PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM

IDENTIFIKASI MIKROBA

Oleh

Bayu Apriliwan
05031281320017

TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SRIWIJAYA

INDRALAYA
2014
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Identifikasi mikroba merupakan salah satu tugas yang lazim dilakukan di laboratorium
mikrobiologi.Bakteri memiliki beberapa macam bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, dan
spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada
bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus
dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya
dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Mikroorganisme yang ada di alam ini
mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri
yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan.
Uji biokimiawi bakteri adalah salah satu uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi jenis
bakteri. Hal ini karena setiap jenis bakteri memiliki sifat biokimia yang berbeda. Secara
morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu ciri
fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen
yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organisme yang
diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Manusia tidak dapat melihat
dan mengidentifikasi bakteri tanpa diadakan percobaan.

B. Tujuan Percobaan
Memahami cara melakukan pewarnaan garam.

II. TINJAUAN PUSTAKA

 Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan
bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram
tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel
sepertiMycoplasma sp .Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu
pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam :
Biakan muda). Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan
gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi
dapat mempertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif. Umumnya
zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan
positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi
dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion
positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna
adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna
basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki
muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif
banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan
muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).Zat warna asam yang bermuatan
negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya
dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan positif, perlu diperhatikan
bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH
sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang
terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel
yang bermuatan Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu: Isolasi Pada Cawan Agar
:Prinsip metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga
diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari mikroorganisme lain. Setiap koloni yang
terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat
beberapa cara dalam metode isolasi pada cawan agar, yaitu: metode gores kuadran dan metode
agar cawan tuang. Metode gores kuadran bila metode ini dilakukan dengan baik akan
menghasilkan terisolasinya mikroorganisme dimana setiap koloni berasal dari satu sel.
(Dwidjoseputro.1998)
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan
positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan
positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar
belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan
melakukan preparat ulas Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek.
Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak
sehingga dapat terlihat .Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri
yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal dari bukan media padat. Sebaliknya
pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari
bakteri pada preparatnya .Metode agar tuang berbeda dengan metode gores kuadran, cawan
tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan 50oC, yang kemudian
dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung
koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan. -Isolasi Pada Medium Cair :
Metode ini dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat),
tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan
beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran, peluang untuk mendapatkan satu sel
semakin besar.-Isolasi Sel Tunggal :Metode ini dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme
berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode cawan atau medium cair. Sel
mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. (Waluyo, 2004).

III. METODOLODI PRAKTIKUM

A. Waktu Dan Tempat

 Praktikum identifikasi mikrobia ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 13 dan 20
Oktober 2014 pukul 10.00 WIB sampai dengan pukul 12.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi,
Jurusan Teknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya.

B. Bahan Dan Alat

a. Identifikasi Bakteri
1. Pewarnaan Gram
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah Biakan hasil isolasi (Bakteri E.coli
dan Bakteri Eureus).
Alat yang digunakan adalah 1). Bak Pewarna 2 ). Jarum Ose 3). Kaca Objek 4). Kertas Serap
5). Mikroskop Majemuk 6). Minyak Celup
2. Uji Katalase
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah Biakan hasil isolasi dan hidrodgen
peroksida (H2O2).
Alat yang digunakan adalah 1). Jarum Ose dan 2). Kaca Objek bersih
b. Identifikasi Jamur
Bahan yang digunakan adalah 1) Alumunium Foil, 2) Alkohol, 3) Ampicilyn, 4) Aquadest
Steril, 5) Lactophenol Blue, 6) Media PDA steril, 7) Kapas , 8)Karet Gelang, 9) Kertas Tissue
Steril, 10) Spiritus, 11)Wrapping.
Alat yang digunakan adalah 1). Cawan Petri Steril 2). Cover Glass Steril 3). Jarum Ose 4).
Kaca Objek 5). Spatula.

C. Cara Kerja
a. Identifikasi Bakteri
1. Pewarnaan Gram
 Cara kerja pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1) Kaca objek yang bersih disiapkan.
2) Disiapkan 2 olesan bakteri pada kaca objek dengan jarak antara kedua olesan tersebut paling
sedikit 2 cm.
3) Kaca objek tersebut difiksasi diatas bunsen selama beberapa menit.
4) Setelah difiksasi, kaca objek diletakkan diatas rak kawat bak pewarna.
5) Olesan bakteri digenangi dengan pewarna primer yaitu ungu krystal selama 1 menit.
6) Menggunakan pinset, kaca objek dimiringkan diatas rak pewarna untuk membuang kelebihan
ungu krystal lalu dibilas dengan aquadest.
7) Kaca objek ditiriskan dan kembalikan ke atas rak kawat pada bak pewarna.
8) Olesan kemudian digenangi dengan larutan iodium selama 2 menit dan kemudian lakukan
seperti langkah 6.
9) Olesan dicuci dengan larutan pemucat tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna
ungu kristal tidak terlihat mengalir lagi.
10) Cuci kembali dengan aquadest dan ditiriskan.
11) Lalu genangi dengan safranin sebagai pewarna tandingan selama 30 detik.
12) Lakukan kembali langkah 6 dan langkah 7.
13) Olesan bakteri diamati warnanya, apakah berwarna biru gelap atau ungu (gram positif) atau
bewarna merah muda (gram megatif).
2. Uji Katalase
Cara kerja pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1) Kaca Objek yang bersih disiapkan.
2) Dua tetes hidrogen peroksida diletakkan diatas kaca objek, kemudian secara aseptik biakan
murni bakteri dipindahkan keatas tetesan hidrogen peroksida dengan jarum ose.
3) Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang menunjukkan
bahwa mikrobia tersebut menghasilkan enzim katalase yang mengubah hidrogen peroksida
menjadi air dan O2.

b. Identifikasi Jamur
Cara kerja pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1) Media PDA steril sebanyak 5 ml disiapkan secara aseptis kedalam cawan petri dan dibiarkan
hingga membeku.
2) Media PDA steril yang telah beku dipotong persegi dengan ukuran 1cm x 1cm, diletakkan
diatas kaca objek yang telah disterilkan terlebih dahulu.
3) Diambil satu mata ose jamur yang akan dibiakkan kemudian digoreskan pada keempat sudut
PDA steril diatas kaca objek, kemudian ditutup dengan kaca penutup yang telah disterilkan.
4) Cawan petri steril disiapkan pada bagian dalamnya dialasi dengan kertas tissue steril kemudian
ditetesi dengan 5 ml aquadest steril.
5) Kaca objek yang telah berisi biakan jamur dimasukkan kedalam cawan petri kemudian ditutup
dan diberi wrapping pada sekeliling pinggir bagian penutup untuk mencegah kontaminan.
6) Inkubasi pada suhu kamar selama 48 jam.
7) Setelah 48 jam, kaca objek yang berisi biakan dikeluarkan dari cawan petri, medianya dibuang.
Kaca objek ditetesi dengan satu tetes lactophenol blue, tutup dengan kaca penutup biarkan
selama 1 jam supaya larutan lactophenol blue meresap kedalam hipa jamur.
8) Diamati struktur jamur dengan menggunakan mikroskop yang meliputi bentuk hipa, spora dan
konidia jamur.

B. Pembahasan

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan
pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar
yang berlaku Setiap sel terdiri dari berbagai bahan kimia. Setiap sel akan menunjukkan susunan
kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh, bakteri Gram negatif memiliki lipopolisakarida dalam
dinding selnya, Sedangkan bakteri Gram positif tidak. Sebaliknya pada banyak bakteri Gram
positif terdapat asam teikoat
Teknik pewarnaan kuman yang kami lakukan pada praktikum ini adalah teknik
pewarnaan sederhana dan teknik pewarnaan gramteknik ini bertujuan untuk mengidentifikasi
suatu bakteri apakah dia termasuk ke dalam bakteri gram negatif atau bakteri gram positif.
Langkah-langkah dalam pewarnaan ini hampir sama dengan langkah pada pewarnaan sederhana
yakni membuat preparat oles dari ketiga bakteri diatas. Bedanya adalah pada beberapa reagen
yang ditambahkan. Pertama, bakteri pada preparat ditetesi kristal violet selama 1 menit. Lalu
kelebihan kristal violetdibuang dengan memiringkan kaca objek dan bilas dengan air mengalir
secara perlahan. Preparat ditiriskan, lalu diberi larutan iodium gram selama 2 menit, kelebihan
iodium dibuang dengan memiringkan kaca objek lalu dibilas dengan air seperti kristal violet.
Langkah selanjutnya adalah preparat dicuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30
detik atau sampai zat ungu kristal tidak tampak lagi mengalir dari preparat, setelah dirasa warna
menghilang cuci perlahan lalu tiriskan. Terakhir adalah dengan menambahkan pewarna safranin
selama 30 detik pada preparat, kemudian kelebihan safranin dibuang dan dibilas dengan air.
Preparat yang masih basah ditiriskan dan diserap dengan menekankan kertas serap
disekitarnya.Amati preparat olesan bakteri yang sudah diwarnai tersebut di bawah mikroskop.

V. KESIMPULAN

Dari percobaan ini, dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:

 1. Untuk bakteri yang termasuk gram positif akan terlihat berwarna ungu, dimana warna ungu ini
sendiri merupaka warna dari kristal violet yang sebelumnya diteteskan, warna ini melekat
dengan kuat karena peptidoglikan dari bakteri gram positif tebalMetode sterilisasi antara lain
secara fisik, kimia, dan mekanik.
2. untuk bakteri gram negatif akan terlihat warna merah, dimana warna merah ini merupakan warna
dari pewarna safranin yang diteteskan terakhir kali, warna ini melekat dan warna ungu sama
sekali tidak terlihat karena peptidoglikan dari bakteri gram negatif relatif tipis sehingga ia tidak
mampu mempertahankan warna ungu layaknya bakteri gram positif.
3. Morfologi yang ditunjukkan koloni kuman dapat diidentifikasi dengan metode piringan goresan,
metode piringan tuangan, metode tusukan agar tegak, metode agar miring goresan, metode
medium cair.
4. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
5. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.2005. Dasar Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Jakarta.

Hadioetomo. Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: P.T. Gramedia Pustaka
Utama.
Hadioetomo, Ratna Siri.1990.Mikrobiologi dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

Lay, Bibiana.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali

Sutedjo, Mul Mulyani.1991. Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta

Volk, W. A. dan Wheeler, M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.
Waluyo,Lud.2004.Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa macam bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk
basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi
dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Mikroorganisme yang ada di alam ini
mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri
yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan
pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar
yang berlaku.

Setiap sel terdiri dari berbagai bahan kimia. Setiap sel akan menunjukkan susunan
kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh, bakteri Gram negatif memiliki lipopolisakarida dalam
dinding selnya, Sedangkan bakteri Gram positif tidak. Sebaliknya pada banyak bakteri Gram
positif terdapat asam teikoat. Bahan kimia ini tidak ditemukan pada gram negatif. Karakteristik
utamanya adalah tebalnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel. Akibatnya, pada saat prosedur
pewarnaan Gram, meninggalkan warna biru. Dinding sel Gram positif biasa ditemukan pada
Actinobacteria dan Firmicutes. Tidak seperti dinding sel Gram positif, dinding sel Gram negatif
memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Hal ini menyebabkan lunturnya warna biru/merah
muda saat disiram etanol.
Uji biokimiawi bakteri adalah salah satu uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi jenis
bakteri. Hal ini karena setiap jenis bakteri memiliki sifat biokimia yang berbeda. Secara
morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu ciri
fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen
yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organisme yang
diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Manusia tidak dapat melihat
dan mengidentifikasi bakteri tanpa diadakan percobaan.
 Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-
metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Kemampuan bakteri menggunakan
senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energiyang dapat digunakan untuk
identifikasi.Identifikasi Bakteri dapat dilakukan dengan beberapa uji antara lain uji dalam
melakukan fermentasi, uji oksidase, produksi katalase, uji motilase dan uji oksidase.
Bakteri di alam memiliki karakteristik sifat yang berbeda-beda. Bakteri ada yang bersifat
motil, bereaksi dengan enzim katalase, bersifat oksidatif maupun fermentatif dan lain
sebagainya. Tiap bakteri juga memiliki sifat kimiawi berbeda. Berdasar dari hal tersebut diatas,
maka diadakanlah praktikum Uji Biokimiawi Bakteri ini guna memberikan pemahaman
kepada kita tentang hal-hal yang berkaitan dengan sifat-sifat biokimiawi bakteri serta menambah
pengetahuan dan keterampilan kita dalam mengenal karakter berbagai jenis bakteri.

1.2 Rumusan Masalah.

1.2.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan.

1. Apa saja jenis-jenis pewarnaan pada kuman ?

2. Bagaimana langkah-langkah pembuatan preparat oles dan teknik pewarnaan pada kuman ?
3. Apa perbedaan dari bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif ?

1.2.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia

1. Apa sifat morfologi yang ditunjukkan koloni kuman ?

1.3 Tujuan Praktikum

1.3.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan.

1. Mahasiswa mengenal macam-macam pewarnaan pada kuman

2. Mahasiswa dapat melakukan langkah-langkah pembuatan preparat oles dan teknik pewarnaan
pada kuman.
3. Mahasiswa dapat mengetahui perbedaan bakteri gram negatif dan bakteri gram positif.

1.3.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia.

1. Mahasiswa memahami sifat morfologi yang ditunjukkan koloni kuman.

 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan

terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya,
hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari
pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran
jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna
yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri
gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak
bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
(Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam : Biakan muda). Bila
digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan
tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel
ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti
bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan
crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif. Umumnya zat warna yang
digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif
dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat
pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka
zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion
negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan
positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif
banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan
muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan
pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan
negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai
bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna
terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan
(Dwidjoseputro.1998).
 Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan
positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan
positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar
belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan
melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga
dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah
menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal dari
bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan
diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah
pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan
dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi
digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan
zat warna basa seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau
malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam
yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah
dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan
pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan
spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat
terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( staphylococcus), pasangan
(diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau
nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan
tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Sel terdiri dari berbagai bahan kimia. Bila sel mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka
sel ini memperlihatkan susunan kimiawi yang spesifik. Sifat kimiawi pada susunan sel bakteri,
mencakup kepada :
1. Membran Sel Prokariotik
Pada beberapa bakteri, membran mengelilingi sitoplasma tanpa menunjukkan adanya lipatan.
Membran pada bakteri lain mengalami pelipatan ke dalam yang disebut mesosom. Pada bakteri
fotosintetik, klorofil tidak terdapat dalam suatu kloroplas, melainkan terdapat dalam membran
yang sangat berlipat-lipat di dalam sel, yang disebut membran tilakoid. Sistem fotosintetik pada
bakteri disamping menggunakan klorofil, juga karotenoid. Keduanya mengandung sistem
transport elektron yangmenghasilkan ATP pada proses fotosintesis.
2. Dinding Sel
Dinding sel bakteri bersifat agak elastis dan tidak bersifat permeable terhadap garam dan
senyawa tertentu dengan berat molekul rendah. Secara normal konsentrasi garam dan gula yang
menentukan tekanan osmotik di dalam sel lebih tinggi daripada di luar sel. Apabila tekanan
osmose di luar sel naik, air sel akan mengalir keluar, protoplasma mengalami pengkerutan, dan
membran akan terlepas dari dinding sel. Proses ini disebut dengan plasmolisis. Dinding sel
bakteri gram positif: Dinding sel bakteri gram positif terdiri 40 lapis rangka dasar murein,
meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun dinding sel gram
positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan asam teikoat yang sangat spesifik.
Dinding sel bakteri gram negatif: Dinding sel bakteri gram negatif hanya terdiri atas satu lapis
rangka dasar murein, dan hanya meliputi + 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya
mengandung diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut
terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain. Senyawa-senyawa ini
merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak terdapat dalam dinding sel ini.
3. Flagel dan Pili
Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Letak flagel dapat polar, bipolar, peritrik, maupun
politrik. Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun flagel adalah sub unit
protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah. Ukuran flagel berdiameter
12-18 nm dan panjangnya lebih dari 20 nm. Pada beberapa bakteri, permukaan selnya dikelilingi
oleh puluhan sampai ratusan pili, dengan panjang 12 nm. Pili disebut juga sebagai fimbrae. Sex-
pili berperan pada konjugasi sel. Pada bakteri Escherichia coli strain K-12 hanya dijumpai 2
buah pili.
5. Kapsul dan Lendir
Beberapa bakteri mengakumulasi senyawa-senyawa yang kaya akan air, sehingga membentuk
suatu lapisan di permukaan luar selnya yang disebut sebagai kapsul atau selubung berlendir.
Fungsinya untuk kehidupan bakteri tidak begitu esensial, namun menyebabkan timbulnya sifat
virulen terhadap inangnya. Keberadaan kapsul mudah diketahui dengan metode pengecatan
negatif menggunakan tinta cina atau nigrosin. Kapsul akan tampak transparan diantara latar
belakang yang gelap. Pada umumnya penyusun utama kapsul adalah polisakarida yang terdiri
atas glukosa, gula amino, rhamnosa, serta asam organik seperti asam piruvat dan asam asetat.
Ada pula yang mengandung peptida, seperti kapsul pada bakteri Bacillus sp. Lendir merupakan
kapsul yang lebih encer. Adakalanya kapsul bakteri dapat dipisahkan dengan metode
penggojokan kemudian diekstrak untuk menghasilkan lendir.
Selain melalui struktur sel, kita juga dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan sifat
kimiawi melalui proses pewarnaan. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang
salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya
dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.
Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna
terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen
blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -,
CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih
cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-
bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif
menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat
warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras
seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat
yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan
dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat
warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan
oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat
diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut
tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Berikut adalah pengujian yang dapat dilakukan kepada bakteri :

1. Uji Biokimia

a. Uji oksidasi fermentasi

Uji oksidatif- fermantatif digunakan untuk menguji metabolisme bakterioksidatif atau
fermentatif. Proses oksidasi terjadi didalam tabung oleh organismeaerob dan proses fermentasi
oleh organisme anaerob. Proses fermentasi glukosa akan diubah menjadi glukosa G-Phospat
yang kemudian dirombak menjadi asam piruvat dan oksidase akan merubah glukosa menjadi
asam piruvat

b. Uji motilitas
Motilitas bakteri adalah suatu gerakan bakteri yang disebabkan adanya gerak aktif dan
pasif. Gerak aktif adalah gerakan bakteri yang disebabkan karena bakteri memiliki flagel. Gerak
pasif disebabkan karena faktor dari luar (gerak brown). Gerak brown adalah suatu gerakan yang
dapat menggetarkan partikel-partikel secara acak atau terarah karena terus-menerus terkena
pukulan molekul-molekul kecil yang tak terlihat yang terdapat dalam cairan.Motilitas dapat
diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang sudah lama,bakteri sudah
mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang motil, selain itu produksi asam dan
produk yang bersifat racun dapat menyebabkan hilangnya motalitas sel bakteri pada biakan
(Volk, 1988).

Menurut Taringan (1988) beberapa bakteri dapat melakukan gerakan meluncur yang sangat
mulus yang hanya terjadi kalau persentuhan dengan benda padat. Kebanyakan bakteri yang motil
dapat mendekati atau menjauhi berbagai senyawa kimia yang disebut kemotaksis.

c. Uji katalase
Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji.
Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H 2O2 menjadi H2O dan
 O2. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik karena H 2O2 yang dibentuk
dengan pertolongan berbagai enzim pernafasan bersifat racun terhadap sel mikroba.

2. Hidrogen peroksida dan paraffin

Hidrogen peroksida dengan rumus kimia H2O2 ditemukan oleh Louis Jacques Thenard di
tahun 1818. Senyawa ini merupakan bahan kimia anorganik yang memiliki sifat oksidator kuat.
Bahan baku pembuatan hidrogen peroksida adalah gas hidrogen (H 2) dan gas oksigen (O2).
Teknologi yang banyak digunakan di dalam industri hidrogen peroksida adalah auto oksidasi
Anthraquinone. H2O2 tidak berwarna, berbau khas agak keasaman, dan larut dengan baik dalam
air. Dalam kondisi normal (kondisi ambient), hidrogen peroksida sangat stabil dengan laju
dekomposisi kira-kira kurang dari 1% per tahun.
Mayoritas pengunaan hidrogen peroksida adalah dengan memanfaatkan dan merekayasa
reaksi dekomposisinya, yang intinya menghasilkan oksigen. Pada tahap produksi hidrogen
peroksida, bahan stabilizer kimia biasanya ditambahkan dengan maksud untuk menghambat laju
dekomposisinya. Termasuk dekomposisi yang terjadi selama produk hidrogen peroksida dalam
penyimpanan. Selain menghasilkan oksigen, reaksi dekomposisi hidrogen peroksida juga
menghasilkan air (H2O) dan panas. Reaksi dekomposisi eksotermis yang terjadi adalah sebagai
berikut:

H2O2 ----> H2O + 1/2O2 + 23.45 kcal/mol

Faktor-faktor yang mempengaruhi reaksi dekomposisi hidrogen peroksida adalah:

o Bahan organik tertentu, seperti alkohol dan bensin
o Katalis, seperti Pd, Fe, Cu, Ni, Cr, Pb, Mn
o Temperatur, laju reaksi dekomposisi hidrogen peroksida naik sebesar 2.2 x setiap kenaikan 10 oC
(dalam range temperatur 20-100oC)
o Permukaan container yang tidak rata (active surface)
o Padatan yang tersuspensi, seperti partikel debu atau pengotor lainnya
o Makin tinggi pH (makin basa) laju dekomposisi semakin tinggi
o Radiasi, terutama radiasi dari sinar dengan panjang gelombang yang pendek
Hidrogen peroksida bisa digunakan sebagai zat pengelantang atau bleaching agent pada industri
pulp, kertas, dan tekstil. Senyawa ini juga biasa dipakai pada proses pengolahan limbah cair,
industri kimia, pembuatan deterjen, makanan dan minuman, medis, serta industri elektronika
(pembuatan PCB).
Parafin, merupakan hidrokarbon jenuh dengan rantai terbuka dan merupakan senyawa
alkana. Parafin adalah campuran senyawa hidrokarbon alkana yang mengandung 21-50 atom
karbon. Ketika pemisahan residu minyak bumi, jumlah atom karbon pada lilin parafin berkisar
40-50 atom. Komposisi dari setiap anggota senyawa alkana tersebut menyesuaikan dengan
rumus CnH2n+2, yang mana n adalah jumlah atom karbon dalam molekul. Di antara anggota dari
senyawa yaitu metana (CH4); etana (C2H6); propana, (C3H8); dan butana, (C4H10).
Seluruh anggota senyawa alkana adalah anreaktif; yaitu, mereka tidak bereaksi siap pada
temperatur biasa dengan seberapa bahan reaksi seperti asam, alkali, atau pembuat proses
oksidasi. Pertama, empat anggota senyawa memasang gas pada temperatur dan tekanan biasa;
anggota intermediate (setara) adalah mencairkan; dan anggota lebih berat adalah semipadat atau
padat. Petroleum mengandung sekumpulan variasi hidrokarbon dan beberapa produk petroleum
seperti bensin, minyak tanah, minyak bakar berat, minyak pelumas, vaselin, dan parafin berisi
terutama dari campuran hidrokarbon parafin, yang terbentang dari anggota cair yang lebih ringan
ke anggota yang padat. Parafin adalah suatu campuran dari hidrokarbon yang dipenuhi massa
molekular yang tinggi, diproduksi selama penyulingan dari minyak/petroleum.

Bakteri memiliki sifat-sifat yang berbeda satu sama lain, berikut ini akan dijelaskan sifat-sifat
dari bakteri :

1. Bakteri Fototrofik
Bakteri ini dicirikan memiliki Bacterioklorofil, sehingga dapat melakukan fotosintesis.
Bentuk : bulat, batang, vibrio atau spiral. Gram negative. Reproduksinya dg pembelahan biner.
Bergerak dengan flagella atau non motil. Habitat lingkungan aquatic.

2. Bakteri Luncur
Kelompok ini diwakili oleh beberapa tipe yang tidak umum. Myxobacteriales
(miksobacter) menghasilkan apa yang disebut tubuh buah terdiri dari lendir dan sel. Sel individu
dapat meluncur pada permukaan padat tetapi tidak punya flagella. Contoh lain Cytophagales,
memperlihatkan gerakan meluncur.Bentuk: batang, bola atau filament. Gram negative. Sel-sel
dapat terbenam dalam lendir. Habitat: tanah, sisa bahan tumbuhan membusuk, lingkungan
aquatic.

3. Bakteri Berselongsong
Sel terbungkus dalam selongsong yang terbuat dari deposit senyawa, senyawa besi dan
mangan yang tak larut. Bentuk: batang atau seperti filament. Gram negative. Bergerak dengan
flagella atau non motil.Beberapa membentuk pelekap /dasar penghisap untuk menempelkan diri
pada permukaan. Habitat lingkungan aquatic dan lumpur.

4. Bakteri Kuncup dan atau Berapendiks

Sel dengan prosteka atau pelekap. Reproduksi dengan berkuncup atau membelah. Bentuk
sel: bola, oval, batang dengan ujung meruncing, beberapa menunjukkan pertumbuhan sepertii
hifa. Motil karena flagella kutub atau non motil. Habitat: tanah dan lingkungan aquatic.

5. Spiroket
Sel langsing lentur berpilin (dinding tak kaku). Banyak spesies gram negative.
Perbanyakan dengan Pembelahan melintang. Motil karena rotasi cepat sepanjang sumbu panjang
spiralnya ataupun karena lenturan sel-selnya, gerak obeng. Habitat: Saprofit: tanah, lingk.
Aquatic sedang yang parasit hidup di jaringan atau organ vascular pada tubuh termasuk daerah
genital dan system saraf pusat pada manusia dan hewan. Contoh: Treponema pallidum penyebab
penyakit sifilis.

6. Bakteri Spiral dan Lengkung

Bentuk batang berpilin( coma) beberapa dengan satu atau lebih putaran lengkap (dinding
sel kaku). Gram negative. Motil karena ada flagella. Habitat: saprofit di lingkungan aquatic, dan
yang parasit hidup di organ reproduktif, saluran pencernaan dan mulut hewan termasuk manusia.
Contoh: Campylobacter fetus
7. Bakteri Batang dan Kokus Aerobik Gram Negatif
Sel bentuk batang, lonjong, bola, dimensi khas untuk bakteri yaitu 0,5-1,0 m. Motil
karena berflagela, atau nonmotil. Gram negative. Aerobic. Ciri-ciri metabolic khusus pada
berbagai spesies; beberapa dapat menambat nitrogen dari udara; beberapa dapat mengoksidasi
senyawa-senyawa berkarbon satu, misalnya metan atau methanol; beberapa dapat
menghancurkan berbagai macam senyawa. Habitat: Saprofit di tanah dan lingkungan aquatic, air
asin, sedangkan yang parasit bersifat pathogen pada hewan dan manusia, contoh: Brucella dapat
menyebabkan keguguran pada hewan dan dapat menginfeksi manusia. Francisella tularensis
penyebab penyakit tularemia (demam kelinci) dapat menular ke manusia melalui luka iris atau
tergores.

8. Bakteri Batang anaerobik fakultatif gram negatif

Sel batang pendek ( 0,5-1,0 x 1,0-3,0 m). Motil: selnya peritrikus (E. coli) dan nonmotil.
Anaerobic fakultatif. Gram negative. Habitat: Saprofit di lingkungan aquatic, tanah, makanan,
parasit bersifat pathogen terutama di saluran pencernaan makanan dan terbawa keluar melalui
faeses dan atau urine. Contoh: Escherichia coli, shigella spp., Salmonella spp., Yersinia pestis,
Vibrio cholera

9. Bakteri gram negatif anaerobik

Sel bentuk batang lurus atau lengkung, kadang memperlihatkan sifat pleomorfik ( adanya
berbagai bentuk dalam spsies yang sama). Motil selnya peritriks atau monotrik, dan beberapa
spesies nonmotil. Ciri biokimiawi banyak sekali produk yang dihasilkan dari fermentasi glukosa.
Anaerob obligat. Habitat: rongga alamiah pada manusia dan hewan, dan saluran pencernaan
serangga. Contoh: Bacteriodes, Fusobacterium

10. Bakteri Kokus dan Kokobasillus gram negatif

Sel kokus berpasangan (diplokokus) dan dalam massa, beberapa kokobasil (batang pendek)
terdapat tunggal atau berpasangan. Nonmotil, Gram negative. Aerobic.
Ciri biokimiawi berkemampuan terbatas untuk merombak berbagai senyawa (kh, protein dll).
Habitat di selaput lendir manusia dan hewan, kadang bersifat pathogen. Contoh: Neisseria
gonorhoeae, N. meningitidis, Moraxella .

11. Bakteri Kokus anaerobik gram negatif

Penetapan kelompok ini berdasarkan ciri-ciri biokimiawi biakan. Sel ada yang sangat kecil
(0,3-0,5m) sampai sel bulat yang besar (2,5m) berpasangan (dlm massa) atau rantai.
Nonmotil. Anaerobic. Ciri biokimiawi merombak kh dan as. Lemak. Habitat dianggap parasit di
saluran pernafasan dan pencernaan manusia dan hewan, tapi tidak pathogen. Contoh: Veillonella,
Megasphaera.

12. Bakteri gram negatif kemolitotrofik

Kelompok ini berkemampuan untuk menghasilkan energy dari oksidasi zat-zat kimia
anorganik (kemolitotrofik). Morfologi sel beragam: bulat, batang, spiral, membrane berlapis
banyak pada beberapa spesies, bakteri pengoksidasi belerang dapat menyimpan butir-butir
belerang. Motil karena berflagela atau nonmotil. Gram negative, habitat: tanah, limbah ,
lingkungan aquatic, lingkungan alamiah yang banyak mengandung belerang, besi atau mangan,
misalnya air tambang asam dan sumber air panas belerang. Contoh: Nitrobacter, Nitrococcus,
Nitrosobolus dan Thiospira.

13. Bakteri penghasil metan

Ciri kelompok ini kemampuannya menghasilkan metan, yaitu gas yang dibentuk dalam
keadaan anaerobic. Morfologi sel: bola, batang dan spiral. Motil karena flagella kutub atau
nonmotil. Gram negative atau gram positif. Anaerobic. Beberapa spesies termofilik. Habitat:
saluran gastrointestinal pada binatang, endapan pada lingkungan aquatic dan limbah. Contoh:
Methanobacterium thermoauto-trophicus, M. ruminantium, Methanospirillum, Methanosacina
barkeri.

14. Bakteri Kokus gram positif

Kelompok ini banyak spesies patogenik penting bagi manusia dan hewan. Sel bentuk
kokus tunggal, berpasangan dalam rantai, paket atau gerombol. Nonmotil. Gram positif.
Anaerobic fakultatif atau mikroaerofilik. Heterotrofik dengan persyaratan nutrient luas. Habitat:
tanah, air tawar, kulit dan selaput lender pada binatang berdarahpanas termasuk manusia.
Contoh: Sarcina, Streptococcus, Leuconostoc, Staphylococcus.

15. Bakteri Batang dan Kokus pembentuk endospora

Ciri pembeda kelompok ini adalah kemampuannya membentuk endospora. Kebanyakan
spesies berbentuk batang, ada yang bulat dalam bentuk paket. Beberapa bersifat aerobic (genus
Bacillus) dan yang lain anaerobic (genus Clostridium). Motil krn flagel atau nonmotil. Aerobik,
anaerobic fakultatif, anaerobic atau mikroaerofilik. Habitat: tanah, air, lingkungan aquatic,
saluran pencernaan (termasuk manusia. Contoh: Clostridium, Bacillus, Sporosarcina.

16. Bakteri gram negatif berbentuk batang tak membentuk endospora

Kelompok ini hampir semua adalah Lactobacillus. Bentuk sel batang tunggal atau rantai.
Nonmotil. Gram positif. Anaerobic atau anaerobic fakultatif. Ciri metabolic: asam laktat
merupakan produk akhir fermentasi. Habitat: produk persusuan, daging dan butiran (Grain), air,
limbah, serta produk fermentasi, rongga mulut, vagina, serta saluran pencernaan makanan hewan
(termasuk manusia).

17. Aktinomisetes & organisme sekerabat

Ciri pemersatu ialah pleomorfisme sel-selnya dan kecenderungan membentuk filament
bercabang. Bentuk batang tak beraturan , filament. Nonmotil. Gram positif. Aerobic, anaerobic
fakultatif atau anaerobic. Habitat: tanah, lingkungan aquatic, air, dan hewan (termasuk manusia).
Contoh: Corynebacterium diphtheria, Mycobacterium tubercolosis, Actinomyces israelli
(penyebab peny. Aktinomikosis dsb Peny. Lumpy jaw/kaki gajah)

18. Riketsia
Morfologi sel: batang pendek, atau lonjong, kadang pleomorfik, ukuran lebar 0,3-0,7 m;
panjang 1,0-2,0 m, beberapa membentuk tubuh kokoid yang berkembang menjadi tubuh buah.
Gram negative. Nonmotil. Parasit obligat intraseluser pada arthopoda penghisap darah spt:
caplak, kutu dan tungau. Habitat: serangga pembawa, burung, dan mammalia termasuk manusia.
Contoh: Chlamydia penyebab penyakit trakoma, limfogranuloma venereum, uretritis, psitakosis,
 ornitosis. Riketsia penyebab demam tipus, demam bercak, Rocky mountain, tifus scrub dan
demam Q.

19. Mikoplasma
Ciri khususnya adalah tidak adanya dinding sel sejati, terdapat membrane sel berlapis tiga
tidak mengandung satuan structural asam muramat dan asam diaminopimelat yang memberikan
kekakuan pada dinding sel. Sehingga sangat pleomorfik. Biasanya nonmotil. Gram negative.
Anaerobic fakultatif. Habitat: selaput lendir saluran pernafasan dan saluran alat kelamin bawah.
Contoh Mycoplasma pneumonia.

BAB III
METODE KERJA

3.1 Alat-Alat Laboratorium

1. Alat-alat gelas atau kaca

a. Tabung reaksi
b. Erlenmeyer
c. Gelas ukur
d. Pipet
e. Cawan petri
f. Kaca Objek
2. Alat-alat berbahan porselen
3. Alat-alat berbahan silika
4. Alat-alat dari logam
5. Alat-alat dari plastik atau karet
6. Alat-alat instrumen
a. Neraca analitik
b. pH meter
c. Mikroskop
d. Alat-alat sterilisasi
Autoclave
Oven
f. Automatic Colony Counter
g. Inkubator
h. Laminar Air Flow Cabinet
7. Bahan-bahan :
a. Isopropil alkohol 95 %
b. Inokulum bakteri
c. Zat warna biru metilen
d. Zat warna karbol fuksin
e. Kristal ungu
f. Larutan iodium gram
g. Etanol 95 %
h. Pewarna safranin
i. Medium nutrien cair
j. Larutan H2O2
.

3.2 Metode kerja

3.2.1 Indentifikasi Bakteri dengan Pewarnaan

1. Pembuatan Preparat Oles

Bersihkan kaca objek sehingga bebas dari lemak dan kotoran

Teteskan beberapa tetes isopropil alkohol 95 % pada kedua permukaan kaca objek dan keringkan
dengan lap kertas.

Buatlah lingkaran ditengah-tengah permukaan bawah kaca objek. Hal ini untuk membantu
meletakkan olesan mikroba dengan tepat.

Ambil inokulum bakteri dan sebarkan olesan tersebut hingga merata.

Biarkan olesan tersebut kering udara hingga betul-betul kering.

Lakukan fiksasi panas dengan melayangkan kaca objek di atas panas api.

2. Pewarnaan Sederhana

Siapkan preparat olesan bakteri B. subtilis dan E. coli yang telah difiksasi panas dimanadibuat 2
preparat untuk tiap bakteri.

Letakkan kaca objek di atas bak pewarnaan dan genangi olesan tersebut dengan zat warnabiru
metilen untuk preparat pertama dan zat warna karbol fuksin untuk preparat kedua.

Biarkan terwarnai biru metilen selama 1-2 menit atau selama 15-30 detik untuk
pewarnaandengan karbol fuksin.

Peganglah kaca objek dengan penjepit dan miringkan kemudian bilas dengan air hinggazat warna
hilang atau sedikit sekali.

Keringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap.

 Amati morfologi spesien pada masing-masing preparat di bawah mikroskop.

3. Pewarnaan Gram

Buat preparat oles dari bakteri E. coli dan S. aureus.

Beri kristal ungu selama 1 menit.

Buang kelebihan kristal ungu dengan memiringkan kaca objek di atas bak pewarna

Bilas dengan air menggunakan botol pijit.

Tiriskan kaca objek dan kembalikan ke atas rak pada bak pewarna.

Cuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal tidak
tampak lagi mengalir dari kaca objek.

Beri larutan iodium gram selama 2 menit.

Buang kelebihan iodium dengan memiringkan kaca objek.

Bilas dengan air memakai botol pijit.

Beri safranin selama 30 detik.

Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air.

Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap diatasnya.

Amati di bawah mikroskop.

Cuci dengan sir lalu tiriskan.

Beri safranin selama 30 detik.

Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air.

Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap diatasnya.

Amati di bawah mikroskop.

3.2.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia

1. Sifat Morfologi Bakteri.

 Gunakan preparat hasil pewarnaan gram untuk bakteri E. coli dan S. aureus.

Perhatikan gambaran mikroskopik morfologi kedua bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan
warna koloni.

2. Sifat Biokimia Bakteri

Menggunakan medium nutrien cair dalam tabung smith

Inokulasikan B. subtilis dan E. coli dalam tabung smith masing-masing sebanyak 2

tabung dan 1 tabung kontrol.

Inkubasikan pada suhu 37. selama 48 jam.

Pada tiap tabung tambahkan 1 ml H2O2 30% menggunakan pipet.

Biarkan lartan H2O2 mengalir sendiri dan biarkan selama 1 jam

Amati gas yang terdapat pada tabung yang tertutup.

Menggunakan medium nutrien agar miring

Inokulasikan B. subtilis dan E. coli dalam tabung smith masing-masing sebanyak 2

tabung dan 1 tabung kontrol.

Inkubasikan pada suhu 37. selama 48 jam.

Pada tiap tabung tambahkan 2-3 ml H2O2 3% menggunakan pipet.

Biarkan larutan H2O2 mengalir sendiri dan biarkan selama 1 jam.

Amati gas yang terdapat pada tabung yang tertutup.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN
a. Pewarnaan GramBakteri St. aureus

Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan gram bakteri St. aureus dibawah perbesaran
mikroskop. Terlihat dari gambar warna keunguan yang menandakan bahwa bakteri St. aureus
termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif, dengan morfologi bentuk coccus (bundar).

b. PewarnaanGram Bakteri B. subtilus

Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan gram bakteri B. subtilus dibawah perbesaran
mikroskop. Terlihat dari gambar warna keunguan yang menandakan bahwa bakteri B. subtilus
termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif, dengan morfologi bentuk basil yang
memanjang dan besar.

c. Pewarnaan Gram Bakteri E. coli

 Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan gram bakteri E.coli dibawah perbesaran
mikroskop. Terlihat dari gambar warna merah yang menandakan bahwa bakteri E.coli termasuk
ke dalam golongan bakteri gram negatif, dengan morfologi bentuk basil yang memanjang
kurus dan kecil-kecil.

d. Pewarnaan Sederhana Bakteri St. aureus

Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan sederhana bakteri St. aureus dibawah
perbesaran mikroskop. Terlihat dari gambar, warna ungu yang ditunjukkan untuk membantu
melihat morfologi koloni maupun morfologi tunggal dari bakteri St. aureusberbentuk coccus.

BAB V
PEMBAHASAN

5.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan.

5.1.1 Jenis-jenis pewarnaan pada kuman.

Pewarnaan yang dilakukan pada kuman banyak ragam dan jenisnya. Selama ini dikenal lima
macam proses pewarnaan, yaitu sebagai berikut :
1. Pewarnaan negative

- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang.

- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta.
Cara pewarnaan negatif :

Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop

 Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi
hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik
ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak
mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya
penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan
lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan sederhana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai
macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

3. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-
asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan
warna merah.

4. Pewarnaan structural / khusus

- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri kapsul, spora, flagel dll

a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat
melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru
gelap.

b. Pewarnaan spora
Dinding spora relative tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.

c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga
terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA.

5. Pewarnaan diferensial
- Menggunakan lebih dari satu macam zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan Asam
 Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

5.1.2 Langkah-langkah Pembuatan Preparat Oles dan Teknik Pewarnaan Pada Kuman.

Teknik pewarnaan kuman yang kami lakukan pada praktikum ini adalah teknik
pewarnaan sederhana dan teknik pewarnaan gram. Untuk teknik pewarnaan sederhana bertujuan
untuk melihat morfologi dari bakteri, baik itu bentuk koloninya maupun bentuk individunya.
Langkah pertama yang harus dilakukan adalah menyiapkan preparat olesan dari bakteri. Preparat
yang akan diolesi bakteri ini di fiksasi dulu sebanyak 3 kali dengan api untuk menghilangkan
kuman dan lemak di preparat baru kemudian di lap dengan tissue. Bakteri yang digunakan adalah
bakteri B. subtilis, E. coli, dan St. Aureus. Bakteri-bakteri ini dioleskan pada bagian oval
preparat, yang sebelumnya sudah ditandai dengan sepidol, penandaan bagian oval ini untuk
membantu meletakkan olesan mikroba dengan tepat. Sebelum preparat dioleskan bakteri,
preparat diolesi terlebih dahulu dengan NaCl steril, tujuannya karena NaCl steril merupakan
garam fisiologi dari bakteri.

Langkah selanjutnya adalah menggenangi olesan bakteri pada preparat tersebut dengan
zat warnakristal violet atau biru metilenselama 1-2 menit. Kemudian preparat dimiringkan dan
dibilas dengan air hinggazat warna hilang atau sedikit sekali. Selanjutnya adalah keringkan air
pada permukaan preparat dengan kertas serap lalu amati morfologi bakteri pada masing-masing
preparat di bawah mikroskop.
Selain teknik pewarnaan sederhana, kami juga melakukan teknik pewarnaan gram, teknik
ini bertujuan untuk mengidentifikasi suatu bakteri apakah dia termasuk ke dalam bakteri gram
negatif atau bakteri gram positif. Langkah-langkah dalam pewarnaan ini hampir sama dengan
langkah pada pewarnaan sederhana yakni membuat preparat oles dari ketiga bakteri diatas.
Bedanya adalah pada beberapa reagen yang ditambahkan. Pertama, bakteri pada preparat ditetesi
kristal violet selama 1 menit. Lalu kelebihan kristal violetdibuang dengan memiringkan kaca
objek dan bilas dengan air mengalir secara perlahan. Preparat ditiriskan, lalu diberi larutan
iodium gram selama 2 menit, kelebihan iodium dibuang dengan memiringkan kaca objek lalu
dibilas dengan air seperti kristal violet. Langkah selanjutnya adalah preparat dicuci dengan
etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal tidak tampak lagi
mengalir dari preparat, setelah dirasa warna menghilang cuci perlahan lalu tiriskan. Terakhir
adalah dengan menambahkan pewarna safranin selama 30 detik pada preparat, kemudian
kelebihan safranin dibuang dan dibilas dengan air. Preparat yang masih basah ditiriskan dan
diserap dengan menekankan kertas serap disekitarnya.Amati preparat olesan bakteri yang sudah
diwarnai tersebut di bawah mikroskop.

Jadi, dapat disimpulkan bahwa bahan-bahan pereaksi yang digunakan dalam pewarnaan gram
adalah :

Zat warna utama (violet kristal)

 Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
untuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

5.1.3 Perbedaan dari bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif.

Seperti yang kita ketahui bakteri dibagi menjadi bakteri gram negatif dan bakteri gram positif,
pembagian atas keduanya didasarkan pada beberapa perbedaan, berikut perbedaan bakteri gram
negatif dan bakteri gram positif :

Ciri-ciri bakteri gram negative :

- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan
kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit dan tidak mengandung asam laktat.
- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
- Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif :

- Struktur dindingnya tebal
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
- Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
- Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri gram Bakteri gram negatif(-)

positif (+)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi
(1-4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies Relatif sederhana
relatif kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik
 Berdasarkan hasil pengamatan dibawah mikroskop, untuk bakteri yang termasuk gram
positif akan terlihat berwarna ungu, dimana warna ungu ini sendiri merupaka warna dari kristal
violet yang sebelumnya diteteskan, warna ini melekat dengan kuat karena peptidoglikan dari
bakteri gram positif tebal. Sedangkan untuk bakteri gram negatif akan terlihat warna merah,
dimana warna merah ini merupakan warna dari pewarna safranin yang diteteskan terakhir kali,
warna ini melekat dan warna ungu sama sekali tidak terlihat karena peptidoglikan dari bakteri
gram negatif relatif tipis sehingga ia tidak mampu mempertahankan warna ungu layaknya bakteri
gram positif.

5.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia.

5.2.1 Mahasiswa memahami sifat morfologi yang ditunjukkan koloni kuman.

Ada empat cara yang dilakukan untuk mengetahui hasil dari identifikasi morfologi koloni
bakteri yaitu sebagai berikut:

1) Metode piringan goresan dan metode piringan tuangan

Untuk memelihara bakteri dalam lempengan (di dalam petridis) sampel bakteri diambil
dengan ujung kawat yang bengkok. Ujung yang bengkok ini kemudiaan digesekkan dengan
gerakan ke kanan dan ke kiri sampai meliputi seluruh permukaan agar-agar. Dengan demikian
akan diperoleh koloni-koloni yang mengggerombol dan koloni-koloni yang memencil. Yang
terakhir inilah yang menunjukkan sifat-sifat yang harus diperhatikan. Sifat-sifat koloni pada
agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan, dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai
titik,-titik, bulat, berbenang, tak teratur, serupa akar, serupa kumparan. Permukaan koloni dapat
datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit, timbul
berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang
bergerigI, ada yang berbenang-benang, ada yang keriting.

2) Metode tusukan agar tegak

Metode ini dapat diperoleh dengan menusukkan ujung kawat yang membawakan bakteri,
lurus ke dalam medium melalui tengah-tangah medium. Bakteri yang aerob akan tampak tumbuh
dekat permukaan medium. Sifat-sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat
mengencerkan gelatin, ada juga bakteri yang tidak mampu mengencerkan gelatin. Bentuk koloni
serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol, berjonjot, serupa batang, serupa kawah, mangkuk,
corong, pundit-pundi (Jutono, 1980). Koloni juga dibedakan berdasarkan moril tidaknya. Bakteri
dikatakan motil apabila bakteri menyebar ke sekitar tusukan, sedangkan bakteri dikatakan
nonmotil bila pertumbuhannya hanya pada bekas tusukan.

3) Metode agar miring goresan

Untuk membuat piaraan disitu maka ujung kawat yang berisi bakteri digesekkan satu kali
dari ujung bawah ke ujung atas sehingga garis itu merupakan diameter memanjang dari
permukaan medium. Sifat khusus pada agar miring berkisar pada bentuk dan tepi koloni, dan
 sifat-sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : berupa pedang, serupa duri, serupa tasbih,
titik-titik, batang, dan akar.

4) Metode medium cair

Inolukasi juga dapat dilakukan degan metode adukan. Bakteri yang digunakan untuk membuaat
piaaraaan adukan dapat diperoleh dari piaraan dalam medium cair, atau dari suatu koloni pada
medium padat. Biakan diambil dengan kawat ose kemudian diadukkan dalam medium cair
tersebut. Sifat koloni yang kelihatan akan berbeda-beda. Permukaan medium ini dapat
memprlihatkan adanya serabut, cincin, langit-langit, atau selaput.

Menurut Pradhika (2008), koloni bakteri memiliki ciri-ciri yang berbeda, tergantung
jenisnya dan mediumnya. Ciri-ciri tersebut adalah :

a. Pertumbuhan pada petridis.

Ukuran; pinpoint/punctiform (titik)
- Small (kecil)
- Moderate (sedang)
- Large (besar)

Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa

jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media.

Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.

- Opaque (tidak dapat ditembus cahaya)
- Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian)
- Transparant (bening)

Bentuk :
- Circular
- Irregular
- Spindle
- Filamentous
- Rhizoid

Elevasi :
- Flat
- Raised
- Convex
- Umbonate

Permukaan :
- Halus mengkilap
- Kasar
- Berkerut
- Kering seperti bubuk
 Margins :
- Entire
- Lobate
- Undulate
- Serrate
- Felamentous
- Curled

b. Pertumbuhan pada Agar Miring

Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus pada medium.

c. Pertumbuhan pada Agar Tegak

Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.

d. Pertumbuhan pada Media Cair

BAB VI
PENUTUP

6.1 Kesimpulan

1. Jenis-jenis pewarnaan pada kuman ada banyak macamnya, diantaranya pewarnaan negatif,
pewarnaan sederhana, pewarnaan tahan asam, pewarnaan structural / khusus, dan pewarnaan
diferensial.
2. Sebelum melakukan pewarnaan bakteri, kita harus membuat preparat oles bakteri. sebelum
preparat diolesi bakteri harus dilakukan fiksasi dulu.
3. Teknik pewarnaan sederhana adalah teknik pewarnaan yang bertujuan untuk melihat bentuk
tunggal dan berkoloni dari suatu bakteri, sedangkan teknik pewarnaan gram bertujuan untuk
mengidentifikasi bakteri termasuk dalam gram positif atau negatif.
4. Bahan pereaksi yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah pewarna violet kristal, lalu
iodium/lugol, kemudian alkohol dan yang terakhir adalah pewarna safranin
5. Perbedaan antara bakteri gram positif dengan gram negatif setelah dilakukan pewarnaan gram
adalah: bakteri gram positif memberikan warna ungu, sedangkan gram negatif memberikan
warna merah dibawah mikroskop.
6. Morfologi yang ditunjukkan koloni kuman dapat diidentifikasi dengan metode piringan goresan,
metode piringan tuangan, metode tusukan agar tegak, metode agar miring goresan, metode
medium cair

6.2 Saran
 Berhatil-hatilah bekerja dengan mikroorganisme sseperti bakteri karena bisa saja
bakteri tersebut bersifat patogen. Gunakan selalu sarung tangan dan masker untuk menghindari
kontak kulit langsung dengan bakteri. Kemudian setelah pekerjaan selesai jangan lupa untuk
mencuci tangan dengan sabun lalu dengan antiseptik untu meminimalisir jumlah kuman yang
menempel di tangan kita.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Hadioetomo, Ratna Siri.1990.Mikrobiologi dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

Lay, Bibiana.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali

Sutedjo, Mul Mulyani.1991. Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta

Volk, W. A. dan Wheeler, M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

Waluyo,Lud.2004.Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.

IDENTIFIKASI BAKTERI DENGAN PEWARNAAN

DAN
MORFOLOGI KOLONI DAN UJI BIOKIMIA

KAMIS, 16 MEI 2013

LAPORAN
MIKROBIOLOGI FARMASI
 OLEH :

KELOMPOK K1-3

1. Masuliatin Nasucha (122210101036)

2. Ika Nur Masruroh (122210101040)
3. Mufitriatus Sholikhah (122210101048)
4. Shahnaz Apsari M. (122210101051)

BAGIAN BIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2013

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan
mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak
berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam
kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah
dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak
digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel
antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah
suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram
positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram
dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat
warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau
membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan
Gram positif.
Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat
morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur,
warna koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya.
Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri,
morfologi koloni, dan uji biokimia sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi bakteri.

1.2 Rumusan Masalah

 1.2.1 Identifikasi bakteri dengan pewarnaan
1.2.1.1 Apa macam-macam pewarnaan kuman?
1.2.1.2 Bagaimana melakukan pewarnaan kuman?
1.2.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia
1.2.2.1 Bagaimana membedakan sifat morfologi koloni kuman?
1.2.2.2 Apa karakteristik kuman berdasar sifat biokimia yang khas?

1.3 Tujuan Praktikum

1.3.1 Identifikasi bakteri dengan pewarnaan
1.3.1.1 Mahasiswa mengenal macam-macam pewarnaan kuman
1.3.1.2 Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan kuman
1.3.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia
1.3.2.1 Mahasiswa dapat membedakan sifat morfologi koloni kuman
1.3.2.2 Mahasiswa memahami karakteristik kuman berdasar sifat biokimia yang khas

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Identifikasi bakteri dengan pewarnaan
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari
pewarnaan tersebut ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang
ada akan dapat diketahui.
(Suriawiria, 1999)

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain),
pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi, 2008).
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan
cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada
mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral
(Lay, 1994).
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram
dan pewarnaan tahan asam.
Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan
paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi
menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
(Pelczar & Chan, 1986).
Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk
noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu
mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan
pada noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri
Gram Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci
dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies
bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen
diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang
tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang berwarna
merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999).
Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan oleh
adanya perbedaan struktur pada dinding sel nya. Dinding Gram Positif mengandung banyak
peptidoglikan,sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung
lipopolisakarida(Suriawiria, 1999).
Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram
B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga
tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam.
Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna
pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen
pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis (Pelczar & Chan, 1986).

2.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia

Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni. Bakteri
memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat
maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil
tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus,
diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993).
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi
spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang
berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai
organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan
klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia.
Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang
dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan
warna reagen.
Koloni-koloni terpilih dimurnikan dengan cara goresan berulang pada medium NA+0,5%
NaCl hingga diperoleh isolat murni. Isolat murni diidentifikasi dengan mengenali karakternya,
yaitu dengan mencatat karakter koloni, pengamatan morfologi sel dengan pewarnaan Gram, dan
pewarnaan endospora menggunakan malachite green.
 BAB III
METODE KERJA

3.1 Alat dan Bahan

Alat
1. Kaca objek
2. Lap kertas
3. kertas serap
4. mikroskop
5. botol pijit
Bahan
1. isopropil alkohol 95%
2. biru metilan
3. karbol fuksin
4. iodium
5. safranin
6. air
7. E. coli
8. B. subtilis
9. Staphylococcus aureus

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pembuatan Preparat Oles

1. Bersihkan kaca objek sehingga bebas dari lemak dan kotoran

2. Teteskan beberapa tetes isopropil alkohol 95% pada kedua permukaan kaca objek dan
keringkan dengan lap kertas.

3. Buatlah lingkaran di tengah-tengah permukaan bawah kaca objek. Hal ini untuk
membantu meletakkan olesan mikroba dengan tepat.

4. Ambil inokulum bakteri dan sebarkan olesan tersebut hingga merata

 5. Biarkan olesan tersebut kering udara hingga betul-betul kering.

6. Lakukan ksasi panas dengan melayangkan kaca objek di atas panas api

3.2.2 Pewarnaan Sederhana

1. Siapkan preparat olesan bakteri B. subtilis dan E. coli yang telah diksasi panas dimana
dibuat 2 preparat untuk tiap bakteri

2. Letakkan kaca objek di atas bak pewarnaan dan genangi olesan tersebut dengan zat warna
biru metilen untuk preparat pertama dan zat warna karbol fuksin untuk preparat kedua.

3. Biarkan terwarnai biru metilen selama 1-2 menit atau selama 15-30 detik untuk
pewarnaan
dengan karbol fuksin

4. Peganglah kaca objek dengan penjepit dan miringkan kemudian bilas dengan air hingga
zat warna hilang atau sedikit sekali

5. Keringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap.

6. Amati morfologi spesien pada masing-masing preparat di bawah mikroskop.

3.2.3 Pewarnaan Gram

1. Buat preparat oles dari bakteri E. coli dan S. aureus

2. Beri kristal ungu selama 1 menit

3. Buang kelebihan kristal ungu dengan memiringkan kaca objek di atas bak pewarna

4. Bilas dengan air menggunakan botol pijit

5. Tiriskan kaca objek dan kembalikan ke atas rak pada bak pewarna
6. Beri larutan iodium gram selama 2 menit

7. Buang kelebihan iodium dengan memiringkan kaca objek

8. Bilas dengan air memakai botol pijit

9. Cuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal
tidak tampak lagi mengalir dari kaca objek.

10. Cuci dengan sir lalu tiriskan

11. Beri safranin selama 30 detik

Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air

12. Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap di atasnya

13. Amati di bawah mikroskop.

 BAB IV
HASIL DAN PENGAMATAN

4.1 Hasil Pengamatan

Pada praktikum kali ini, dilakukan perwarnaan gram dan pewarnaan sederhana serta
morfologi koloni yang ada pada bakteri. Pada pewarnaan Gram, bakteri yang digunakan yaitu
Esterichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtillis. Sedangkan pada pewarnaan
sederhana, menggunakan bakteri Esterichia coli dan Bacillus subtillis.
Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan mikroskop elektron
dapat diketahui bahwa :
Esterichia coli merupakan bakteri gram negatif karena berwarna merah, morfologinya
kokobasil, dan bentuk yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang soliter, namun
ada juga yang tampak bergerombol atau berpasangan.
 Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya
stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak
seperti anggur.
Bacillus subtillis merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya basil, ada
yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau terpisah.
Sedangkan hasil dari pewarnaan sederhana dan setelah diamati dengan menggunakan
mikroskop elektron sama dengan hasil pengamatan pada pewarnaan gram diatas yang dapat
diketahui bahwa :
Esterichia coli termasuk dalam bakteri gram negatif karena berwarna merah. E.coli memiliki
morfologi kokobasil, dan bentuknya yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang
soliter, bergerombol atau berpasangan.
Bacillus subtillis merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu. Bakteri ini memiliki
morfologi basil. Biasanya bentuk rantai atau terpisah.
Dari pengamatan yang telah dilakukan, juga dapat diketahui bahwa bentuk Bacillus
subtillis lebih panjang dibandingkan dengan bentuk E.coli.

Berikut hasil pengamatan berupa gambar :

Gambar Bakteri
Pewarnaan Gram
Esterichia coli

Staphylococcus aureus

Bacillus subtillis

Pewarnaan Sederhana
 Bacillus subtillis

4.2 Pembahasan
Untuk mengamati bakteri di bawah mikroskop, kita memerlukan pewarnaan bakteri
dengan menggunakan pewarna karena sebagian bakteri tidak berwarna. Tujuannya adalah untuk
memudahkan dalam mengidentifikasi bakteri.
Ada 3 macam pewarnaan yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi bakteri, yaitu
pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial (differential stain), dan pewarnaan
khusus (special stain).Namun dalam praktikum ini kami hanya melakukan pewarnaan sederhana
dan pewarnaan diferensial yaitu pewarnaan gram.
Hal pertama yang harus dilakukan sebelum melakukan pewarnaan adalah pembuatan
preparat oles. Caranya adalah dengan membersihkan kaca objek dengan alkohol sehingga bebas
dari lemak. Kemudian membuat sediaan preparat dalam bentuk suspensi. Lalu memijarkan ose
dan didinginkan. Setelah itu mencelupkan ose ke dalam suspensi bakteri dan goreskan pada kaca
objek. Jika bakteri yang akan diperiksa terdapat pada medium padat(media agar), maka
meneteskan NaCl Fisiologis terlebih dahulu pada kaca preparat kemudian menggoreskan bakteri
tersebut dengan ose. Dan yang terakhir adalah mengeringkan preparat dan melakukan fiksasi.
Mengeringkan preparat dilakukan dengan mengangin anginkan pada suhu ruang dan fiksasi
dilakukan dengan cara melewatkan preparat di atas api sebanyak tiga kali. Fiksasi dilakukan agar
bakteri tetap berada di kaca preparat dan tidak berpindah kemana-mana. Karena ada
kemungkinan besar bakteri yang sudah di fiksasi itu mati dan tetap tinggal di kaca preparat.
Setelah pembuatan preparat oles selesai, dilanjutkan dengan prosespewarnaan. Pada
pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh
sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terilihat.
Contoh zat warna seperti: Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.
Dalam praktikum ini bakteri yang digunakan dalam pewarnaan sederhana adalah E.coli
dan B.subtilis dan pewarna yang digunakan adalah kristal ungu. Pertama adalah meletakkan kaca
objek di atas bak pewarnaan dan mengggenangi olesan tersebut dengan zat warna kristal ungu
lalu mendiamkan hingga 1 menit. Kemudian memiringkan preparat dan membilas dengan air
hingga zat warna hilang atau sedikit sekali. Setelah itu mengeringkan air pada permukaan
preparat dengan kertas serap. Preparat pun siap diamati di mikroskop.
Bacillus subtillis berwarna ungu setelah penambahan zat warna kristal ungu. Dan setelah
diamati dengan mikroskop, bakteri ini memiliki morfologi basil. Biasanya bentuk rantai atau
terpisah. Eschericia coli setelah penambahan zat warna kristal ungu warnanya menjadi ungu.
Dan setelah diamati dengan mikroskop E.coli memiliki morfologi kokobasil, dan bentuknya
yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang soliter, bergerombol atau
berpasangan.Pada Bacillus subtillis dan Eschericia coli saat penambahan zat warna
menghasilkan warna yang sama yaitu ungu sehingga tidak bisa membedakan ciri bakteri yang
satu dengan yang lain misalnya apakak termasuk bakteri gram positif atau gram negatif. Hal ini
dikarenan pewarnaan ini hanya untuk mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk
seluler dan struktur dasarnya dapat terilihat dan tidak untuk membedakan bakteri.
Pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi yang
berbeda untuk setiap bakteri sehingga digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan gram
ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu Gram positf dan Gram negatif.
Pada praktikum ini bakteri yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah Bacillus
subtillis, Eschericia coli, dan St.Aureus menggunakan zat warna kristal ungu, larutan iodium,
alkohol, dan safranin.
Hal pertama adalah membuat preparat oles dari bakteri Bacillus subtillis, Eschericia coli,
dan St.Aureus. Setelah pembuatan preparat dan proses fiksasi selesai maka dilanjutkan dengan
proses pewarnaan. Zat warna pertama yang digunakan adalah kristal ungu. Preparat diberi kristal
ungu dan didiamkan selama 1 menit. Kelebihan kristal ungu dibuang dan membilas preparat
dengan air. Lalu mengeringkan dengan tissue. Hasil yang terjadi adalah ketiga bakteri menjadi
berwarna ungu. Tidak ada perbedaan antar ketiganya.
Kemudian preparat ditetesi iodin yang merupakan mordant (penajam). Setelah iodin
dicuci, baik Bacillus subtillis, Eschericia coli, dan St.Aureus tampak berwarna ungu. Selanjutnya
preparat diberi alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) pada
spesies bakteri tertentu. Setelah alkohol dicuci, bakteri Bacillus subtillis dan St.Aureus tampak
masi berwarna ungu. Namun untuk bakteri Eschericia coli menjadi tidak berwarna. Warna ungu
nya telah hilang.
Zat warna terakhir yang diberikan adalah safranin. Safranin merupakan zat warna basa
berwarna merah. Preparat kemudian dicuci dan dikeringkan. Hasilnya adalah bakteri Bacillus
subtillis dan St.Aureus tetap berwarna ungu sedangkan bakteri Eschericia coli menjadi berwarna
 merah.Dari hasil pewarnaan gram, dapat diketahui bahwa Bacillus subtillis dan St.Aureus
digolongkan ke dalam Gram Positif dan bakteri Eschericia coli digolongkan ke dalam Gram
Negatif.
Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan Gram negatif disebabkan oleh adanya
perbedaan struktur pada dinding sel nya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung
peptidoglikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung
lipopolisakarida.Kompleks kristal ungu-iodin yang masuk ke dalam dinding sel bakteri Gram
positif tidak dapat dicuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada
dinding sel; sedangkan pada bakteri Gram negatif, alkohol akan merusak lipopolisakarida.
Kompleks kristal ungu-iodin yang pada dinding sel bakteri Gram negatif dapat tercuci dan
menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin.
Untuk melihat morfologi bakteri, kita harus mengamatinya di bawah mikroskop. Ada
beberapa bentuk dasar bakteri yaitu bulat (tunggal: coccus, jamak: cocci), batang (tunggal:
bacillus, jamak: bacilli), dan spiral yaitu batang melengkung atau melingkar-lingkar. Bentuk
bulat dibedakan menjadi coccus, diplococci, streptococci, tetrad, sarcina, dan staphylococci.
Sedangkan bentuk batang dibedakan menjadi bacillus, diplobacilli, streptobacilli, dan
coccobacillus. Dan bentuk spiral dibedakan menjadi vibrio, spirilla, dan spirochaeta.
Sebelum pengamatan dengan mikroskop, preparat di tetesi oleh oleum emersi dahulu.
Dari pengamatan yang terlihat bahwa Esterichia coli morfologinya kokobasil, dan bentuk yang
cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang soliter, namun ada juga yang tampak
bergerombol atau berpasangan. Staphylococcus aureus morfologinya stafilokokus, dan berbentuk
bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur. Dan Bacillus
subtillis morfologinya basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau terpisah.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
1. Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan
diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain).
2. Esterichia coli merupakan bakteri gram negatif karena berwarna merah, morfologinya kokobasil,
dan bentuk yang cenderung ke batang panjang.
3. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya
stafilokokus, dan berbentuk bulat.
4. Bacillus subtillis merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya basil, ada
yang tebal dan yang tipis.
5.2 Saran
Untuk praktikum berikutnya supaya alat disediakan lebih banyak, sehingga tidak
menghabiskan banyak waktu saat bergantian alat. Dan alangkah baiknya jika ada asisten dosen
yang menjaga sehingga praktikan lebih mudah bertanya saat mendapati kesulitan dalam
melakukan pengamatan.

DAFTAR PUSTAKA
Hadioetomo, R. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali.
Pelczar & Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta : Universitas Indonesia.
Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.
Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.
Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKROBA

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Didalam bidang ilmu mikrobiologi, utuk dapat menelaah bakteri
khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita dapat
menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana didalamnya hanya
terdappat bakteri yang kita tumbuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi
dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah
biakan murni. Untuk melakukan hal ini harus dimengerti jenis-jenis nutrient
yang disyaratkan bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang
menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Galung,
2009).
Berdasarkan hal tersebut maka perlu dilakukan isolasi untuk
memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan hidupnya, sehingga
dapat diperoleh biakan murni.

1.2 Tujuan
1. Mengetahui yang dimaksud dengan isolasi mikroba
2. Mengetahui teknik dasar isolasi mikroba
3. Mengetahui morfologi mikroba dari form, elevation dan marginnya

BAB II
TINJAUN PUSTAKA

Populasi mikroorganisme yang ada dialam sekitar kita ini sangatlah

besar dan cukup kompleks. Berates spesies mikroba mengausai setiap
bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar. Sebagai
contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu-ribu mikroorganisme.
Sutu gram tinja dapat mengandng jutaan bakteri. Alam sekitar kita, baik itu
tanah, air maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme.
Penelitian yang layak menganai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini
memerlukan teknik unuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini,
 atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni ini
terdiri dari satu populasi sel yang semuanya barasal dari suatu sel induk
(Pelczar, 1986).
Jika kita pertama kali mengadakan piaraan biasanya yang kita peroleh
itu suatu piaraan campuran. Misalnya kita ambil bahan ampel dari udara,
dari tanah, dari kotoran; jika bahan itu disebarkan pada medium steril, akan
tumbuh beraneka kolni yang masing-masing mempunyai sifat-sifat khas. Jika
kita mengambil bahan dari suatu koloni tersebut, kemudian bahan itu kita
tanam pada medium baru yang steril, maka bahan itu akan tumbuh menjadi
koloni yang murni, asalkan pemindahan itu dilakukan dengan cermat
menurut teknik aseptic, yaitu menggunakan alat-alat yang setril dan aturan
laboratorium tertentu (Dwidjoseputro, 2005).
Pemindahan bakteri dari medium lama kemedium yang baru atau
dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerlukan banyak ketelitian.
Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat-alat yang akan
dignakan untuk pengerjaan medium dan pengenceran inokulasi benar-benar
steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya
mikroba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh didalam
medium adalah benar-benar biakan murni (Dwidjoseputro, 2005).
Dalam keadaan yang sebanarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri
yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali
bakteri pathogen kedapatan bersama-sama dengan bakteri saproba. Untuk
menyendirikan suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu:
1. Pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil
memelihara Streptococcus Laktis dalam piaraan murni yang diisolasi dalam
sempel susu yang sudah masam. Suatu sempel dari suatu supensi yang
berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung
yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian diambil kira-kira 1 ml
untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil
0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar
 akan didapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam medium
tersebut, akan tetapi mungkin juga hanya akan memperoleh satu koloni saja.
Dalam hal yang demikian ini dapat dijadikan piaraan murni. Jika belum yakin,
bahwa koloni tunggal yang diperoleh tersebut merupakan koloni yang murni,
maka dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni sebagai
sampel (Dwidjoseputro, 2005).
2. Penuangan
Robert Koch (1843-1905) mempunyai metode lain, yaitu dengan mangambil
sedikit sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan dan sampel ini
kemudian disebarkan didalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan
gelatin encer. Dengan demikian akan diperoleh suatu piaraan adukan.
Setelah mediaum tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian
nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan
mengulang pekerjaan diatas maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni
yang lebih terjamin (dwidjoseputro, 2005).
Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam
biakan didalam medium diantarany adalah:
1. Metode Cawan Gores
Metode ini memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu,
namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang
lumayan yang biasanya diperoleh dari pegalaman. Metode cawan gores yang
dilakukan dengan baik kebanykan akan menyebabkan terisolasinya
mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum
dilakukan adalah ttidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-
baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjad
kurang larut dan cenderung untuk menggunakan inokolum terlalu banyak
sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digores (Galung, 2009).
2. Metode Cawan Tuang
Cara lain untuk memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium
agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian dicawankan.
 Karena konsentrasi sel-sel mikroba didalam eksperimen pada umumnya
tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa
tahap sehingga sekurang-kurangnya satu diatara cawan-cawan tersebut
mengandung koloni-koloni terpisah diatas permukaan maupun didalam agar.
Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan
keterampilan yang terlalu tinggi (Galung, 2009).
Proses pemisahan/ pemurnia dari mikroorganisme lain perlu dilakukan
karena semua pekerjaan mikrobiologi, misalnya telaah dan identifikasi
mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdii dari satu
macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan isolasi mikroba.
Terdapay berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu:
1. Isolasi Pada Cawan Agar
Prinsip metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan
mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan
dari mikroorganisme lain. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada
cawan tersebut seletah inkubasi berasal dari atu sel tunggal. Terdapat
beberapa cara dalam metode isolasi pada cawan agar, yaitu: metode gores
kuadrat dan metode agar cawan tuang. Metode gores kuadart bila metode ini
dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme
dimana setiap koloni baresal dari satu sel. Metode agar tuang berbeda
dengan etode gores kuadrat, cawan tuang menggunakan medium agar yang
dicairkan dan didinginkan 50 oC, yang kemudian dicawankan. Pengenceran
tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung
koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan/ didalam cawan (Galung,
2009).
2. Isolasi Pada Medium Cair
Metode ini dilakukan bila mikroorganisme tiadak adapat tumbuh pada agar
cawan (mediaum padat), tepapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.
Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial
pengencerran. Semakin tinggi pengenceran, peluang untuk mendapatkan
satu sel semakin besar (galung, 2009).
3. Isolasi Sel Tunggal
Metode ini dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar
yang tidak dapat diisolasi dengan metode cawan/ medium cair. Sel
mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali.
Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang
sangat halus ataupun mikomanipulator yang dilakukan secara aseptis
(Galung, 2009).
Penetapan jumlah bakteri dalam suatu polulasi mungkin saja akan
hambatan. Hal ini karena tidak semua sel yang ada didalam suatu biakan itu
mampu untuk hidup secara terus menerus. Jadi dalam perhitungan ini maka
yang dianggap sebagai sel hidup adalah sel yang membentuk koloni didalam
medium biakan atau dapat juga digunakan bakteri yang mampu membentuk
suspense didalam medium biakan. Sel-sel yang mampu hidup terus adalah
yang dihitung dengan berbagai metodeuntuk menetapkan jumlah selnya.
Pada jumlah total sel, maka ikut dihitung semua sel yang tampak atau yang
dapat dihitung dengan cara yang lainnya, sehingga dengan demikian sel-sel
mati dan cacat akan ikut erhitung. Untuk menentukan jumlah bakteri yang
ada didalam suatu medium maka apat digunakan beberapa cara sebagai
berikut:
1. Jumlah bakteri secara keseluruhan. Pada cara ini dihitung semua bakteri
yang ada didalam suatu medium biakan baik yang hidup maupun yang mati.
2. Jumlah bakteri yang hidup. Cara ini menggambarkan jumlah sel yng hidup
saja sehingga lebih tepat jika dibandingkan dengan cara yang petama
(muslin, 2011).
Pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran yang
bertingkat yang mana ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu
suspense bakteri. Samel yang telah diencerkan ini dihitung kedalam cawan
baru kemudian dituang kemediumnya. Kemudian setelah diinkubasi selama
24-48 jam, diamati koloni-koloni yang tumbuh (Muslim, 2011).
Adapun prinsp dari metode cawan ini adalah jika sel jasad renik yang
masih hidup ditumbuhkan pada suatu medium agar, maka sel jasad renik
 tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan alat bantu seperti
mikroskop dan sebagainya. Metode hiting cwan ini merupakan cara yang
paling sensitive untuk menentukan jumlah jasad renik karena beberapa hal
yaitu:
1. Hanya sel yang masij hidup yang dihitung
2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk mengisolasi dan identifikasi jasad renik kerena koloni
yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai
penampakan yang spesifik (Muslim, 2011).
Berikut ini beberapa sifat-sifat koloni pada agar lempeng mengenai
bentuk, permukaan dan tepi yaitu:
1. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, berbenang, takteratur
seruapa akar dan serupa kumparan
2. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbil
mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah
3. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah,
ada yang berigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting
(Dwidjoseputro, 2005).

BAB III
METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum Isolasi dan Identifikasi Dasar Mikroba ini dilakukan pada hari
Senin, 04 April 2011 pukul 15.30-17.00 WITA dan dilanjutkan identifikasi
pada hari Rabu, 06 April 2011 pukul 15.00-16.00 WITA dilaboratorium
Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan
Alam Universitas Mulawarman Samarinda.
 3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Laminar Air Flow Cabinet
Lampu Bunsen
Cawan petri
Tabung reaksi
Rak tabung reaksi
Erlenmeyer
Mikro pipet
Blue tip
Vortex
Botol steril

3.2.2 Bahan
Alkohol 70%
PDA dan NA
NaCl 0,9%
Air Rawa
Aluminium foil
Kertas label
Kertas HVS
Serbet

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Cara Kerja PDA
1. Disiapkan semua alat dan bahan yang diperlukan didalam Laminar Air Flow
Cabinet.
2. Disterilkan dengan menggunakan alcohol 70%.
3. Dikocok sampel (air rawa) sebanyak 25 kali.
 4. Diambil 0,5 ml sampel menggunakan mikropipet dan blue tip kemudian
dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,9% yang sebelumnya
mulut tabung reaksi sudah disterilkan, vortex dan beri label 10-1.
5. Diambil 0,5 ml dari taung reaksi 10 -1 menggunakan mikropipet dan blue tip
yang baru. Kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi NaCl
0,9%, yang sebelumnya mulut tabung reaksi sudah disterilkan terlebih
dahulu, vortex dan beri label 10-2.
6. Diambil 0,5 ml dari tabung reaksi 10 -2 menggunakan mikropipet dan dengan
blue tip yang baru. Kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi
NaCl 0,9%, yang sebelumnya mulut tabung reaksi sudah disterilkan terlebih
dahulu, vortex dan beri label 10-3.
7. Diambil 0,5 ml dari tabung reaksi 10 -2 menggunakan mikropipet dan blue tip
baru yang sudah disterilkan. Kemudian dimasukkan kedalam cawan petri
yang sudah disterilkan terlebih dahulu. Ditambahkan PDA, homogenkan
dengan cara meletakkan cawan petri dibagian yang datar dalam Lamnar Air
Flow Cabinet dogoyang-goyangkan membentuk angka delapan. Beri label
PDA 10-2.
8. Diambil 0,5 ml dari tabung reaksi 10 -3 menggunakan mikropipet dan blue tip
baru yang sudah disterilkan. Kemudian dimasukkan kedalam cawan petri
yang sudah disterilkan terlebih dahulu. Ditambahkan PDA, homogenkan
dengan cara meletakkan cawan petri dibagian yang datar dalam Lamnar Air
Flow Cabinet dogoyang-goyangkan membentuk angka delapan. Beri label
PDA 10-3.
9. Diinkubasi cawan petri selama 48 jam pada suhu 37 oC
10. Setelah 48 jam diamati cawan petri dan dilakukan identifikasi mikroba.

3.3.2 Cara Kerja NA

1. Disiapkan semua alat dan bahan yang diperlukan didalam Laminar Air Flow
Cabinet.
2. Disterilkan dengan menggunakan alcohol 70%.
3. Dikocok sampel (air rawa) sebanyak 25 kali.
4. Diambil 0,5 ml sampel menggunakan mikropipet dan blue tip kemudian
dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,9% yang sebelumnya
mulut tabung reaksi sudah disterilkan, vortex dan beri label 10-1.
5. Diambil 0,5 ml dari taung reaksi 10 -1 menggunakan mikropipet dan blue tip
yang baru. Kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi NaCl
0,9%, yang sebelumnya mulut tabung reaksi sudah disterilkan terlebih
dahulu, vortex dan beri label 10-2.
6. Diambil 0,5 ml dari tabung reaksi 10 -2 menggunakan mikropipet dan dengan
blue tip yang baru. Kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi
NaCl 0,9%, yang sebelumnya mulut tabung reaksi sudah disterilkan terlebih
dahulu, vortex dan beri label 10-3.
7. Diambil 0,5 ml dari tabung reaksi 10 -2 menggunakan mikropipet dan blue tip
baru yang sudah disterilkan. Kemudian dimasukkan kedalam cawan petri
yang sudah disterilkan terlebih dahulu. Ditambahkan NA, homogenkan
dengan cara meletakkan cawan petri dibagian yang datar dalam Lamnar Air
Flow Cabinet dogoyang-goyangkan membentuk angka delapan. Beri label NA
10-2.
8. Diambil 0,5 ml dari tabung reaksi 10 -3 menggunakan mikropipet dan blue tip
baru yang sudah disterilkan. Kemudian dimasukkan kedalam cawan petri
yang sudah disterilkan terlebih dahulu. Ditambahkan NA, homogenkan
dengan cara meletakkan cawan petri dibagian yang datar dalam Lamnar Air
Flow Cabinet dogoyang-goyangkan membentuk angka delapan. Beri label NA
10-3.
9. Diinkubasi cawan petri selama 48 jam pada suhu 37 oC
10. Setelah 24 jam diamati cawan petri dan dilakukan identifikasi mikroba.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1 Tabel pengamatan media NA sampel air rawa
No Gambar Keterangan
1 -2
NA 10 tampak depan (terlampir) Form:circular
Elevation:flat
Margim:entire

2 NA 10-2 tampak belakang (terlampir) Form:circular

Elevation:flat
Margim:entire

3 NA 10-3 tampak depan (terlampir) Form:circular

Elevation:flat
Margim:entire

4 NA 10-3 tampak belakang (terlampir) Form:circular

Elevation:flat
Margim:entire
4.1.2 Tabel pengamatan media PDA sampel air rawa
No Gambar Keterangan
1 -2
PDA 10 tampak depan (terlampir) Form:filamentaus
Elevation:flat dan umbonate
Margim:labate

2 PDA 10-2 tampak belakang (terlampir) Form:filamentaus

Elevation:flat dan umbonate
Margim:labate

3 PDA 10-3 tampak depan (terlampir) Form:circular

Elevation:flat, umbonate
Margim:entire
 4 PDA 10-3 tampak belakang (terlampir) Form:circular
Elevation:flat, umbonate
Margim:entire

4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini prkatikan diminta untuk melakukan isolasi dan
identifikasi dasar mikroba. Raktikum isolasi dan identifikasi ini bertujuan agar
praktikan dapat mengetahui dan melakukan isolasi miroba (bakteri dan
jamur) dan dapat mengidentifikasi mikroa. Dalam praktikum ini isolasi
menggunakan metode cawan tuang dengan prinsip aseptis.
Asepetik prosessing adalam metode pembuatan dalam container steril
dalam lingkungan terkontrol sedemikian rupa sehingga komtaminasi mikroba
tetap berada pada lavel yang dapat diterima (Lukas, 2006).
Isolasi mikroba merupakan cara memisahkan mikroorganisme biakan
yang bersifat murni. Banyak hal-hal penting atau prinsip-prinsip kerja yang
benar dapat memudahkan nantinya saat proses identifikasi mikroba.
Pour plate atau cawan tuang merupakan cara untuk memperoleh cara
biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme dengan
mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan
didinginkan dan kemudian dicawankan karena konsentrasi sel-sel mikroba
didalam eksperimen sebelumnya maka pengenveran dilakukan beberapa
tahan sehingga sekurang-kurangnya satu diantara cawan-cawan tersebut
mengandung koloni-koloni terpisah. Baik diatas permukaan maupun didalam
agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan
keterampilan yang tinggi.
Adapun hasil pengamatan yang diperoleh dari isolasi dan identifikasi
mikroba kali ini adalah sebagai berikut:
1. NA 10-2
Pada media ini berbentuk koloni circular (bulat), permukaan koloni
(elevation) terlihat datar (flat), tepi koloni (margin) terlihat berbentuk utuh
(entire). Jumlah koloni dalam media ini yaitu 21.
2. NA 10-3
Pada media ini koloni berbentuk circular (bulat), permukaan koloni
(elevation) terlihat dari samping rata (flat), tepi koloni utuh (entire). Jumlah
koloni dalam media ini adalah 2.
3. PDA 10-2
Pada media ini koloni berbentuk filamentaus (berbenang), permukaan koloni
(evelation) terlihat dari samping rata (flat) dan umbonate (membukit), tepi
koloni bergerigi (labate). Jumlah koloni dalam media ini adalah 1
4. PDA 10-3
Pada media ini koloni berbentuk cirkular (bulat), permukaan koloni
(evelation) terlihat dari samping rata (flat) dan umbonate (membukit), tepi
koloni utuh (entire). Jumlah koloni dalam media ini adalah 11
Penggunaan NaCL 0,9% dalam praktikum ini adalah sebagai sumber
mineral mikroba yang dimana dibutuhkan untuk menjaga sel mikroba tetap
dalam keadaan yang isotonis. Jika hipotonis atau hiperyonis maka sel
mikroba akan pecah. Selain itu larutan NaCl merupakan larutan yang steril
dimana tidak ditumbuhi/ tidak adanya kiroba sehingga cocok untuk media
pengenceran.
Dilakukan pengenceran dengan harapan akan tumbuh koloni-koloni
yang lebih terpisah jauh sehingga dapat diambil satu koloni yang dianggap
murni untuk sementara.
Bila agar telah mengeras, sel tidak dapat bergerak lagi dan akan
tumbuh membentuk koloi. Bila suspense sel cukup encer, koloni akan
terpisah baik sehingga tiap koloni sangat besar kemungkinannya barasal dari
satu sel. Namun untuk memastikan, perlu diambil satu koloni dari jenis yang
dikehendaki. Dibuat suspense dengan air dan ditanamkan kembali pada
lempeng agar dengan mengulang beberapa kali pasti akan diperoleh biakan
murni.
Bakteri atau jamur tidak dapat dihitung secara tepat dengan
pemeriksaan mikroskopik kecuali bila sekurang-kurangnya ada 10 -8 sel untuk
tiap ml air dalam alam jarang mengandung lebih dari 10 -5 sel untuk tiap ml
karena itu metode yang digunakan adalah perhitungan pada lempeng
pembenihan. Karena hanya sel-sel yang sanggup membentuk koloni yang
dihitung mka metode ini dikenal pula sebagai perhitungan sel hidup.
Pengenceran diulang berturut-turut sampai terdapat pengenceran yang
mengandung antara 30 dan 300 sel-sel pembentuk koloni ntuk tiap ml,
karena bahan asli bisa mengandung sampai 1 juta bakteri hidup, maka perlu
dilakuukan pengenceran sampai 10-5 alasan untuk embatasan koloni ini ialah
kpada lebih dari 300 koloni maka lempeng pembenihan menjadi terlalu
padat untuk memngkinkan tiap sel membentuk koloni yang dapat terlihat
sedangkan bila koloni kurang dari 300 makan persen kejelian perhitungan
terlalu cair.
Factor yang dapat mempengaruhi jasad renik yang dapat tumbuh pada
lempeng agar antara lain adalah:
1. Jenis pembenihan yang digunakan
2. Suhu pengeraman.
3. Tidak adanya oksigen (areob/anareob)
Factor kesalahan yang terjadi adalah penggunaan blue tip harus
dipasangkan secara rapat pada mikropipet agar tidak terlepas pada
mikropipet agat tidak terlepas pada saat pengambilan sample. Kesalah
dalam perhitungan dan pengamatan mikroba, sehingga mempengaruhi hasil
pengamatan. Tangan yang belum disterilkan dengan alcohol, bisa membuat
media, sample dan alat yang digunakan terkontaminasi. Kurang hati-hati
dalam menghomogenkan media ketika dituangkan kedalam cawan petri
sehingga bisa menyebabkan media tumpah dan terkontaminasi.
Media NA basa diinkubasi pada waktu 24 jam sedangkan media PDA
memerlukan waktu 48 jam. Waktu ini dipilih sebab pada dasarnya kurang
lebih setelah 12 jam, akan tampak koloni-koloni pada permukaan medium,
pada saat 24 jam satu koloni saja dapat terdiri dari 50-72 generasi sel yang
timbul dari satu tunggal saja. Dengan jumlah sekian sudah dapat dilakukan
pengamatan selain itu masa inkubasi lebih dari waktu yang telah ditetapkan
(24-48 jam) maka sel-selnya akan rusak.
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Dari praktikum isolasi dan identifikasi dasar mikroba yang telah
dilakukan dilaboratorium dapat ditark kesimpulan bahwa:
1. Isolasi mikroba merupakan cara memisahkan mikroorganisme biakan yang
bersifat murni. Banyak hal-hal penting atau prinsip-prinsip kerja yang benar
dapat memudahkan nantinya saat proses identifikasi mikroba.
2. Ada bermacam-macam teknik isolasi yaitu dengan pengenceran, penuangan,
cawan gores, cawan tuang, pada agar cawan, pada medium cair dan sel
tunggal.
3. Pada media NA 10-2 media berbentuk circular, permukaan koloni terlihat flat
dan tepi koloni terlihat entire. Pada NA 10 -3 berbentuk circular, permukaan
koloni terlihat flat dan tepi koloni terlihat entire. Pada PDA 10-2 media
berbentuk filamentaaus,permukaan koloni terlihat flat dan umbonate, tepi
koloni terlihat labate. Pada PDA 10-3 media terlihat berbentuk circular,
permukaan koloni terlihat flat dan umbonate dan tepinya terlihat entire.

5.2 Saran
Diharapkan dalam praktikum isolasi dan identifikasi dasar mikroba ini
praktikan dapat melakukan isolasi secara benar dan mematuhi metode
aseptis. Dan diharapkan pula agar semua praktikan dapat melaksanakan
kegiatan isolasi tidak hanya dengan melihat saja.

DAFTAR PUSTAKA
Bonang, Gerard & Enggar S Koeswardono. 1982. Mikorobiologi Kedokteran.
Gramedia: Jakarta.
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.
Galung, Firman Santhy. 2009. http://firmangalung07.blogspot.com/. Dikases pada
tanggal 11 April 2011 pukul 09.19 WITA di Samarinda.
Lucar, Stefanus. 2006. Formulasi Steril. Andi: Yogyakarta.
Muslim, Ahmadi. 2011. http://pengujiankadarpengendalian.blogspot.com/. Diakses
pada tanggal 11 April 2011 pukul 08.28 WITA di Samarinda.
Perlczar, Michael. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI-Press: Jakarta.

III. TINJAUAN PUSTAKA

3.1 Pewarnaan Gram

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula

diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah
satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu
prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari
pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel,
dan penataan sel.

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram
negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram 1884.
Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena
menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena
pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga
bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu gram negatif dan gram positif.

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Karena bakteri gram positif bakteri yang dapat menahan kompleks pewarnaan
primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur dan sel bakteri berwarna biru
gelap atau ungu. Sedangkan baktri gram negatif merupakan bakteri yang
kehilangan kompleks ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun
kemudian terwarnai dengan pewarnaan tandingan, yaitu safranin sehingga sel-sel
tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan dan mempunyai dinding sel
 tipis yang berada di antara dua lapis membran sel kegunaannya yaitu, untuk
melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan memberikan sifat reaksi
pewarnaan bakteri yang dapat diketahui dengan melihat apakah termasuk gram
negatif (berwarna merah) atau gram positif (berwarna biru).

Dalam melakukan pewarnaan Gram terdapat empat macam tahap yang

dilakukan antara lain adalah pemberian warna utama Gram A berupa larutan Kristal
violet berwarna ungu. Selanjutnya adalah pengintensifan warna utama gram B
berupa larutan kalium iodida kemudian pencucia dekolorisasi Gram C berupa
alkohol. Dan yang terakhir adalah pemberian warna penutup/pewarna
tandingan/counterstain Gram D larutan safranin berwarna merah muda.

Ada dua teknik untuk membekukan prosedur warna Gram yang hasilnya setara
ialah teknik Hucker dan teknik Burke. Teknik Burke dalam prosedur ini dikenakan
pada sel bakteri yang telah difiksasi, hasil pewarnaan pada bakteri Gram positif
berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif berwarna merah muda
(Ulfah, 2011).

3.2 Zat Warna

Pewarnaan gram dapat membedakan bakteri dalam dua kelompok yaitu bakteri
gram positif dan gram negatif. Teknik pewarnaan ini menggunakan empat macam
reagen yang berbeda yaitu :

a. Kristal violet (pewarna primer) yang digunakan pertama kali dan sel yang
terwarnai akan berwarna biru keunguan (violet).
b. Grams Iodine (mordant), yaitu substansi yang dibuat dari campuran larutan yang
kompleks, untuk memperkuat ikatan pewarna primer. Hasil dari ikatan antara
kompleks kristal violet dan iodine akan mewarnai sel secara intensif.
c. Ethyl Alkohol 95 % (agen pendekolorisasi), yaitu merupakan reagen yang
mempunyai dua fungsi yaitu sebagai agen pendehidrasi protein. Aksi ini dapat
dideterminasi melalui jumlah asam lemak yang ada pada dinding sel bakteri.
d. Safranin (warna penutup), yaitu warna terakhir yang menyebabkan warna merah
pada sel, terutama sel yang menyebabkan warna merah pada sel yang telah
mengalami dekolorisasi. Pada gram negatif, setelah dekolorisasi, pewarna terkhir ini
 akan diserap. Pada sel gram positif, akan berwarna biru keunguan yaitu warna
primer.
(Mukarromah, 2009).

3.3 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan

Hasil pewarnaan tergantung beberapa faktor antara lain:

1. Fiksasi

Sebelum mikroorganisme, khususnya bakteri di warnai harus dilakukan fiksasi

terlebih dahulu. Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik dengan
pemanasan atau dengan freeze drying atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan
menggunakan agensia kimia.

Agen kimia yang dapat dipakai antara lain sabun, fenol , dan formalin.

Fiksasi perlu dilakukan sebelum perwarnaan mikroba berfungsi untuk :

a. Merekatkan sel mikroba pada gelas objek.

b. Membunuh mikroorganisme secara cepat dan tidak menyebabkan perubahan
perubahan bentuk dan strukturnya.
c. Mengubah afinitas (daya ikat ) zat warna.
d. Membuat sel- sel mikroba lebih kuat.
e. Mencegah otolisi sel.
f. Mempertinggi sifat reaktif gugus gugus tertentu.

2. Peluntur Zat Warna

Peluntur zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel
yang telah diwarnai. Peluntur zat warna (decolorizer) berfungsi untuk menghasilakn
kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Ditinjau dari kekuatan ikatan antara
sel dengan zat warna maka dikenal beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan
alkohol dan tahan air. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna telah diikat kuat
oleh sel sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh asam, demikian pula tahan
alkohol dan tahan air masing- masing tidak dapat dilunturkan oleh alkohol dan air.

3. Intensifikasi Pewarnaan

Zat warna dapat diintensfikasi dengan beberapa cara misalnya dengan

mempertinggi kadar zat warna, mempertinggi temperatur pewarnaan (60-90 oC) dan
 memambah suatu mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat
menyebabkan sel - sel mikroba dapat diwarnai lebih intensif atau menyebabkan zat
warna terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan dengan cara
pewarnaan tanpa di beri mordan.

4. Substrat

Setiap zat warna apakah zat warna asam atau zat warna basa dapat bereaksi
dengan konstituen sel tertentu. Oleh karena itu, substrat organik seperti lipida,
protein, asam-asam, nukleat dan karbohidrat juga mempengaruhi pewarnaan. Atas
dasar macam zat warna yang diserap oleh sel, dapat dibedakan :

a. Sel - sel yang basofil.

b. Sel - sel asidofil atau oksifil.
c. Sel - sel yang sundafonil.

5. Zat Warna Penutup atau Zat Warna Lawan

Zat Warna Penutup atau Zat Warna Lawan adalah suatu zat warna basa yang
berbeda warnanya dengan zat warna mula- mula digunakan. Fungsi dari Zat Warna
Penutup adalah memberikan warna pada sel yang berbeda warnanya dengan zat
warna mula-mula (Waluyo, 2010).

3.4 Aplikasi Pewarnaan Gram

Identifikasi Mikroba Anaerob Dominan Pada Pengolahan Limbah Cair

Pabrik Karet Dengan Sistem Multi Soil Layering (Msl)

1. Pengolahan limbah cair karet dengan menggunakan reaktor MSL

Reaktor MSL yang digunakan dalam kondisi reaktor sudah steady state yaitu
kondisi dimana efluen dari reaktor MSL memiliki nilai yang sudah stabil dilihat
berdasarkan enam parameter yaitu BOD, COD, TSS, total amoniak, total nitrogen
dan pH dengan laju aliran saat pengolahan optimum.

2. Pengambilan sampel tanah pada tiga lapisan paling atas dengan jarak 5 cm,
10 cm, 25 cm dari permukaan MSL.
3. Identifikasi Bakteri
a. Sterilisasi alat dan bahan menggunakan inkubator autoklaf.
b. Isolasi bakteri dengan menggunakan medium nutrient agar (NA) yang
 berbentuk padat, sehingga terbentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya.
c. Penghitungan total bakteri dengan alat penghitung koloni (colony counter).
d. Pemurnian bakteri dengan menggunakan medium NA modifikasi. Teknik isolasi
yang digunakan adalah metode preparat spread plate atau streak plate.
e. Pengamatan secara makroskopis terhadap perbedaan warna, bentuk permukaan
dan pinggiran koloni yang dilakukan setiap tahapan isolasi bakteri.
f. Pewarnaan gram menggunakan teknik pewarnaan bertingkat.
g. Pengamatan secara mikroskopis.
h. Uji reaksi biokimia.
4. Mikroorganisme Dominan

Untuk mendapatkan jenis bakteri dominan yang berperan dalam pengolahan

biologis limbah cair karet dilakukan pencocokan karakteristik fisik dan biokimia
(Helard, 2005).

IV. METODOLOGI PERCOBAAN

4.1 Bahan dan Fungsi
Adapun bahan yang digunakan dalam percobaan adalah :
1. Air rendaman pir
Fungsi : sebagai sampel yang akan diamati mikroba akuatiknya.
2. Air parit Suka Ramai
Fungsi : sebagai sampel yang akan diamati mikroba akuatiknya.
3. Kristal violet

Fungsi : sebagai bahan pewarna primer.

4. Larutan iodin
Fungsi : untuk memperkuat ikatan pewarna primer.
5. Aseton Alkohol
Fungsi : sebagai zat pencuci larutan kristal violet.
6. Safranin
Fungsi : sebagai larutan pewarna yang tetap/zat pewarna.

4.2 Alat dan Fungsi

Adapun peralatan yang digunakan dalam percobaan adalah :
1. Mikroskop
Fungsi : untuk melihat mikroba yang diletakkan di bawah lensa objektif dengan
mengatur perbesaran yang tepat agar objek terlihat dengan jelas.
2. Kawat inokulasi
Fungsi : untuk menggoreskan sampel bakteri dan jamur pada kaca benda
3. Kaca benda
Fungsi : untuk meletakkan objek yang akan diamati.
4. Lilin
Fungsi : sebagai sumber api untuk proses fiksasi dan mensterilkan kawat inokulasi.
 5. Pipet tetes
Fungsi : untuk mengambil bahan pewarna pada saat proses pewarnaan.
6. Penjepit Tabung
Fungsi : alat untuk menjepit kaca objek pada proses fiksasi dan pencucian.
7. Tisu
Fungsi : untuk mengeringkan kaca benda dari cairan yang tersisa.

4.3 Prosedur Percobaan

4.3.1 Prosedur Pengamatan Mikroba Lingkungan
1. Mikroskop diatur sedimikian rupa sehingga dapat digunakan dengan jelas dan baik,
antara lain dengan membersihkan kaca dan cermin dengan tisu, serta mengatur
penyinaran yang baik.
2. Kaca objek dibasahi dengan aquadest dan dilap dengan tisu hingga bersih.
3. Dengan memakai pipet tetes atau kawat inokulasi, sampel air parit Suka Ramai
ditetes atau digoreskan pada kaca objek.
4. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran yang sesuai dan diatur
sejelas mungkin.
5. Digambarkan hasilnya. Hasil yang terlihat dibandingkan dengan referensi agar
mikroba tersebut dapat diidentifikasi.

4.3.2 Prosedur Pewarnaan Gram

1. Mikroba dibiakkan selama 20-24 jam dalam rendaman air pir.
2. Preparat diambil dengan menggunakan kawat inokulasi yang telah di serilkan
terlebih dahulu dengan lilin.
3. Bakteri digoeskan ke atas kaca objek lalu dibiarkan kering diudara terbuka
kemudian kaja objek di fiksasi diatas api lilin.
4. Diamati di bawah mikroskop.
5. Digambar hasil yang didapat.
6. Preparat dibasahi dengan kristal violet dibiarkan selama 30-60 detik lalu preparat
dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih kemudian dicuci lagi dengan air.
7. Kemudian preparat dibasahi dengan iodin dibiarkan selama 30-60 detik lalu
preparat dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih kemudian dicuci lagi
dengan air.
8. Dilanjutkan dengan menggunakan alkohol aseton dibiarkan selama 30-60 detik.
Kemudian dicuci lagi dengan air.
9. Kemudian preparat dicuci dengan pewarna lengkap safranin dibiarkan selama 30-
60 detik. Kemudian dicuci lagi dengan air.

10. Preparat dikeringkan dengan tisu lalu diamati dengan mikroskop dan hasilnya
digambar.
 V. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Pembahasan
5.1.1 Pengamatan Mikroba Lingkungan

Pengamatan mikroba lingkungan adalah suatu kegiatan yang merujuk pada

indentifikasi suatu mikroorganisme yang terdapat pada suatu lingkungan yaitu pada
air. Pengamatan ini dapat memberi gambaran mikroba yang terdapat pada
lingkungan yang diamati, baik morfologi maupun fisiologi dari bakteri tersebut. Dari
pengamatan yang telah dilakukan pada air parit pasar Suka Ramai diperoleh bakteri
yang terkandung adalah Rhodospirillum rubrum.

Rhodospirillum adalah genus bakteri fotosintetik dari Rhodospirillaceae

keluarga. sel-sel mereka umumnya berbentuk spiral, polarly flagellated dan
mengandung vesikuler, pipih membran fotosintesis ditumpuk (Singleton dan
Sainbury). Mereka berkisar dari tiga sampai sepuluh mikrometer panjang dan satu-
setengah sampai satu setengah mikrometer satu di lebar. Salah satu jenis spesies
dari genus ini adalah Rhodospirillum rubrum adalah bakteri gram negatif yang
mengandung asam lemak tak jenuh dan jenuh (Amirien, 2011).

5.1.2 Pewarnaan Gram

Pada percobaan dari tabel pengamatan untuk sampel air rendaman pir 20 jam
ditemukan bakteri Rhodospirillum rubrum. Rhodospirillum adalah genus bakteri
fotosintetik dari Rhodospirillaceae keluarga. sel-sel mereka umumnya berbentuk
spiral, polarly flagellated dan mengandung vesikuler, pipih membran fotosintesis
ditumpuk (Singleton dan Sainbury). Mereka berkisar dari tiga sampai sepuluh
mikrometer panjang dan satu-setengah sampai satu setengah mikrometer satu di
lebar. Salah satu jenis spesies dari genus ini adalah Rhodospirillum rubrum adalah
bakteri gram negatif yang mengandung asam lemak tak jenuh dan jenuh (Amirien,
2011).

Oscillatoria adalah genus dari berserabut Cyanobacterium yang adalah nama

untuk osilasi dalam gerakannya. Filamen dalam koloni dapat geser bolak-balik
terhadap satu sama lain sampai massa seluruh reorientasi ke sumber cahaya. Hal
ini umumnya ditemukan di air-air palung, dan terutama biru-hijau atau coklat-hijau.
Oscillatoria adalah organisme yang mereproduksi oleh fragmentasi. Oscillatoria
bentuk filamen panjang sel yang dapat masuk ke fragmen disebut hormogonia.

Hormogonia dapat tumbuh menjadi filamen baru yang lebih panjang. Istirahat
dalam filamen biasanya terjadi di mana sel-sel mati (necridia) yang hadir
Oscillatoria menggunakan fotosintesis untuk bertahan hidup dan bereproduksi..
Setiap filamen Oscillatoria terdiri dari trikoma yang terdiri dari baris sel. Ujung
trikoma berosilasi seperti pendulum (Wikipedia, 2012).

Mekanisme pewarnaan gram yaitu kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). Iodium yaitu
pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme
target. Pemberian yodium pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Alkohol-aseton merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan :

1. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu.

2. Bakteri menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna
utama setelah perlakuan dengan alkohol.

Dari percobaan yang telah dilakukan pada air rendaman pir 20 jam diperoleh
bakteri Rhodospirillum rubrum dan pada air rendaman pir 24 jam diperoleh bakteri
Oscillatoria. Identifikasi mikroba yang didapat tidak sesuai dengan sumber yang ada
disebabkan waktu dekolorisasi terlalu pendek maka sel bakteri gram positif
mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama sedangkan bakteri
gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. Dimana
bakteri Rhodospirillum rubrum dan Oscillatoria merupakan bakteri jenis gram
negatif yang ditandai dengan warna merah (Tarigan, 2011).

Secara teori salah satu bakteri yang menyerang buah pear adalah Erwinia
amylovora. Erwinia adalah sebuah genus bakteri gram negatif dari famili
Enterobacteriaceae (Dwi, 2011).
 Sedangkan hasil yang didapat adalah bakteri Rhodospirillum rubrum dan
Oscillatoria sehingga hasil yang didapat tidak sesuai dengan teori. Hal ini
disebabkan oleh tercemarnya biakan (Kurniawan, 2012).

Jadi dapat disimpulkan percobaan untuk pewarnaan gram tidak sesuai dengan
teori dan bakteri yang terdapat pada pengamatan buah pir juga tidak sesuai
dengan teori.

Referensi :

Amiren, Ronye. 2011. Rhodospirillum Rubrum. roniamirin.blogspot.com/2011/04/

rhodospirillum-rubrum.html. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Dhyfa, Faiz. 2010. Rhodospirillum Rubrum. http://www.scribd.com/doc/41981934/ Macam-

macam-Bakteri. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Dwi, Apriyanto. 2011. Erwinia Amylovora.

http://ulerkepompongkupu.blogspot. com/2011/12/erwinia-
amylovora_08.html. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Helard, Denny dan Putri Sri Komala. 2005. Identifikasi Mikroba Anaerob Dominan Pada
Pengolahan Limbah Cair Pabrik Karet Dengan Sistem Multi Soil Layering
(Msl). repository.unand.ac.id/4048/1/Deny_Helart_Artikel.pdf.
Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Kurniawan, Prasetyo Hendy. 2012. Identifikasi Bakteri Morfologi Koloni Dan Morfologi Sel.
http://www.scribd.com/doc/89466956/P-Mikrobiologi-Acara-4-Identifikasi-Bakteri-
Morfologi-Koloni-Dan-Morfologi-Sel. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Mukarromah, Shofiyani. 2009. Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar. http://www

.scribd.com/doc/74672990/11/Pewarnaan-Gram. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Tarigan, Era. 2011. Tujuan Membedakan Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif.
http://www.scribd.com/doc/53611697/25146430-Tujuan-Membedakan-Bak teri-
Gram-Positif-Dan. Diakses pada : 7 Oktober 2012.
Ulfah, Adelaide Maria. 2011. Pewarnaan Gram. http://adelaidearsenal.blogspot
.com/2011/10/ jurnal-pewarnaan-gram.html. Diakses pada : 7 Oktober 2012

Waluyo, Lud. 2010. Teknik dan Metode Dasar Mikrobiologi. Universitas Muhammadiyah
Malang : Malang.

Wikipedia. 2012. Oscilatoria. http://en.wikipedia.org/wiki/Oscillatoria. Diakses pada : 7

Okrober 2012.

BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Prinsip Percobaan

Berdasarkan bentuk pertumbuhan koloni dan karakteristik pada bakteri.
II.2 Tujuan Percobaan
Untuk mempelajari dan mengetahui bagaimana bentuk pertumbuhan, koloni dan karakteristikpada
bakteri.
 BAB II
LANDASAN TEORI

II.1 Teori Dasar

Adanya pertumbuhan mikroorganisme dalam suatu media dapat ditunjukkan dengan adanya
perubahan pada permukaan atau seluruh bagian media tersebut. Dalam makanan misalnya, adanya
lapisan putih/ abu-abu pada permukaan roti, mulurnya kuah sop atau penggumpalan susu dan adanya
aroma asam manunjukkan telah terjadi kontaminasi oleh mikroorganisme.
Sayangnya pertumbuhan mikroorganisme tersebut tidak dapat dilihat jelas secara visual. Secara
umum, adanya kontaminasi hanya dapat terlihat sebagai bintik- bintik/ gumpalan/ lapisan yang berwarna
putih, abu-abu, kadang-kadang kuning atau merah. Keadaan seperti itu disebabkan oleh pertumbuhan
koloni yang bertumpuk, biasanya terdiri dari banyak jenis. Kelompok atau jenis mikroorganismenya tidak
dapat ditentukan dengan mudah, sehingga perlu dilakukan proses pemisahan bertahap yang disebut:
isolasi, kemudian dilanjutkan dengan identifikasi berdasarkan sifat-sifat biokimianya.
Reaksi identifikasi yang umum dilakukan untuk bakteri adalah: melihat gerakannya (motilitas), adanya
komponen sel yang khas (spora, kapsul), pewarnaan gram dan sifat biokimia seperti IMVIC (reaksi
pembentukkan indole, sifat asam dengan indikator metil merah, voges-proskauer, inositol dan
pertumbuhannya dalam media cimmons citrate) serta beberapa reaksi pembentukkan gula pada media
TSIA (Triple Sugar Iron Agar).
 BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN

III.1 Disiapkan bahan dan alat berikut:

No. NAMA BAHAN/ ALAT JUMLAH/ KELOMPOK KETERANGAN
1 Kaca objek + tutup 5 set
Tidak perlu steril
2 Kaca obyek tetes gantung 1 buah
3 Kultur solate bakteri 2 jenis Koloni putih
4 Larutan fukhsin 5 ml
5 Larutan asam sulfat 1% 5 ml
6 Pewarna biru metilen 5 ml
7 Air steril 5 ml
8 Minyak imersi 5 ml
Tidak perlu steril
9 Safranin 5 ml
10 Karbol gentian violet 5 ml
11 Lugol 5 ml
12 Alkohol 5 ml
13 Kertas saring Secukupnya

III.2 Pergerakan Bakteri

1. Disiapakan kultur bakteri hasil isolasi dari P-3. Pilih koloni yang dapat memberikan ciri pertumbuhan yang
terbaik, misalnya: koloni putih, kuning, abu-abu, atau yang lain.
2. Siapakan juga 2 buah kaca obyek yang telah dibersih dan kering.
3. Flambir sebuah kaca objek dan dibiarkan dingin, teteskan sedikit air steril dan oleskan dengan sedikit
cuplikan kultur satu jenis bakteri tersebut. Campurkan kultur dengan air sehingga menjadi suspensi yang
encer, kemudain ditutup dengan kaca penutup. Gerakan bakteri akan terlihat lebih jelas jika digunakan
kaca obyek tetes gantung.
4. Preparat segar yang telah siap dilihat di bawah mikroskop, dan amati pergerakan bakterinya. Bakteri akan
bergerak dengan arah atas-bawah atau kiri-kanan secara teratur . Gerakan yang tidak terarah bukan
merupakan gerak bakteri.
Percobaan ini harus dilakukan dengan segera, karena bakteri akan cepat mati.
5. Lakukan percobaan di atas untuk 1 jenis mikroorganisme yang lain.
6. Catat pengamatannya dalam tabel untuk memudahkan dalam membandingkannya.
III.3 Pemeriksaan Spora Bakteri
1. Siapkan kultur bakteri isolat putih, kemudian disuspensikan sedikit sapuan bakteri dan tambahkan 1 tetes
larutan fuksin.
Campurkan homogen kemudian panaskan di atas penangas air yang bersuhu 80 0Cselama 10 menit.
Usahakan jangan sampai memdidih atau menjadi kering.
2. Oleskan tadi digenangi dengan larutan asam sulfat 1% selama 2 detik, lalu dicuci dengan air mengalir.
3. Genangi olesan dengan pewarna biru- metilen selama 5 menit
Kelebihan pereaksiwarna dibuang, kemudian dibilas lagi dengan air mengalir, dan selanjutnya dikeringkan
dengan bantuan kertas saring. Usahakan olesan preparat tidak terhapus dengan tissu.
4. Teteskan sedikit minyak imersi di atas preparat,lalu di lihat dibawah mikroskop dengan perbesaran
10xdan dilanjutkan 100x.
5. Amati dan catat pengamatan mikroskop. Spora akan terlihat berwarna merah dengan dikelilingi sel
vegetatif yang berwarna biru.
III.4 Pemeriksaan Kapsul Bakteri
1. Disiapkan biarkan isolasi bakteri jenis lain, pewarnaansafranin, minyak imersi. Sediakan pula 1 buah
kaca obyek yang telah bersih dan kering.
2. Letakan sedikit sapuan kultur bakteri dan suspensi dengan 1 tetes air steril. Campurkan suspensi tersebut
dengan larutan karbol gentian violet dengan bantuan ujung kaca obyek kedua dengan posisi sebelah
kanan dan membentuk sudut 45odengan kaca obyek petama. Kaca obyek kedua ditarik ke arah kiri
sehingga suspensi bakteri tersapu merata dengan membentuk lapisan tipis di atas kaca obyek.
3. Preparat difiksasi sebanyak 3 kali di atas nyala api, kemudian ,digenangi dengan larutan.
4. Safranin selama 5 menit. Pereaksi warna yang berlebih dibuang, dan dikeringkan dengan bantuan kertas
saring.
5. Preparat dioleskan dengan sedikit minyak imersi, lalu diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran
10x dilanjutkan 100x.
6. Gambarkan hasil pengamatannya dengan teliti. Sel baktri kan berwarna merah dan kapsul bakteri
akan terlihat sebagai bagian kosong (transpsran) di sekitar tumbuh bakteri.
III.5 Pewarnaan Gram untuk bakteri
1. Disiapkan 2 buah kaca obyek, isolat biakan(koloni lain lagi), karbol gentian violet, pereaksi lugol,
alkohol 95%,pewarna safranin, minyak imersi.
2. Sapukan sedikit biakan isolat bakteri di atas kaca obyek, ditambah 1 tetes air, kemudian disuspensikan.
3. Kaca obyek diletakan di atas bak pewarna, kemudian digenangi dengan karbol gentian violet selama 1
menit. Kelebihan zat warna dibuang, dan di bias denhan air mengalir.
4. Olesan digenangin dengan lugol selama 2 menit, pereaksi berlebih dibuang, dan dibilas dengan air
mengalir.
5. Olesan digenangi dengan alkohol tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai semua zat warna hilang,
kemudian dibilas dengan air mengalir.
6. Pewarnaan yang terakhir adalah dengan safranin selama 1 menit, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas
dengan air yang mengalir, kemudian dikeringkan dengan kertas saring.
7. Preparat dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x atau 100x.
8. Hasil percobaan digambar dengan teliti. Sel bakteri yang berwarna biru menunjukan bakteri masuk
kelompok gram positif, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah. Bagiamana dengan isolat
yang sudah di dapat, ada perbedaan kelompok Gram ada.
III.6 Identifikasi Bakteri dengan Media TSIA
NO NAMA BAHAN/ALAT JUMLAH/KELOMPOK KETERANGAN
1. Media TSIA (ada bagian 2 tabung kecil@2ml
tegak & miring)
2. Larutan pepton 2 tabung kecil@1ml
3. Larutan alfa-naftol 5 ml
4. Media MR-VP 4 tabung@1 ml
5. Larutan KOH 10% 5 ml

1. Disiapkan 2 tabung reaksi kecil dan steril ,media TSIA, kultur bakteri isolat putih yang berbeda bentuk atau
selnya.
2. Isikan median TSIA bersuhu 45oC setinggi 2 cmpada kedua tabung, kemudian diletakan di atas alas
sehingga posisinya rendah. Usahan media membentuk posisi tegak dengan bagian atas miring tetepi tidak
menyantuh kapas. Diamkan sekirat 30 menit hingga media menjadi padat.
3. Inokolasikan satu jenis kultur bakteri pada satu tabung dan jenis bakteri kedua pada tabung yang lain.
Media tegak ditusukkan, sedangkan media yang miring digores.
4. Inkubasikan kedua tabung pada suhu 35-37 oC selama 24-48 jam.
5. Catat pengamantannya sebagai berikut:
a) Bagian miring * berwarna kuning :laktosa/sakrosa(+)
* warna hitam : gas H2S (+)
b) Bagian tegak *berwarna kuning :glukosa (+)
*gelembung/media terangkai :gas (+)
*warna hitam :gas H2S (+)

III.7 Uji biokomia IMVIC untuk Bakteri

1. Disisapakan 8 buah tabung reaksi, suspensikan biakan 2 isolatbakteri (usahakan warnanya berbeda),
air pepton, media MR-VP, media Cimmoons citrat, pereaksi kovacks, indikataor metil merah, larutan alfa-
naftol, larutan KOH 10%.
2. Tabung nomor 1 & 5 : isi dengan 0,5 ml air pepton
Tabung nomor 2 & 6 dan 3 & 7: isi dengan 0,5 ml media MR-VP
Tabung nomor 4 & 8 : isi dengan 0,5 ml media Cimmons citrat(warna hijau).
3. Tabung 1-4 : diinukulasi dengan 1 ose bulat suspensi koloni-1 dan tabung 5-8 dengan suspensi koloni-2.
4. Semua tabung diinokulasi pada suhu 35-37 oC selama 24 jam.
5. Tabung 1 & 5 : tambahkan 1 tetes pereaksi kovacks memalui dinding tabung secara hati-hati.adanya
cincin berwarna merah
Menjukan indol (+).
6. Tabung 2 & 6 : tambahkan 1 tetes indikator metil merah (MM)
7. Tabung 3 & 7: tambahkan 1 tetes pereaksi alfa-nafton/dalam KOH10% . bila tarbentuk endapan warna
merah bata berarti VP (+).
8. Tabung 4 & 8: amati warnanya; terjadinya perubahan warna media menjadi biru menunjukan citrat (+).
9. Bagaimanakan hasil uji IMVIC untuk pasangan untuk bakteri kedua.
 BAB IV
HASIL PERCOBAAN

No. Pengamatan Keterangan

1. Pergerakan Bakteri Pergerakan bakteri tidak terlihat, kemungkinan dikarenakan
bakteri telah mati.

2. Pemariksaan Spora Bakteri Terlihat adanya spora .

~ Untuk MCA: terlihat spora berbentuk bulat kecil-kecil
~ Untuk MSA: terlihat spora berbentuk bulat pipih

3. Pemerikasaan Kapsul Bakteri Sel kapsul tidak terlihat,yang terlihat hanya warnanya merah
karena larutan yang ditambahkan kedalamnya.

4. Pewarnaan Gram untuk Bakteri Sel bakteri tersebut berwarna:

~ Untuk MSA: (merah) menunjukkan bahwa bahwa bakteri
tersebut memiliki pewarnaan gram (-)
~ Untuk MCA: (biru) menunjukkan bahwa bakteri tersebut
 memiliki perwarnaan gram (+)

5. Identifikasi Bakteri dengan Pada percobaan ini dua-duanya menggunakan media miring
Media TSIA ~ Pada media 1: digores dengan isolate MSA dan terdapat koloni
MCA MSA yang banyak berlendir pada daerah yang digores dan ditusuk
dan media berwarna orange.
~ Pada media 2: digores dengan isolate MCA dan terdapat
koloni yang sedikit berlendir dan media berwarna merah
6. Uji Biokimia IMVIC untuk Bakteri ~ Sebelum ditetesi pereaksi ~ Setelah ditetesi pereaksi
~Tabung 1 & 5 (air pepton) konvacks konvacs
- Pada tabung -Pada tabung 1:terbentuk
Tabung 1 Tabung 2 1:diinokulasikan menggunakan cincin yang berwarna kuning
media MSA dan diindikasikan kehijauan (-)
terdapat serabut kapang. -Pada tabung 5:terbentuk
- Pada tabung cincin yang berwarna merah
5:diinokulasikan menggunakan (+)
media MCA dan diindikaikan
lebih sedikit serabut
dibandingkan MSA
~ Tabung 2 & 6 (MR-VP) ~ Sebelum ditetesi indikator ~ Setelah ditetesi indikator
Tabung 2 Tabung Metil Merah (MM) Metil Merah (MM)
6 -Pada tabung 2:diinokulasikan -Pada tabung 2:larutan
menggunakan media MSA, berwarna kuning (-)
larutan menjadi berwarna -Pada tabung 6:larutan
keruh >>> yang diindikasikan berwarna merah (+)
hidupnya mikroorganisme
-Pada tabung 6:diinokulasikan
menggunakan media MCA,
larutan menjadi berwarna
keruh >>
~ Tabung 3 & 7 (MR-VP) ~ Sebelum ditetesi pereaksi ~ Setelah ditetesi pereaksi
 KOH 10 % alfa-naftol
Tabung 3 Tabung 7 -Pada tabung 3:diinokulasikan -Pada tabung 3: larutan keruh
menggunakan media MSA, kekuningan (-)
larutan menjadi berwarna -Pada tabung 7: larutan keruh
keruh >>> yang diindikasikan kekuningan (-)
hidupnya mikroorganisme
-Pada tabung 7: diinokulasi
menggunakan media MCA,
larutan menjadi berwarna
keruh >>
~ Tabung 4 & 8 (Cimmons ~ Pada tabung 4: diinokulasikan dengan media MSA berwarna
citrate) biru, citrat (+)
~ Pada tabung 8: diinokulasikan menggunakan media MCA
berwarna hijau, citrat (-)
 BAB V
PEMBAHASAN

Dalam mengidentifikasi bakteri, kita perlu mengamati pergerakan bakteri, pemeriksaan spora
bakteri, pemeriksaan kapsul bakteri, pewarnaan gram, identifikasi bakteri dengan media TSIA, dan uji
biokimia IMVIC untuk bakteri.
Pada pergerakan bakteri, yang diamati adalah bakteri dari media MSA dan MCA. Koloni yang
berada pada media MSA berwarna kuning dan berlendir, sedangkan koloni yang berada pada media MCA
berwarna kehitam-hitaman. Pada saat menggunakan kaca obyek harus dipanaskan terlebih dahulu agar
steril dan dibiarkan kering lalu teteskan air steril dan suspensikan koloni tersebut dengan air steril itu. Pada
saat diamati dibawah mikroskop ternyata tidak terlihat pergerakan bakteri, kemungkinan itu dikarenakan
bakteri tersebut cepat mati.Langkah ini dilakukan untuk MSA maupun MCA.
Pada pemeriksaan spora bakteri, kita menyiapkan kultur bakteri isolate putih dari media MSA dan
MCA, baik MSA maupun MCA yang disuspensikan kemudian ditambahkan larutan fukhsin kemudian
mencampurkannya dan memanaskan diatas penangas air tidak sampai mendidih agar bakteri tidak mati,
setelah itu menambahkan juga larutan asam sulfat 1% selama 2 detik lalu dicuci dengan aquadest
kemudian kaca obyek digenangi dengan pewarna biru metilen lalu dibilas lagi dengan aquadest dan
keringkan dengan kertas saring, setelah itu meneteskan minyak imersi diatas preparat kemudian dilihat
dibawah mikroskop, dan terlihat adanya spora, untuk MCA terlihat spora berbentuk bulat kecil-kecil
sedangkan untuk MSA terlihat spora berbentuk bulat pipih.
Pada pemeriksaan kapsul bakteri, menggunakan isolate bakteri jenis lain, pewarna safranin dan
minyak imersi. Kultur bakteri yang telah disapukan pada kaca obyek kemudian disuspensikan dengan 1
tetes air steril. Suspense tersebut dicampur dengan larutan karbol gentian violet, lalu preparat difiksasi 3x
diatas nyala api lalu digenangi dengan larutan safranin selama 5 menit, setelah itu mengoleskan sedikit
minyak imersi dan dilihat dibawah mikroskop, kita tidak melihat adanya kapsul bakteri yang terlihat hanyalh
warnanya yang berwarna merah akibat dari larutan yang ditambahkan kedalamnya.
Pada pewarnaan gram untuk bakteri digunakan media MSA dan MCA, koloni tersebut baik dari MSA
maupun MCA disuspensikan dengan 1 tetes air diatas kaca obyek, kaca obyek tersebut disimpan diatas
bak pewarna dan digenangi dengan karbol gentian violet selama 1 menit, lalu dibilas dengan air, kemudian
digenangi dengan alcohol tetes demi tetes selama 10 detik sampai semua warna menghilang dan dibilas
lagi dengan air mengalir, dan setelah itu pewarnaan yang terakhir yaitu dengan safranin selama 1 menit,
zat warna yang berlebih dibuang dan dikeringkan dengan kertas saring dan mengamati dibawah
mikroskop. Setelah diamati dibawah mikroskop, untuk MSA berwarna (merah) yang menunjukkan bahwa
bakteri tersebut memiliki pewarnaan gram (-), sedangakan untuk MCA berwarna (biru) yang menunjukkan
bahwa bakteri tersebut memiliki perwarnaan gram (+)
Dalam mengidentifikasi bakteri dengan menggunakan media TSIA, kita menggunakan media miring
dua-duanya, sebelum digores menggunakan MSA dan MCA media berwarna merah tapi setelah digores
dan didiamkan selama 3 hari dalam incubator, untuk MSA media menjadi berwarna kuning dan terdapat
koloni yang banyak mengandung lendir pada daerah yang digores dan ditusuk (+), sedangkan pada MCA
media masih tetap berwarna merah dan terdapat koloni yang sedikit berlendir jika dibandingkan dengan
MSA (-).
Pada uji biokimia IMVIC pada bakteri menggunakan 8 tabung reaksi dan suspensi biakan 2 isolat
bakteri yang warnanya berbeda. Pertama-tama tabung 1&5 diisi dengan 0,5 mL air pepton, 2&6 dan 3&7
diisi dengan 0,5 mL media MR-VP, 4&8 diisi dengan 0,5 mL media Cimmons citrate. Pada tabung 1-4
diinokulasikan dengan suspense koloni dari media MSA, tabung 5-8 diinokulasikan dengan suspension
koloni dari media MCA. Semua tabung tersebut diinkubasi pada suhu 35-37.
Setelah diinkubasi, tabung 1&5 (pepton) ditambahkan 1 tetes pereaksi konvacks melalui dinding
tabung, pada tabung 5 yaitu suspense koloni dari medi MCA terdapat cincin kuning kehijauanyang
menunjukan indol (-), sedangkan pada tabung 1 yaitu suspensi koloni dari media MSA terdapat cincin
berwarna merah yang menunjukan indol (+).
Pada tabung 2&6 (MR-VP) ditambahkan 1 tetes indicator Metil Merah (MM), pada tabung 2 yaitu
suspense koloni dari media MSA, adanya pembentukan larutan warna kuning sehingga MM (-), dan pada
tabung 6 yaitu suspensi koloni dari media MSA, adnya pembentukan larutan warna merahyang
menunjukan MM (+).
Pada tabung 3&7 (MR-VP) ditambahkan 1 tetes pereaksi KOH 10%. Dan ternyata pada tabung
tersebut tidak terbentuk endapan warna merah bata yang menunjukan VP (-).
Pada tabung 4&8 ( Cimons) setelah diamati ternyata pada tabung itu susupensi koloni dari media
MSA, warna berubah menjadi berwarna biru yang menunjukan citrate (+), sedangkan pada tabung 8 yaitu
suspense koloni dari media MCA, warna tidak berubah yaitu tetap berwarna hijau yang menunjukan citrate
(-).
 BAB V
KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukuan dapat disimpulkan bahwa :
Pada pemeriksaan pergerakan bakteri, tidak terjadi pergerakan. Yang dikarenakan bakteri telah mati.
Pada pemeriksaan spora bakteri, pada MCA terdapat spora bakteri yang berbentuk bulat-bulat kecil.
Sedangkan pada MSA terdapat spora bakteri berbentuk bulat-bulat pipih yang memanjang.
Pada pemeriksaan kapsul bakteri tidak terlihat adanya kapsul bakteri yang terlihat hanyalah warna pink
karena reagen yang digunakan yaitu Metil Merah.
Pada pewarnaan gram untuk bakteri, untuk MSA sel berwarna merah yang menunjukan bakteri masuk
kelompok Gram negatif, sedangkan untuk MCA sel berwarna biru yang menunjukan bakteri masuk
kelompok Gram positif.
Pada idetifikasi bakteri dengan media TSIA pada MSA media berubah menjadi warna kuning yang
menunjukan bakteri positif mengandung laktosa atau sakarosa. Sedangkan MCA tidak mengandung
glukosa karena warnanya tetap merah.
 DAFTAR PUSTAKA
tasyaariesta.wordpress.com/category/uncategorized/
Pelczar, M.J. and E.C.S Chan, Dasar-dasar Mikrobiologi, jilid 1 dan 2, terjemahan Ratna Siri Hadioetomo
dkk. , UI-Press, Jakarta, 2005