MAKALAH TEKNIK ISOLASI BAKTERI

GRAM POSITIF DAN NEGATIF

NAMA : MUHAMMAD PARDI

NIM

: 15 3145 453 175

KELAS : 15 E

PRODI DIII ANALIS KESEHATAN

STIKes MEGA REZKY MAKASSAR
2016

BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan
mengamati bentuk sel bakteri

dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk

diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama
dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Pelezar, 2008).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan
gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram
tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
mycoplasma sp (Nurodin, 2009)
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan dengan menggunakan
larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi,
dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di
antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial.
Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat
membedakan bagian-bagian dari sel (Jimmo, 2008).
Isolasi

adalah

mengambil

mikroorganisme

yang

terdapat

di

alam

dan

menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari
mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah
dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu
macam mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis

mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba
(Sutedjo, 1996).
Tujuan
Tujuan dari praktikum yaitu :
1.

Mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel bakteri dan

sekelilingnya dan mengamati ciri-ciri tertentu dari bakteri.

2.

Memahami beberapa prosedur isolasi bakteri.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan
gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram
tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
Mycoplasma sp. (Hadioetomo, 1985).
Prinsip dasar dari pengecatan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan
adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa (Junaidi, 2009).
Satu sifat penting dari bakteri dalam hubungannya dengan mikrobiologi adalah
kemampuan beberapa jenis bakeri untuk memproduksi struktur internal yaitu endospora.
Endospora ini umumnya terbentuk secara tunggal dalam sel guna menanggulangi keadaan
lingkungan yang kurang baik. Spora yang sudah masak dilepas oleh alam ke lingkungan
sekitarnya. Spora-spora ini dapat dilihat di bawah mikroskop fase kontras dan nampak
sebagai bagian yang bercahaya terang baik di dalam atau di luar sel. Spora-spora ini tahan
terhadap keadaan fisik atau kimiawi yang ekstrim seperti suhu, kekeringan dan bahan-bahan
kimia pembasmi kuman dan pertumbuhan memungkinkan, spora-spora tersebut tumbuh
menjadi sel-sel vegetatif normal (Buckle, 2007).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang
sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna
terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri
seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu
spesies (Jimmo, 2008).

Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel dinamakan
pewarnaan khusus, sedangkan pewarna yang digunakan untuk memilihkan mikroorganisme
dinamakan pewarnaan diferensial, pewarnaan gram merupakan contoh pewarnaan diferensial
yang memilikan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.pewarnaan
diferensial yang lain adalah pewarnaan Ziehl-Neelsen yang memilikan bakteri menjadi
kelompok tahan asam dan kelompok tidak tahan asam (Suriawaria, 2005).
Untuk menelaah mikroorganisme di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan
mereka. Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan manusia.
Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia diantaranya melalui substrat yang disebut
media. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrient yang diisyaratkan
oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi
pertumbuhannya. Alat-alat yang digunakan dalam perkembangbiakan inipun harus
disterilisasikan terlebih dahulu. Hal tersebut dimaksudkan agar tidak ada mikroorganisme
lain, yang tidak diinginkan, tumbuh dalam media tersebut, sehingga dapat menghambat
pertumbuhan mikroorganisme yang akan dibiakkan dalam media tersebut (Widjoseputro,
1989).
Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni yaitu, cara
pengenceran, cara penuanagan, cara penggesekan, atau penggoresan, cara penyebaran, cara
pengucilan 1 sel, dan cara inokulasi pada hewan. Masing-masing mempunyai kelebihan dan
kekurangan (Waluyi,2007).
Untuk metode streak plate misalnya, mikroba diletakan didalam pada ujung palte
mengguanakan ose, lalu digoreskan pada permukaan medium agar tersebut dengan pola
tertentu yang khas. Ada pula metode Pour Plate atau penuanga. Metode ini dapat digunakan
untuk penghitungan bakteri secara langsung. Karena sebelum dituang bakteri tersebut
diencerkan terlebih dahulu. Sehingga syarat penghitungan langsung yaitu dalam 1 media
terdapat 30-300 koloni dapat terpenuhi (Stanier, 1982).

BAB III
BAHAN DAN METODE
BAHAN DAN ALAT
Bahan
Bahan yang di gunakan dalam praktikum ini adalah biakan bakteri berumur 24 jam,
larutan biru metilen, larutan karbol fuksin basa, tinta cina, larutan nigrosin, larutan kristal
violet (zat warna 1), larutan lugol (mordan), larutan aseton alkohol (larutan pemucat), larutan
safranin (zat warna 2), air, suspensi bahan yang mengandung bakteri, dan medium nutrien
agar.
Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah jarum ose, kaca obyek biasa, lampu
speritus, cawan petri steril, dan tabung reaksi berisi nutrien agar miring.
Tempat dan Waktu
Praktikum ini dilaksanakan di Loboratorium Fitopatologi Fakultas Pertanian
Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru pada hari Selasa, 6 November 2012 pukul
14.00-16.00 WITA.

PROSEDUR KERJA

PENGECATAN BAKTERI
A.

PENGECATAN SEDERHANA

1.

Buat preparat ulas, kemudian fiksasi diatas api.

2.

Beri larutan zat warna. Larutan zat warna yang digunakan adalah larutan biru metilen

atau larutan karbon fuksida basa.

3.

Biarkann zat warna selama 30 detik.

4.

Cuci dengan air dan keringkan dengan hati-hati dengan kertas saring.

5.

Periksa dengan mikroskop pembesaran kuat dan diberi minyak imersi. Bila preparat

ulas dan teknik pewarnaan dilakukan dengan benar, maka mikroorganisme berwarna biru
dengan larutan biru metilen, dan berwarna merah dengan larutan karbol fuksin basa.
B.

PENGECATAN NEGATIF

1.

Ambil 2 kaca obyek. Teteskan satu tetes tinta cina atau nigrosin pada bagian ujung

kanan salah satu kaca obyek.

2.

Sentuhkan ose pada biakan bakteri, kemudian campur dengan tinta cina atau nigrosin

di atas kaca obyek.

3.

Salah satu sisi kaca obyek yang lain diletakkan pada campuran tinta dan bakteri (atau

campuran nigrosin dan bakteri) sehingga tersebar pada seluruh sisi.

4.

Gesekkan kaca obyek sebelah kiri, sehingga campuran tinta dan bakteri (atau

campuran nigrosin dan bakteri) membentuk lapisan yang tipis sekali.

5.

Selanjutnya preparat dikering-anginkan. Preparat tidak boleh dipanaskan diatas api.

6.

Periksa dengan mikroskop perbesaran kuat dan diberi minyak imersi. Bila teknik

pewarnaan dilakukan dengan benar, maka mikroorganisme terlihat transparant dengan latar
belakang gelap.
C.

PENGECATAN GRAM

1.

Buat preparat ulas, kemudian fiksasi di atas api.

2.

Beri larutan kristal violet selama satu menit.

3.

Cuci denagn air.

4.

Beri larutan lugol selama 1 menit.

5.

Beri larutan pemucat selama 10-20 detik. Perhatikan waktu pemucatan, karena

pemucatan terlalu lama akan memberikan hasil pewarnaan yang menyimpang.

6.

Cuci dengan air.

7.

Beri larutamn safranin selama 15 detik.

8.

Cuci dengan air, kemudian keringkan dengan kertas saring.

9.

Periksa dengan mikroskop pemberasan kuat dan di beri minyak imersi.

Isolasi Bakteri
1.

Cairkan nutrien agar (dalam labu Erlenmayer) pada penangan air.

2.

Dinginkan sampai suhu 500 C.

3.

Tuangkan medium agar tersebut kedalam cawan petri steril secara aseptik, biarkan

sampai dingin dan padat.

4.

Pijarkan ose, kemudian dinginkan. Gunakan ose tersebut untuk mengambil ( satu mata

ose) suspensi bahan yang mengandung bakteri secara aseptik.

5.

Ose disentuhkan pada lempengan agar dalam cawan petri dan digoreskan (goresan T

atau kuadran). Sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan lempengan
agar dalam cawan Petri dan digoreskan (goresan T atau kuadran). Sewaktu menggores ose
dibiarkan meluncur diatas permukaan lempengan agar. Agar yang luka menggangu
pertumbuhan bakteri sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah.
6.

Pijarkan ose setelah menggores suatu daerah.

7.

Balikkan cawan petri dan beri etiket pada dasar cawan. Kemudian inkubasikan pada

suhu yang sesuai (370 C)

8.

Ambil 1 mata ose suspensi bakteri dan gorskan pada permukaan medium agar miring

dengan gerakan zig-zag.

9.

Berikan etiket pada tabung, kemudian inkubasikan pada suhu yang sesuai (370 C).

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL
Adapun hasil dari praktikum ini adalah :
Tabe 1. Pengecatan Bakteri (Pengecatan Sederhana)
NO
.

Keterangan
Gambar

1.

Pembuatan preparat ulas

dan memfiksasi di atas
api

2.

Memberikan xat warna

biru metilen

3.

Cuci

preparat

dan

bersihkan dengan kapas

4.

Melihat

hasil

menggunakan
mikroskop
5.

Hasil

pembesaan

menggunakan
mikroskop
Table 2. Isolasi Bakteri
NO.
1.

Gambar

Keterangan
Mencairkan

NA

dalam

penangan air
2.

Menuangkan NA pada pada

cawan petrei

3.

Mengambil suspense bakteri

menggunakan ose

4.

Menggoreskan
yang

jarum

mengandung

ose

bakteri

pada medim NA
5.

Diberi cling wolf pada cawan

B. PEMBAHASAN
Praktikum ini dibagi menjadi 2 bagian yaitu : pengecatan bakteri dan isolasi bakteri.
Pada pengecatan menggunakan bakteri biakan yang berumur 24 jam dan zat warna biru
metilen. Pewarnaan digunakan untuk melihat salah satu struktur sel dinamakan pewarnaan
khusus, sedangkan pewarna yang digunakan untuk memilihkan mikroorganisme dinamakan
pewarnaan diferensial, pewarnaan gram merupakan contoh pewarnaan diferensial yang
memilikan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.pewarnaan diferensial
yang lain adalah pewarnaan Ziehl-Neelsen yang memilikan bakteri menjadi kelompok tahan
asam dan kelompok tidak tahan asam. pewarnaan atau pengecata ini menggunakan cara
pewarnaan atau pengecata sederahan. Pertama-tama memasukkan ose kedalam tabung yang
berisi biakan bakteri kemudian mengoleskan pada preparat dan difiksasi setelah itu diberikan
zat pewarna biru metilen. Biarkan selama beberapa detik kemudian bilas
dengan air dan keringkan menggunakan tisu. Pengeringan dilakukan agar kandungan air pada
preparat tidak terlalu banyak. Setelah itu periksa dengan mikroskop dengan pembesaran kuat
dan diberi minyak imersi. Minyak imersi digunakan untuk memperjelas gambar.
Praktikum yang kedua yakni isolasi bakteri. Isolasi adalah mengambil
mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan.
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya
yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba Pada praktikum ini digunakan
suspensi bahan yang mengandung bakteri dan nutrient agar. Mula-mula mencairkan NA yang
padat dalam penangas air kemudian didiamkan sebentar hingga suhu 50 o C. Tuangkan
larutan NA tersebut dalam cawan petri kemudian disimpan pada air laminar flow agar dalam
cawan tidak terdapat embun dalam cawan. Panaskan ose kemudian goreskan pada suspense

bahan yang mengandung bakteri setelah itu sentuhkan kembali ose tersebut pada cawan NA
yang dibuat tadi dan menggoreskan sedikit pada NA agar yang luka mengganggu
pertumbuhan bakteri sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah. Kemudian fiksasi dengan
api sekeliling cawan dan bungkus dengan cling wolf dapa sisi cawan secara menyeluruh
kemudian dibeli label.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

1.

Kesimpulan
Pengecatan pada bakteri berfungsi untuk memaksimalkan seluruh dinding pada bakteri

tersebut.
2.

Pengecata dapat dilakukan dengan berbagai cara diantaranya pengecatan sederhana,

pengecatan negative dan pengecatan gram.

3.

Pengecatan menggunakan biru metilen akan menghsilkan warna biru sedangkan jika

menggunakan karbol fuksin basa akn menghasilkan warna merah.

4.

Isolasi bakteri harus dalam keadaan steril karena jika tidak bakteri atau jamur lain akan

tumbuh sehingga hasil yang di dapat bukan baktiri murni.

5.

Penggoresan pada permukaan NA berfungsi agar mengganggu pertumbuhan bakteri

sehingga koloni tidak terpisah.

Saran
Adapun saran dalam praktikum ini adalah agar dalam pelaksanaan praktikum selalu

memperhatikan waktu karena waktu prktikum kita terbatas dan kerjasama antar praktikan
harus ditingkatkan lagi sehingga praktikum dapat berjalan dengan lancar.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle. 2007. Mikrobiologi Terapan. Universitas. Gajah Mada. Yogyakarta.

Hadioetomo. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.
Jimmo. 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. diakses
pada tanggal 12 November 2012.
Junaidi, W. 2009. Pengecatan Gram Pada Bakteri. http://junaidi-wawan. blogspot.com.
Diakses tanggal 12 November 2012.
Nurodin, A.

2009.

http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparat-bakteri-

pewarnaan.html diakses pada 12 November 2012.

Pelezar, C. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
Suriawaria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Djambatan. Jakarta.
Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta.
Stanier, R. 1982. Dunia Mikroba 1. Bharata Karya Aksara. Jakarta.
Waluyi, L. 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.
Widjoseputro, D. 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang