LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN

PEMBUATAN MEDIA SEDERHANA, ISOLASI, DAN INOKULASI

EKSPLAN DAUN PEPAYA (Carica papaya)

Oleh
Ajeng Rizki Ramadhania 17030244036

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
2019
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Adanya kultur jaringan dilatarbelakangi oleh adanya kemampuan
totipotensi sel. Menurut Ariebowo (2007), sel tumbuhan memiliki sifat dasar
yang disebut totipotensi sel. Sifat totipotensi ini merupakan sifat sel yang
mampu menjadi individu baru yang utuh jika berada pada lingkungan yang
sesuai. Sel tumbuhan memiliki sifat totipotensi yang lebih besar dibandingkan
sel hewan. Hal ini dikarenakan pada tumbuhan masih terdapat sel atau
jaringan yang belum terdiferensiasi, yaitu jaringan yang bersifat meristematik
atau jaringan meristem serta jaringan dasar (jaringan parenkim) yang masih
bersifat meristematik.
Berdasarkan teori totipotensi sel maka lahirlah suatu teknik reproduksi
vegetatif baru yang disebut kultur jaringan. Perkembangan kultur jaringan
tumbuhan lebih maju dibandingkan pada hewan. Kultur jaringan di dunia
maupun Indonesia saat ini lebih berorientasi untuk produksi tanaman pangan
dan industri.
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara
vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan
cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta
menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik
yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus
cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi
menjadi tanaman lengkap.
Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman
dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan
yang dilakukan di tempat steril.
Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak
tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara
generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa
keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya,
dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu
membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah
besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin,
kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan
konvensional.
Pada dasarnya langkah-langkah dalam melakukan proses kultur jaringan
ada 3 tahap, yaitu :
1. Tahap I atau disebut juga tahap persiapan eksplan
2. Tahap II atau disebut juga tahap penggandaan.
 3. Tahap III atau disebut juga tahap pendewasaan.( D.F.
Wetherell,1976).
Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir
yaitu penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih
digunakan pada pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada pross
penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam
kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya dilakukan di
Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat lubang untuk
tangan, atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow).
Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus steril, dan
eksplan juga dalam keadaan yang steril pula. Penanaman dapat dilakukan
pada ruangan tertutup atau ruangan penabur dalam Laminair Air Flow
(LAF). Ruangan digunakan, setelah dilakukan sterilisasi dengan
menggunakan larutan alkohol 96 % pada lantai dan dinding ruangan, dan
membiarkan ruangan selama 30 menit dengan sinar UV yang menyala.
Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang
cukup mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat
dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara
praktikum diatas dilakukan sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media
kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga harus dalam keadaan
steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun terkena
serangan mikroba.
Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya
sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu
sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk
menciptakan lingkungan yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun
spora penyebab kontaminan.

B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara membuat media sederhana untuk pertumbuhan
eksplan?
2. Bagaimana cara menanam eksplan pada media?
3. Apa saja jenis kontaminasi pada eksplan?

C. Tujuan
1. Untuk mengetahui cara membuat media sederhana untuk
pertumbuhan eksplan.
2. Untuk mengetahui cara menanam eksplan pada media.
3. Untuk mengetahui jenis kontaminasi pada eksplan.
 BAB II
KAJIAN PUSTAKA

A. Kultur jaringan dan macam teknik kultur

Menurut Ariebowo (2007) ,Berbagai bagian tanaman dapat digunakan sebagai
eksplan dalam kultur jaringan.

1. Kultur Meristem, menggunakan jaringan (akar, batang, daun) yang masih

muda.
2. Kultur Enter, menggunakan kepala sari sebagai eksplan.
3. Kultur Embrio, menggunakan embrio. Misalnya pada embrio kelapa
kopyor yang sulit dikembang biakkan secara alamiah.
4. Kultur Protoplas, menggunakan sel jaringan hidup sebagai eksplan tanpa
dinding.
5. Kultur Kloroplas, menggnakan kloroplas. Kultur ini biasanya untuk
memperrbaiki atau membuat varietas baru.
6. Kultur Polen, menggunakan serbuk sari sebagai eksplannya.

B. Syarat eksplan dalam kultur jaringan

Menurut Ariebowo (2007) eksplan adalah bagian dari tanaman yang
digunakan dalam kulturasi. Eksplan ini menjadi bahan dasar bagi pembentukan
kalus (bentuk awal calon tunas yang kemudian mengalami proses pelengkapan
bagian tanaman, seperti daun, batang, dan akar). Sebagian eksplan sebaiknya:
a. Dipilih pucuk muda tanaman dewasa (karena lebih mudah beregenerasi
dan aktif membelah) yang diketahui asal-usul dan varietasnya
b. Eksplan tidak terinfeksi oleh penyakit, maka harus disterilkan terlebih
dahulu
c. Eksplan dipilih dari jenis yang unggul

C. Macam-macam sterilisasi alat, bahan, dan eksplan

Menurut Kusdianti (2006) teknik aseptik dalam pembuatan media meliputi:
1. Sterilisasi Peralatan
Sterilisasi ini dilakukan agar alat tersebut bebas dari mikroba baik dalam
bentuk vegetatif maupun spora, sterilisasi peralatan dibagi menjadi 2 :
a. Sterilisasi Basah, dengan cara pengaturan tekann dalam autoklaf. Cara ini
dipakai untuk sterilisasi media yang tahan terhadap pemanasan tinggi.
Biasanya dijalankan dengan menggunakan panas 120oC selama 10 – 20
menit tergantung kebutuhan .
b. Sterilisasi Kering, cara ini menggunakan udara yang dipanaskan dan
kering serta berlangsung dalam sterilisator udara panas (Oven).
Pemanasan dengan udara panas digunakan untuk sterilisasi alat-alat
laboratorium dari gelas. Misalnya : Petri, tabung, gelas, botol pipet , dll.
2. Sterilisasi Ruang
Mikroganisme dapat hidup dimana-mana bukan hanya diruang terbuka
maupun tertutup. Kehidupan mikroganisme diruang tertutup lebih mudah di
kendalikan dibanding ruang terbuka. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan
menyemprotkan alkaholol 90 % dengan hand-sprayer.

3. Sterilisasi Bahan Tanam

Dalam sterilisasi bahan tanam. Hal yang penting yang harus mendapat
perlakuan adalah bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama
benda hidup. Kontaminasi harus dilakukan tanpa mematikan sel tanaman.
bahan sterilisasi umumnya bersifat toxic terhadap jaringan tanaman.
pembiasan berkali-kali sesudah perendaman dalam pelarutan bahan sterilisasi
sangat diperlukan untuk menghilangkan sisa – sisa bahan aktif yang masih
menempel di permukaan

D. Jenis kontaminasi pada eksplan

Menurut Hendaryono (1994), arti kontaminasi pada kultur jaringan adalah
kejadian terikutnya atau masuknya unsur-unsur yang tidak dikehendaki ke dalam
objek yang tengah diperhatikan. Contoh masuknya jamur ke dalam kultur jaringan
bunga anggrek. Proses kontaminasi lazim terjadi pada kultur jaringan.
Kontaminan bisa berasal dari lingkungan kerja, eksplan, atau alat inokulasi yang
responnya bisa berlangsung cepat atau beberapa waktu sesudah inokulasi eksplan.
Dilihat dari sisi kecepatan, maka kontaminasi dibagi dalam dua bagian,
yaitu initial contaminant serta latent contaminant. Initial contaminant yaitu
kontaminasi yang berproses beberapa waktu sesudah inokulasi akibat
kontaminannya ada dalam jaringan eksplan. Penyebabnya materi kultur (eksplan)
dari greenhouse atau lapangan yang terlalu kotor serta sterilisasi yang kurang
optimal. Penanggulangannya tidak akan hanya cukup dengan sterilisasi di
permukaan eksplan. Semen-tara latent contaminant muncul 30 hari setelah
inokulasi, bersifat internal, yakni di luar jaringan tumbuhan.
Bakteri dan fungi merupakan kontaminan yang kerap menyerang eksplan.
Respon eksplan pada bakteri 2x24 jam, sementara respon eksplan pada fungi 1x24
jam. Bakteri setelah mengkontaminasi eksplan memben-tuk suatu gumpalan
lumpur di permukaan media, warna-nya kuning atau orange. Sementara fungi
warnanya putih berbentuk bulu-bulu halus. Biasanya menyerang pada permukaan
ujung bagian atas eksplan (Hendaryono,1994)
 BAB III
METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Praktikum pembuatan media sederhana dan inokulasi ini
dilaksanakan di laboratorium kultur jaringan jurusan Biologi Fakultas Ilmu
Pengetahuan dan Alam Universitas Negeri Surabaya. Pembuatan media
sederhana dilakukan pada tanggal 7 Februari 2019, sedangkan isolasi dan
inokulasi eksplan dilakukan pada tanggal 15 Februari 2019.

B. Alat dan Bahan

1. Pembuatan Media Sederhana
Alat:
 Kompor gas
 Panci stainless dan pengaduk
 pH meter
 beaker glass 1000 ml
 Gelas ukur
 Timbangan digital
 Botol media/kultur (ex botol selai, botol balsem) 80 botol
 Autoklaf
Bahan:
 Alumunium foil
 LPG
 Agar-agar batang 12-14 gram
 Air kelapa 150 ml
 Gula 20-30 gram
 Aquades
 Pupuk cair sesuai dosis
 Kertas label
 HCl 1 M
 KOH 1 M

2. Isolasi dan Inokulasi Eksplan

Alat:
 Laminar Air Flow (LAF), enkas
 Lampu spiritus
 Cawan petri 2
 Gunting
 Pinset
 Gagang scalpel
 Mata pisau scalpel steril no 11 dan 13
  Korek api
 Botol saos
 Botol selai untuk sterilisasi 8 buah
 Sprayer

Bahan:
 Spiritus
 Alcohol 90% dan 70%
 Dettol
 Formalin tablet
 Kertas tisu
 Kertas saring
 Kertas label
 Benang kasur
 Alumunium foil
 Kapas
 Aquades
 Kertas bekas
 Eksplan terpilih (daun papaya)

C. Langkah Kerja
a) Pembuatan Media Sederhana
 Memasukkan aquades ke dalam beaker glass 1000 ml sebanyak
500 ml kemudian menambahkan gula sukrosa 20-30 gram
sambil diaduk sampai semua larut.
 Menambahkan air kelapa 150 ml dan menambahkan pupuk cair
sesuai dosis
 Menambahkan aquades hingga volumenya mencapai 1000 ml
 Mengukur pH berkisar 6,5 dengan pH meter. Jika terlalu basa,
ditambahkan HCl 1 M. jika terlalu asam, ditambahkan KOH 1
M
 Menambahkan aquades dalam larutan hingga volumenya
mencapai 1000 ml.
 Menuangkan larutan ke dalam panic. Kemudian menambahkan
agar batangan (12 g/l)
 Media kemudian dipanaskan dengan kompor gas sambil diaduk
hingga agar-agar larut dan homogeny
 Setelah agar-agar larut, media dituang ke dalam beaker glass
1000 ml dan dimasukkan ke dalam botol kultur yang telah
disterilisasi, dengan volume tiap botol 15 ml dan diberi label
nama untuk membedakan masing-masing perlakuan
  Botol yang telah berisi media ditutup dengan alumunium foil
lalu disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm2 dan
temperature 121◦C selama ± 15 menit
 Botol dikeluarkan dari autoklaf dan diinkubasi selama 3 hari,
jika tidak terjadi kontaminasi, media siap digunakan.

b) Isolasi dan Inokulasi Eksplan

 Menyiapkan alat (pinset, mata pisau scalpel, gagang pisau
scalpel, cawan petri yang berisi kertas saring), bahan (alcohol
90% dan 70%, tween, aquades) dan botol kultur yang telah
berisi media yang semuanya telah disterilkan. Sterilisasi dan
inokulasi eksplan dilakukan di Laminar Air Flow Cabinet.
 Mencuci tangan menggunakan sabun cair kemudian dikeringkan
dengan lap bersih
 Mencuci eksplan daun papaya dengan sabun cair kemudian
dibilas dengan air mengalir hingga sabun hilang
 Eksplan dibawa ke dalam Laminar Air Flow Cabinet.
 Eksplan direndam dengan aquades steril selama 5 menit sambil
digoyang-goyang
 Merendam eksplan dengan alcohol 70% untuk mensterilkan
eksplan selama 5 detik, sambil digoyang-goyang
 Eksplan dicuci dengan aquades selama 5 menit
 Eksplan direndam dalam larutan NaOCL 0,5% + 1 tetes
antiseptic (chloroxyenol) selama 3-4 menit
 Membilas eksplan dengan aquades steril selama 5 menit.
Langkah ini diulang sebanyak 3 kali
 Menempatkan eksplan daun pepaya pada cawan petri yang
sudah diberi alas kertas saring steril.
 Memotong bagian tepi eksplan (jaringan yang rusak atau kontak
dengan bahan kimia). Kemudian memotong eksplan dengan
ukuran kurang lebij 0,5 cm menggunakan pinset dan pisau
skalpel
 Mengusap alumunium foil yang menjadi tutup botol kultur
dengan alcohol 90%
 Membuka tutup botol kultur, kemudian bibir botol dan
alumunium foil dilewatkan nyala api lampu spirtus.
 Mengambil potongan eksplan dengan pinset dan
memasukkannya dalam botol kultur yang telah berisi media
 Bibir botol kultur dan alumunium foil dilewatkan nyala api
lampu siritus, kemudian ditutup kembali
 Botol yang telah ditanami diletakkan dalam ruang inkubasi dan
dilakukan pengamatan
 BAB IV
PEMBAHASAN
A. Hasil
Tabel 1. Hasil Pengamatan Eksplan Daun Pepaya
Tanggal Pengamatan
Jenis Tanggal
No. ZPT (Februari 2019)
Eksplan Inokulasi
16 17 18 19 20 21
Daun 15-02-
1 Air Kelapa - - - X X X
Pepaya 2019
Daun 15-02-
2 Air Kelapa - - - - - -
Pepaya 2019
Daun 15-02-
3 Air Kelapa - - - - - -
Pepaya 2019
Daun 15-02-
4 Air Kelapa - - - - - -
Pepaya 2019

Keterangan:
(-) : Belum tumbuh (K) : Tumbuh kalus (A): Tumbuh akar
(X) : Kontaminasi (T) : Tumbuh tunas

Berdasarkan data pada tabel 1, pengamatan dilakukan selama 6

hari. Pada botol 1 terjadi kontaminasi pada tanggal pengamatan 19, 20,
dan 21 Februari 2019. Sedangkan pada botol 2, 3 dan 4 setelah dilakukan
pengamatan selama 6 hari tidak terdapat tanda-tanda akan tumbuh.

B. Pembahasan
Media sederhana yang digunakan pada praktikum ini ditambahkan
ZPT berupa air kelapa. Digunakannya air kelapa sebagai ZPT karena air
kelapa mengandung hormon alami kelompok auksin dan sitokinin, dalam
kultur jaringan, auksin berperan memacu pembentukan kalus, menghambat
kerja siokinin, membentuk klorofil kalus, mendorong proses morfogenesis
kalus, membentuk akar, dan mendorong proses embryogenesis. Sitokinin
berperan memacu pembelahan sel, proliferasi meristem ujung,
menghambat pembentukan akar dan mendorong pembentukan akar dan
mendorong pembentukan klorofil pada kalus (Surachman, 2011). Di dalam
air kelapa juga mengandung unsur makro seperti N, P, dan K serta
beberapa jenis unsur hara mikro dalam air kelapa yang dapat menjadi
substitusi unsur hara makro dan mikro serta sukrosa sebagai sumber
karbon. Menurut Vigliar dkk. (2006), konsentrasi garam mineral dan
sukrosa air kelapa menurun seiring dengan lamanya keberadaan air kelapa
itu sendiri.
 Hasil inokulasi eksplan daun pepaya pada botol 2, 3, dan 4 setelah
dilakukan pengamatan selama 6 hari tidak menghasilkan kalus. Menurut
Gunawan (1987) konsentrasi zat pengatur tumbuh yang bebeda
memberikan respon yang yang berbeda terhadap induksi kalus. Kalus yang
tidak muncul ini kemungkinan karena eksplan mempunyai auksin dan
sitokinin yang terkandung pada tanaman tersebut (endogen) rendah,
sehingga masih membutuhkan tambahan auksin atau sitokinin eksogen
yang lebih banyak. Cepat lambatnya muncul sebah kalus dipengaruhi oleh
kerja hormone auksin dan sitokinin endogen dan eksogen yang saling
berkolerasi. Menurut Indah dan Ermavitalini (2013) bahwa penambahan
auksin dan sitokinin eksogen akan mengubah konsentrasi zat pengatur
tumbuh endogen sel. Pemberian konsentrasi ZPT yang tidak sesuai dapat
menghambat pertumbuhan kalus pada eksplan. Terhambatnya
pembentukan kalus dikarenakan hormone endogen dan eksogen yang
terdapat pada eksplan tidak dapat merangsang pertumbuhan kalus dengan
cepat (Indah dan Ermavitalini, 2013). Basri (2008) menjelaskan bahwa
respons (pertumbuhan maupun tingkat multiplikasi) suatu eksplan dalam
kultur jaringan sangat ditentukan oleh status fitohormon yang terdapat
pada eksplan tersebut. sedangkan menurut Sriyanti (2002) komposisi
media serta interaksi antara varietas tanaman dan komposisi media yang
dicobakan berpengaruh sangat nyata terhadap pembentukan tunas.
Menurut Coleman (2003), salah satu indikator keberhasilan dalam
pembuatan media kultur jaringan tanaman yang baik adalah tingkat
kontaminasi media yang kita buat. Semakin sedikit media yang
terkontaminasi maka semakin baik tingkat keberhasilan kita. Autoklaf
merupakan salah satu alat yang penting dalam pembuatan media kultur
jaringan. Autoklaf dapat dipakai untuk membunuh mikroorganisme seperti
bakteri dan cendawan, sehingga media yang kita buat dapat steril dari
mikroorganisme - mikroorganisme tersebut. Sedangkan dalam Agromedia
(2005), kegagalan kultur jaringan dapat dilihat dari warna media
tanamnya. Jika warnanya menjadi keruh seperti susu, kultur
terkontaminasi oleh bakteri. Jenis kontaminasi tersebut yang terdapat pada
botol 1 karena terdapat becak warna putih pada media. Apabila di
permukaan media terlihat lapisan putih atau kelabu kehitaman media
terkontaminasi oleh jamur.
 BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Media sederhana yang digunakan pada praktikum ini diberi
tambahan ZPT berupa air kelapa karena terdapat hormone auksin dan
sitokinin. Sedangkan tidak tumbuhnya kalus pada eksplan kultur karena
tidak korelasinya antara hormone eksogen dan endogen, sehingga
menghambat pertumbuhan kalus.

B. Saran
Sebaiknya selalu memperhatikan kesterilan suatu bahan dan
ruangan yang digunakan untuk kultur jaringan, selain itu biasakan diri
untuk bekerja secara aseptis sehingga mencegah terjadinya kontaminasi.
Pastikan semua bahan yang digunakan untuk membuat media telah
ditimbang sesuai dengan instruksi agar media yang akan digunakan untuk
menanam eksplan dapat bekerja dengan maksimal dan menhasilkan kalus.
 DAFTAR PUSTAKA

Agromedia. 2005. Anggrek: Anda bertanya, Pakar dan Praktisi menjawab. Jakarta:
Redaksi Agromedia
Ariebowo, Moekti dan Fictor Ferdinand P. 2007. Praktis Belajar Biologi untuk Kelas XI.
Jakarta. Penerbit: Grafindo.
Basri, Zainuddin. 2008. Jurnal: Multiplikasi Empat Varietas Krisan Melalui Teknik
Kultur Jaringan. Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian, Universitas
Tadulako.
Coleman, J. O. D., Evans, D.E., and Kearns, A. 2003. Plant Cell Culture. New York:
BIOS Scientific Publishers.
Hendaryono dkk. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius.
Na’im, Risqie. N.2005.Pengaruh NAA dan Kinetin pada Eksplan Tunas
Biji(Eusideroxylon zwageri, T.et.B) dengan Sistem Kultur Jaringan.Fakultas
Kehutanan.Untan
Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan
Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif- Modern. Kanisius,
Yogyakarta.
Surachman, D. 2011. Teknik Pemanfaatan Air Kelapa untuk Perbanyakan Nilam
secara In Vitro. Buletin Teknik Pertanian. (16) :31 – 33.
Vigliar R, V.L. Sdepanian & U.F Neto. 2006. Biochemical Profile of Coconut
Water from Coconut palms planted in Inland Region. Journal de pediatria,
82: 308 – 312.
 LAMPIRAN

No. Gambar Keterangan

Botol 1 yang
terkontaminasi oleh
1
bakteri pada pengamatan
hari ke 4, 5, dan 6

Botol 2, 3, dan 4 yang

belum tumbuh kalus
2
hingga pengamatan hari
ke-6