PEWARNAAN BAKTERI

(Laporan Praktikum Mikrobiologi Pertanian)

Oleh Bastian 1214121036

JURUSAN AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG 2013

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikrooganisme atau bakteri pada umumnya transparan dan berukuran sangat kecil sehingga sulit untuk mengamatinya. Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengatasi masalah it. Salah satunya adalah melalui pewarnaan bakteri. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.

Pewarnaan bakteri sendiri terbagi menjadi 2 jenis yaitu pewarnaan asam dan pewarnaan basah. Pewarnaan asam adalah pewarnaan bakteri menggunakan senyawa pewarnaan yang bersifat negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lainlain. Pewarnaan basa adalah pewarnaan yang menggunakan senyawa pewarna positif, dinding sel bakteri yang cendrung negatif akan mengikat senyawa yang bermuatan positif sehingga dinding sel bakteri akan terwarnai atau terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lainlain.

Teknik pewarnaan asam basah ini terbagi menjadi 2 macam yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram atau diferensial. Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna. Biasanya

pewarnaan sederhana digunakan intuk mengamati morfologi dan susunan serta struktur bakteri. pewrnaan gram atau pewarnaan diferenial adalah pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu jenis senyawa pewarna. Dua teknik ini memiliki kelebihan dankekurangannya masing-masing.

1.2 Tujuan Percobaan

Adapun tujuan percobaan yang dilakukan kali ini adalah untuk : Untuk mempermudah dalam mengidentifikasi bakteri

II. PROSEDUR PERCOBAAN

2.1 Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah tabung reaksi, korek api, jarum ose, kaca preparat, Bunsen burner, pipet tetes, mikroskop compound, dan rak tabung reaksi. Sedangkan bahan yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah senyawa pewarna (safranin, iodium, kristal violet), alkohol 96%, biakan mikroba, dan aquades.

2.2 Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja pada percobaan ini adalah: Prosedur pewarnaan sederhana 1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Membersihkan kaca praraparat dengan aquades dan keringkan. 3. Mengambil mikroba yang sudah diencerkan 10-2 (Psedeomonas Florence) pada tabung reaksi dengan menggunakan jarum ose. 4. Kemudian mikroba diletakkan pada kaca preparat. 5. Kaca praraparat kemudian di fiksasi beberapa kali pada bunsen sampai kering. 6. Kemudian ditetesi dengan safranin sebanyak 1 tetes dengan menggunakan pipet tetes. 7. Memfiksasi kembali praparat yang sudah ditetesi safarin 8. Kemudian Dibilas dengan menggunakan aquades. 9. Pinggir preparat di keringkan dengan cara di angin-anginkan. 10. Kemudian amati dengam mikroskop. Catat hasil pengamatan tersebut.

 Prosedur pewarnaan gram 1. Melakukan langkah yang sama seperti pewarnaan sederhana ( langkah 1-5) 2. Kemudian kaca praparat ditetesi dengan Kristal violet sebanyak 1 tetes dengan menggunakan pipet tetes. 3. Kemudian didiamkan 2 menit sampai kering. 4. Mencuci kaca praparat tersebut dengan air mengalir 5. Kemudian ditetesi dengan iodium, kemudian di diamkan 2 menit. 6. Membilas dengan alcohol dan ditetesi dengan safarin. 7. Kemudian dikeringkan beberapa menit, lalu dibilas dengan air mengalir. 8. Kemudian amati hasilnya (apabila berwarna biru (+) jika berwarna merah (-)/ mikroba tersebut bersifat patogen.

III. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan

Adapun hasil pengamatan dari percobaan ini adalah: No Gambar Keterangan:

1 Gambar disamping menunjukan hasil akhir dari pewarnaan gram. Yang menghasilkan gram negatif (-) yang berarti sekl bakteri 2 bersifat patogen.

3.2 Pembahasan

pada praktikum kali ini, kita sudah melakukakan percobaan pewarnaan bakteri dengan menggunakan teknik pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram. Kedua metode ini memeliki perbedaan dan persamaan. Perbedaan dan persamaan tersebut akann iuraikaan pada pembahasan kali ini.

Persamaan antara pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram terletak pada tujuanya. Tujuan dari kedua pewarnaan tersebut adalah untuk mewarnai bakteri. Tujuan lain dari pewarnaan adalah untuk : - Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi. - Memperjelas ukuran dan bentuk jasad - Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. - Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut (safarin, iodium, atau kristal violet saja). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka air dan basa). Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri.

Pewarnaan Gram / pewarnaan diferensial adalah teknik pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu senyawa pewarna. Tujuan pewarnaan gram adalah untuk didapatkan dua kelas utama dari bakteri yaitu gram positif dan negatif. Hal ini disebabkan oleh stuktur masing-masing dinding sel bakteri yang berbeda-beda,

pada gram positif memiliki peptidoglikan yang tebal dan lapisan lemak yang tipis daripada gram negatif. Kristal violet yang diberikan akan tetap mewarnai bakteri gram positif meskipun telah ditambahkan iodin dan dilunturkan dengan alkohol 95%, sedangkan bakteri gram negatif warna ungu dari kristal violet akan luntur apabila diberi alkohol dan berwarna merah setelah diberi safranin dan warna ungu pada bakteri gram positif saat diberi safranin. Perbedaan antara kedua jenis bakteri ini dapat dilihat pada tabel berikut: CIRI Struktur dinding sel Komposisi dinding sel Gram positif Tebal, berlapis tunggal Gram negative Tipis, berlapis tiga

Kandungan lipid rendah, Kandungan lipid tinggi, peptidoglikan ada peptidoglikan ada di

sebagai lapisan tunggal, dalam lapisan kaku asam tekoat sebelah dalam, tidak ada asam tekoat Kerentanan terhadap penisilin Resistensi terhadap gangguan fisik Lebih resisten Kurang resisten Lebih rentan Kurang rentan

Berikut ini merupakan tahap-tahap pewarnaan sel bakteri dengan ewarnaan gram atau difrensial adalah sebagai berikut: 1. Pewarnaan dengan larutan kristal violet (primary stain) Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan

komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.

2. Fiksasi Fiksasi adalah proses pengeringan bakteri pada kaca praparat dengan menggunakan bunsen burner. Tekniknya adalah dengan melewatkan kaca praparat dekat dengan api pada bunsen burner beberapa kali. Fiksasi bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

3. Penambahan larutan Iodin (mordant) Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

4. Pembilasan dengan larutan alkohol (decololizer) Alkohol 96% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96%

juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

5. Pewarnaan dengan larutan safranin (counterstain) Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

IV. KESIMPULAN

Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat ditarik beberapa kesimpulan yang perlu kita pahami sebagai berikut :

1. Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. 2. Pewarnaan gram didasarkan pada penggunaan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. 3. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. 4. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu/ biru. 5. Apabila bakteri berwarna merah (bersifat -) berarti bakteri tersebut bersifat patogen

DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S. 1992. Mikirobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Hadioetomo, R. 1990. Mikrobiologi Dasar-Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Stainer, R.Y. 1986. The Microbial World. Prentice Hall. Englewood Cliffs. New Jersey.

Suriawiria, U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Penerbit Angkasa. Bandung.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.

LAMPIRAN