

4
 III. PELAKSANAAN PRAKTIKUM
A. Tempat dan Waktu
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Pendidikan Biologi, Fakultas
Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Lancang Kuning, Pekanbaru pada hari
Rabu, 4 Desember 2019 pukul 08.00-09.30 WIB.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah :
-Beaker glass -Aluminium Foil
-Erlenmeyer -Pembakaran Bunsen
-Tabung reaksi - Hot plate stirrer atau kompor gas
-Batang pengaduk - Autoklaf
-Cawan petri -Inkubator suhu 37°C
-Neraca -Kawat inokulasi
-Kapas -Vortex
-Labu erlenmeyeer

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah :

-Kristal Violet -Telur Ayam
-Ethanol 96% atau Aseton -Media NA cawan
-Safranin -Aquades
-Larutan Iodium -Alkohol5%

C. Cara Kerja

Prosedur yang dilakukan pada praktikum ini, yaitu:

1. Penentuan Jumlah Bakteri

-Di siapkan alat dan bahan yang diperlukan
-Di siapkan dan beri label larutan pengencer untuk melakukan
pengenceran bertingkat (s.d 10-5 ).

5
 -Di cuci telur utuh dengan air sabun sampai bersih, tiriskan lalu celupkan
ke dalam alkohol 5% selama 10 menit, tiriskan.
-Di pijarkan bagian ujung yang runcing, lakukan di dalam api sebentar,
dan tuangkan seluruh isinya ke dalam gelas piala steril, lalu lakukan
pengenceran bertingkat.
-Di lakukan pemupukan (platting) secara spread dan pour plat.
-Di setelah beku inkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30-32C selama
2-3 hari.
-Di hitung jumlah koloni yang tumbuh.

2. Pewarnaa Gram
-Di buat preparat ulas (smear) yang telah difiksasi dari bakteri gram positif
(misalnya Bacillus subtilis) dan gram negative (misal Escherichia coli).
-Di teteskan Kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua preparat,
usahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama kurang lebih 1 menit.
Teteskan mordant (larutan Iodium) lalu tunggu selama kurang lebih 1
menit. Bilas dengan aquades mengalir.
-Di beri larutan pemucart (ethanol 96% atau aseton) setetes demi setetes
hingga ethanol yang jatuh berwarna jernih (jangan sampai terlalu banyak).
Bilas dengan aquades mengalir.
-Di teteskan counterstain (stranin) dan tunggu sekitar 45 detik. Bilas
dengan aquades mengalir.
-Di keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi
ulasan (jangan sampai merusak ulasan), lalu biarkan mongering di udara.

6
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Adapun hasil yang telah didapatkan dari percobaan penentuan jumlah bakteri
yakni:
No. Gambar Keterangan
1. Kelompok 1 :
Berkoloni 1 = 33
Berkoloni 2 = 10

2. Kelompok 2 :
Bakteri tumbuh tetapi tidak
dapat dihitung karena agar
pecah.

3. Kelompok 3 :
Jumlah Koloni : 30

7
 4. Kelompok 4 :
Jumlah koloni 15

5. Kelompok 5 :
Tidak tumbuh bakteri

Adapun hasil yang telah didapatkan dari percobaan pewarnaan gram, yakni:

Gambar 1. Pewarnaan Gram, mendapatkan graam negative berwarna merah

berbentuk basil atau batang.

8
Gambar 2. Pewarnaan Gram, mendapatkan graam positif berwarna ungu
berbentuk coccus atau bulat.

B. Pembahasan

Mikroba seperti makhluk hidup lainnya memerlukan nutrisi pertumbuhan.

Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan ini akan membantu di dalam
mengkultivasi, mengisolasi, danmengidentifikasi mikroba. Mikroba memiliki
karakteristik dan ciri yang berbeda-beda didalam persyaratan pertumbuhannya.
Ada mikroba yang bisa hidup hanya pada media yang mengandung sulfur dan ada
pula yang tidak mampu hidup dan seterusnya. Karakteristik
persyaratanpertumbuhan mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya
media penunjang pertumbuhan mikroba. Di dalam mikrobiologi, media diartikan
sebagai bahan yang terdiri atas campuran nutrisi atauzat-zat hara (nutrien) yang
digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau didalamnya. Selain
itu, media juda dapat digunakan untuk isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat
fisiologis dan biokimia, serta perhitungan jumlah mikoorganisme.
Ada berbagai macam jenis media pertumbuhan mikroba. Berdasarkan
sumbernya, media di bagi atas dua yaitu media sintetikdan media alami. Dalam
percobaan ini, medium yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba adalah media
agar dengan komposisi 20 gr NA dan 15 gr agar dalam 100 ml aquades. Media
agar adalah mediayang umum digunakan untuk menumbuhkan bakteri,
dikarenakan sifatnya yang dapatmenumbuhkan banyak bakteri, bakteri ini hanya

9
digunakan untuk praktikum di universitas danjarang digunakan untuk penelitian
yang menganalisa pertumbuhan bakteri spesifik. Telah diketahui bersama,
pertumbuhan mikroba adalah peningkatan jumlah sel dan bukan peningkatan
ukuran sel. Pertumbuhan mikroba untuk kondisi normal dapat diukur dengan
rumus log10 jumlah sel. Dari rumus tersebut dapat pula ditentukan jumlah
generasi yang ada dan waktu generasi pertumbuhan bakteri. Rumus ini berlaku
untuk pertumbuhan bakteri yang normal, atau tidak adanya kesalahan dalam
prosedur pembiakannya, dan mengikuti kurva Akan tetapi jika kita melihat hasil
pengamatan yang diperoleh, dapat dipastikan kondisi media yang digunakan
tidaklah sama. Karena bakteri yang tumbuh tidak mengikuti hipotesis pengamat.
Dapat dilihat pada hasil pengamatan, bakteri yang tumbuh pada cawan
pengenceran 10 lebih sedikit dibandingkan bakteri yang tumbuh pada cawan
pengenceran10 dan 10 .Ketidaksamaan media yang digunakan berpengaruh
terhadap aktivitas bakteri untuk melakukanpembelahan sel. Faktor yang
menyebabkan ketidaksamaan ini salah satunya dipengaruhi olehprosedur
pengerjaan yang tidak benar oleh pengamat. Dari hasil pengamatan yang
diperoleh terdapat 2 koloni bakteri yang diperoleh, yakniberwarna putih dan
berwarna kuning. Jumlah koloni bakteri berwarna putih dalam satu cawan selalu
lebih banyak dibandingkan jumlah koloni bakteri kuning. Aktivitas anatara kedua
jenis kolonibakteri ini menjadi sangat sulit ditentukan karena kondisi media yang
berbeda-beda. Semestinyadalam cawan tanpa pengenceran, cawan pengenceran
10, 10 dan 10, dapat dianalisa aktivitaskoloni bakteri putih dan kuning, yang mana
bersifat inhibitor atau patogen terhadap bakteri lainnya.

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan

paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan gram menggunakan 4 macam
zat pewarna yaitu meliputi Cibol Getian Violet sebagai pewarna
primer, Iodium sebagai pewarna sekunder, Alkohol sebagai larutan

10
pemucat, Safranin sebagai pewarna pembanding. Jenis bakteri berdasarkan
pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri
gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan
baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak. Bakteri gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri
jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.
Umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat
dengan cahaya karena tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna dapat
mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan
sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat sulit
sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas
dan mudah diamati (Karmana 2007). Faktor-faktor yang mempengaruhi
pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat pewarna penutup.
Pada praktikum kali ini dilakukan teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada
bakteri. Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Bacillus SP) dengan tujuan
agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk
melekatkan mikroorganisme di kaca preparat. Sedangkan pemberian Iodium
bertujuan untuk memperkuat warna pada bakteri. Alkohol 96% berfungsi sebagai
pemucat atau peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian
safranin yang berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah
kehilangan warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol. Pada

11
bakteri di preparat menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri
di preparat merupakan bakteri gram positif dikarenakan pada bakteri ini
mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal
ungu. Jika berwarna merah muda menunjukan bakteri gram negatif dikarenakan
pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan
safranin.
Hasil uji bakteri agar miring atau Bacillus sp dapat mempertahankan warna
primernya walaupun mengalami dekolorisasi(pencucian) ketika ditambahkan
alkohol sehingga bakteri Bacillus sp merupakan kelompok bakteri gram
positif. Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat
warna dan penambahan larutan pencuci.

12
 V. PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan didapatkan kesimpulan sebagai
berikut:
1. Setelah melakukan praktikum ini kami dapat mengetahui dan memahami
prosedur pewarnaan gram dan pengelompokan bakteri. Basillus
merupakan bakteri gram positif, dikarenakan pada bakteri ini
mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan
kristal ungu. Sehingga pada saat sampai pewarnaan terakhir bakteri
berwarna biru atau ungu.
2. Mikroba seperti makhluk hidup lainnya memerlukan nutrisi pertumbuhan.
Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan ini akan membantu di dalam
mengkultivasi, mengisolasi, danmengidentifikasi mikroba. Mikroba
memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda didalam persyaratan
pertumbuhannya.

B. Saran

1.Sebelum melakukan praktek di laboratorium sebaiknya praktikan

mempelajari terlebih dahulu teori untuk mengetahui jumlah koloni bakteri
pada sampel air PAM dan sampel daging ayam broiler.

2.Dalam melaksanakan praktikum, diharapkan asisten selalu mendampingi

prakrikan agar praktikan lebih dapat memahami.

3.Dalam pelaksanaan praktikum, diharapkan waktu diperpanjang

agar praktikan dapat dengan maksimal mengetahui mengrtahui jumlah
koloni bakteri yang diamati pada sampel tertentu.

13
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2013.”Perhitungan Jumlah Bakteri”.httpwww.scribd.comdoc135885742

perhitungan-jumlah-bakteri=htm.

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).
Karmana.2007.Biologi.Jakarta:PT Grafindo Media Pratama

Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. http: //pebrinmanurung.

Rudi, 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya. http: // rudyregobiz.

wordpress.com/ bakteri-gram-dan-pewarnaannya-2/.

14