4.

Hasil dan Pembahasan

Pada praktikum pewarnaan mikroorganisme dilakukan dua macam pewarnaan yaitu
pewarnaan gram dan pewarnaan sederhana. Pewarnaan gram menggunakan bakteri S.
epidermidis dan E. coli, sedangkan untuk pewarnaan sederhana menggunakan bakteri
Acinetobacter dan S. epidermidis.
4.1 Fungsi dan Macam-Macam Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan bakteri dilakukan guna mempermudah pengamatan morfologi bakteri
dengan mikroskop. Pada praktikum kali ini dilakukan dua teknik pewarnaan bakteri yaitu,
a. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan bakteri dengan menggunakan pewarna
tunggal seperti Kristal violet, methylene Blue, safranin, dll. Pewarnaan sederhana
diaplikasikan pada bakteri yang yang dapat melekat setelah dilakukannya heat-fixed atau
fiksasi. Heat-fixing dapat membunuh bakteri, sehingga bakteri dapat melekat pada object
glass, mengkoagulasi protein sitoplasma agar lebih terlihat, serta melebarkan sel-sel pada
bakteri. Pewarna ini akan memberikan warna kontras antara bakteri dengan latar
belakang, Sehingga pewarnaan ini hanya bertujuan untuk melihat bentuk dari bakteri saja,
bukan untuk menentukan penggolongan bakteri gram negatif dan positif. Pada
pewarnaan sederhana hal pertama yang dilakukan adalah fiksasi terlebih dahulu. Setelah
fiksasi, preparat ditetesi dengan gentian violet kemudian ditunggu selama 1 sampai 2
menit sambil diratakan pada preparatnya. Jika sudah cukup waktunya, preparat dibilas
dengan air secara perlahan sampai larutan gentian violetnya hilang. Keringkan sekitar
preparat dengan tissue lalu tutup dengan cover glass dan diamati di bawah mikroskop.
Berikut ini adalah hasil dari pengamatannya :

Bakteri Acinetobacter, berbentuk Bakteri S. epidermidis, berbentuk

bacillus. coccus (bergerobol seperti anggur).
b. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram adalah pewarnaan pada bakteri yang bertujuan untuk mengetahui
golongan bakteri termasuk gram positif atau gram negatif. Pewarnaan ini menggunakan 4
macam bahan pereaksi yaitu, Kristal violet, Iodium, Etanol, dan Safranin yang digunakan
 secara berurutan. Bakteri gram positif menghasilkan warna biru – keunguan, sedangkan
bakteri gram negatif menghasilkan warna merah-merah muda. Pada pewarnaan gram hal
pertama yang dilakukan adalah sama dengan pewarnaan gram sederhana yaitu fiksasi.
Setelah fiksasi preparat digenangi dengan gentian violet (sebagai zat warna pertama) dan
ditunggu selama 1 sampai 3 menit, lalu dibilas dengan air mengalir secara perlahan.
Langkah ketiga preparat digenangi dengan iodium (mempertegas/memperkuat gentian
violet dengan membentuk crystal violet-iodine complex) dan ditunggu selama 2 menit, lalu
dibilas dengan air mengalir. Langkah keempat preparat digenangi dengan etanol (sebagai
dekolorisasi/pelunturan warna) dan ditunggu selama 30 detik, lalu dbilas lagi. Langkah
kelima preparat digenangi dengan safranin (pemberi warna merah) dan ditunggu selama
30 detik, lalu dibilas. Keringkan preparat dengan tissue secara perlahan, lalu tutup dengan
cover glass dan diamati di bawah mikroskop. Berikut ini adalah hasil dari pengamatannya :

Bakteri Acinetobacter merupakan Bakteri S. epidermidis merupakan

bakteri gram negatif ( berwarna bakteri gram positif ( berwarna
merah muda). biru ).

4.2 Cara membuat Preparat Oles yang Baik

Pembuatan preparat juga menjadi kunci dari keberhasilan pengamatan dengan
mikroskop. Jenis preparat yang digunakan dalam pewarnaan bakteri adalah preparat oles.
Alat dan bahan yang digunakan untuk membuat peparat oles ini adalah kawat ose, alkohol,
tissue, media agar cawan miring, cover dan objek glass. Cara membuat preparat oles yang
baik yaitu :
a. Cover glass dan objek glass disterilkan dahulu dengan alkohol, kemudian dikeringkan
dengan tissue. Gunakan tissue yang dapat meresap air dengan baik, karena serat-serat
tissue yang tertinggal pada objek dan cover glass akan mengganggu pengamatan
bakteri di bawah mikroskop.
b. Kawat ose juga disterilkan terlebih dahulu dengan dipanaskan pada bunsen sampai
merah, untuk menghindari adanya kontaminan dari mikroorganisme lain.
c. Bakteri diambil dari media agar miring dengan kawat ose, Lalu dioleskan pada objek
glass.
 d. Pengolesan bakteri pada media jangan terlalu tebal dan jangan terlalu tipis. Olesan
yang terlalu tebal akan membuat bakteri – bakteri tertumpuk dan sulit diamati bentuk
morfologi dan warna dinding selnya. Sedangkan olesan yang terlalu tipis juga akan
mempersulit pengamatan dan bisa jadi tidak terdapat bakteri pada olesan tersebut.
4.3 Tujuan Fiksasi Panas
Fiksasi adalah suatu proses untuk melindungi sel dari kerusakan struktur dan
biokimianya. Proses fiksasi terbagi kedalam dua jenis secara umum, yaitu fiksasi kimia dan
fiksasi fisik. Fiksasi kimia adalah proses fiksasi yang menggunakan cairan fiksatif.
Sedangkan, fiksasi fisik ialah fiksasi yang menggunakan temperature, baik dengan
temperature yang sangat rendah atau temperature yang sangat tinggi. Pada pewarnaan
bakteri ini, digunakan fiksasi panas. Jenis fiksasi panas tidak dapat digunakan untuk
pewarnaan kapsul, karena akan menyusutkan dan menghancurkan kapsul dari bakteri
sehingga tidak dapat diamati.
Fiksasi panas dilakukan dengan cara melewatkan objek glass yang telah mengandung
mikroorganisme di atas panas Bunsen. Pemanasan ini dilakukan sampai objek glass kering
dan terbentuk noda di atasnya. Noda inilah yang nantinya akan dapat perlakuan dengan
beberapa larutan uji pada pewarnaan gram dan pewarnaan sederhana. Pada saat
melakukan pemanasan, jangan terlalu berlebihan karena dapat membuat dinding sel pada
bakteri rusak atau pecah.
Tujuan dari fiksasi panas ini antara lain :
a. Meningkatkan stabilitas dan kekuatan dari bakteri, peningkatan kekuatan ini dapat
menjaga bentuk dan struktur dari bakteri.
b. Membantu merekatkan bakteri pada objek dan cover glass sehingga ketika diberi
perlakuan dengan beberapa senyawa uji, bakterinya tidak hilang.
c. Membunuh bakteri yang dioleskan pada objek glass, sehingga bentuk dan struktur dari
bakteri tersebut tidak berubah.
d. Mencegah terjadinya otolisis pada sel, yaitu kondisi dimana sel pada bakteri akan
pecah akibat enzim – enzim yang dikandungnya.
4.4 Bahan-bahan Pereaksi Pewarnaan Gram dan Prinsip Kerjanya
Bahan bahan yang digunakan dalam pewarnaan gram pada umumnya adalah gentian
violet, iodin, etanol dan safranin. Gentian violet, iodin, dan safranin merupakan reagen
utama. Gentian violet digunakan sebagai pewarna pertama dan memberikan warna ungun.
Iodin digunakan untuk mempertegas/memperkuat dan mempertahankan warna pertama.
Etanol digunakan sebagai dekolorisasi atau pelunturan warna pertawa yang nantinya
dapat membedakan antara bakteri gram positif dengan bakteri gram negatif. Safranin
 digunakan sebagai pewarna kedua yang akan mewarnai bakteri yang warnanya luntur
ketika dilakukan penambahan etanol.
Pewarnaan gram memiliki prinsip kerja dengan cara mengikat warna pertama (gentian
violet) akan tetapi bakteri gram negatif melepas warna pertama dan mengikat warna
kedua (safranin) sehingga berwarna merah, sedangkan bakteri gram positif
mempertahankan warna pertama sehingga tetap berwarna ungu.
4.5 Penyebab Perbedaan Warna Pada Bakteri Gram Negatif dan Positif Setelah Pewarnaan
Gram
Perbedaan warna yang terjadi pada bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
disebabkan oleh perbedaan ketebalan lapisan peptidoglikan. Penggunaan etanol dalam
pewarnaan gram bertujuan untuk dekolorisasi dimana bakteri gram negatif tidak dapat
mempertahankan warna pertama (gentian violet) karena memiliki lapisan lemak yang lebih
tebal akan tetapi memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tipis dibandingkan dengan
bakteri gram positif. Dan bakteri gram positif berkebalikan dengan bakteri gram negatif
yaitu memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tebal dengan lapisan lemak yang cenderung
lebih sedikit.
 5. Kesimpulan
Terdapat beberapa kesimpulan pada praktikum kali ini diantaranya adalah:
1. Pewarnaan mikroorganisme (bakteri) bertujuan untuk memberikan warna agar
lebih mudah ketika diamati menggunakan mikroskop karena bakteri sejatinya tidak
memiliki warna.
2. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan pewarnaan sederhana dan
pewarnaan gram
3. Terdapat beberapa faktor yang memengaruhi pewarnaan bakteri anatar lain
adalah fiksasi (pelekatan), dekolorisasi, pemberian warna, substrat, pemberian zat
warna penutup.
4. Terdapat perbedaan warna antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Bakteri gram positif berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif berwarna
merah.
DAFTAR PUSTAKA
Musyarifah, Z., dan Salmiah, A. 2018. Proses Fiksasi pada Pemeriksaan Hispatologik. Jurnal
Kesehatan Andalas. 7(3): 443-453.
Murwani, S. 2015. Dasar – Dasar Mikrobiologi Veteriner. Malang: UB Press.
Leboffe, M. J. dan B.E, pierce. 2012. Microbiology laboratory and application 2th edition.
Colorado: Morton publishing.