PERCOBAAN

TEKNIK ASEPTIS DAN PENGECATAN GRAM

I. TUJUAN

Setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan :

1. Mampu memahami pentingnya teknik aseptis dalam bekerja di
laboratorium mikrobiologi farmasi.
2. Mahasiswa mampu memahami teknik pengecatan Gram
Mahasiswa mampu melakukan pengamatan bakteri secara mikroskopis
dengan melihat warna, bentuk, dan susunan bakteri

II. DASAR TEORI

Sterilisasi merupakan Metode praktis yang dirancang untuk membersihkan

dari mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya, yang nyata
dari kepentingan dasar di banyak keadaan. Jenis dari mikroorganisme sangat berbeda
dalam kelemahannya terdapat berbagai macam agen antimikroba, dan lebih banyak
lagi, afek yang praktis dari agen ini pada adanya keadaan nyatayang sangat besar
dipengaruhi oleh keadaan sekitar. Banyak yang akan bertahan, contohnya, pada
cuaca tertentu organisme memiliki kulit, pada beberapa tubuh zat cair atau pada
udara, Air, makanan, kotoran, atau ruangan berdebu. Caranya harus dirubah, oleh
karena itu, dengan masalah nyata. Hal ini tidak mungkin, bagaimanapun pada garis
besarnya tentunya prinsip dasar digaris bawahi pada umumnya digunakan cara untuk
memusnahkan dan mengontrol kehidupan mikroba (1). Dan untuk aseptis adalah bebas
atau menggunakan metode untuk tetap bebas dari mikroorganisme patologis (3).
Cara kerja sterilisasi adalah cara kerja agar terhindar dari kontaminasi, cara
kerja steril ini digunakan pada pembuatan media, pemeriksaan kultur dan pembuatan
preparat. Sterilisasi dapat dilakukan secara; (1) Fisik di bagi menjadi beberapa bagian
antara lain (a) dengan ”Hot air Sterilization” oven. Bahan dari gelas dibungkus
dengan alumunium foil, suhu 170-250°C selama 2 jam. (b) panas basah dengan
tekanan, suhu 121°C selama 15 menit. Alat yang digunakan adalah autoclave,
caranya: alat-alat gelas dibungkus lagi dengan alumunium foil. (c) Pressure Cooker,
caranya: panaskan air mendidih, biarkan klep uap terbuka agar keluar uap kemudian
klep uap ditutup, lihat suhu dan tekanan, bila suhu telah 121°C dengan tekanan 1,5
atm, dijaga konstan selama 15 menit. Kemudian buka klep uap hingga tercapai
tekanan nol, dan setelah suhu mencapai suhu kamar, alat dan bahan dikeluarkan. (2)
Kimia yaitu dengan menggunakan zat-zat kimia seperti desinfektan, antiseptik. (3)
Radiasi yaitu dengan menggunakan sinar Ultraviolet, biasanya digunakan pada
ruangan dan alat-alat plastik. (4) Filter yaitu dengan menggunakan membran filter
dan Vacum Pump (2).
Zat warna pada umumnya digunakan senyawa-senyawa garam yang salah
satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion muatan negative dan ion muatan positif,
senyawa kimia ini digunakan untuk membedakan mikroba karena hasilnya
menunjukan warna yang berbeda untuk masing-masing mikroba (2).
Tujuan dari pewarnaan adalah memudahkan melihat mikroba dengan
mikroskop; memperjelas ukuran dan bentuk mikroba; melihat stuktur luar dan dalam
bakteri; menghasilkan sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna.
Factor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan, antara lain :
1. Fiksasi
Fiksasi bertujuan untuk melekatkan mikroba pada gelas objek, membunuh
microbe secara tepat tanpa merubah bentuk dan strukturnya, mengubah
afinitas pada zat warna.
2. Peluntur zat warna (decolorizer), berfungsi untuk menghasilkan kontras
yang baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang mudah
diwarnai akan mudah pula dilunturkan warnanya, sedangkan untuk sel-sel
yang sukar diwarnai akan sulit dilunturkan warnanya.
3. Intensifikasi zat warna
 Intensifikasi zat warna dilakukan dengan cara mempertinggi kadar zat
warna, mempertinggi suhu pewarnaan dan menambahkan suatu mordan.
Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel mikroba
dapat diwarnai intensif sehingga zat warna terikat lebih kuat pada jaringan
sel dibandigkan bila tidak diberi mordan.
4. Substrat
Substrat organic seperti lipid, asam nukleat, dan karbohidrat dapat
mempengaruhi pewarnaan.
5. Zat warna penutup (Counterstain)
Zat warna penutup biasanya digunakan terakhir bertujuan untuk
memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap warna utama. Hal
ini dilakukan pada pross pewarnaan gram. Zat sebagai penutup, antara
lai : metilen blue; safranin, erythosin, tergantung pada metode pengecatan
(2)
.

Proses pewarnaan pada mikroorganisme bermacam-macam sesuai dari tujuan

pengamatan, antara lain :
1. Pengecatan Gram
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding
sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.
Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang
tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm)
(5)
.

SIFAT GRAM POSITIF GRAM NEGATIF

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Lipid tinggi

 Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan warna basa Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana

Ketahanan terhadap Lebih tahan Kurang tahan

perlakuan fisik

Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae,

Salmonella spp, Shigella spp, E. Coli, Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram
positif adalah Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium, Bacillus(3).
Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif
sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks
iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun
setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif
luntur, sedangkan pada bakteri gram positif tidak. Pada gram negatif lemak
terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-
iodin keluar sel, sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi, pori berkerut
dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan
safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram positif melewatkannya(4).
2. Pewarnaan sederhana
Zat warna yang digunakan hanya satu warna, hal ini dimaksudkan untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Zat warna yang
digunakan lazimnya adalah kristal violet, metilen blue, karbol fuksasin basa, safranin
atau hijau malakit. Zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah
kongo. Prosedur pada pewarnaan ini mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini
digunakan untuk melihat bentuk, ukuran dan penatalaksanaan mikroorganisme (4).
3. Pewarnaan negatif
 Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi
mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Bakteri yang dilakukan pengamatan tidak
diwarnai, tetapi mewarnai latar belakang dan lingkungan bakteri
Cara metode pewarnaan negative:
Ambil kaca objek  beri 1 tetes tinta cina/ cat nigrosin  di ambil
mikroorganisme dan dicampur dengan cat di atas objek  biarkan preparat
mongering diudara (jangan dipanaskan)  diperiksa dengan mikroskop.
Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan
kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina (4).
4. Pewarnaan Tahan Asama atau Pewarnaan Ziehl-Neelsen
Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat
Alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses
sehingga menghasilkan warna merah. Kandungan lipida yang sangat tinggi pada
bakteri menyebabkan sel bakteri sulit diwarnai, karena zat warna tidak dapat
menembus lapisan ini. Jika bakteri tahan asam diwarnai dengan larutan karbol-
fuksin, maka zat warna tidak mudah dilunturkan oleh larutan pemucat (alkohol) (4).
Tahapan pewarnaan Ziehl Neelsen:
Tahan Asam Tidak Tahan Asam
Fuksin Karbol Merah Merah
Larutan Pemucat Merah Tidak
Metilen Blue Merah Biru

III. ALAT DAN BAHAN

III.1 Alat dan Bahan Teknik Aseptis

Alat :

a. Autoclave h. Ose bulat

b. Erlenmeyer i. Ose runcing
c. Gelas ukur j. Pengaduk
d. Kapas k. Petri disk
e. Kertas payung l. Tabung reaksi
f. Lampu spiritus m. Timbangan
g. LAF

Bahan:
a. Aquadestilata
b. Biakan bakteri
c. Serbuk nutrien broth
d. Serbuk nutrient agar

III.2 Alat dan Bahan Pengecatan Gram

Alat :
a. mikroskop
b. Kaca preparat

Bahan:

a. Bakteri yang akan diamati

IV. METODE KERJA

IV.1 Teknik Aseptis

1. Pembuatan Media

Dibuat media berisi nutrient broth dan nutrien agar.

Ditimbang serbuk Nutrien Broth sebanyak 0,065 gram dam

serbuk Nutrien agar sebanyak 0,7 gram.

Kemudian dilarutkan dengan aquades. Pada nutrien broth

dilarutkan dalam 5 ml dan nutrien agar dilarutkan dalam 25
ml.

Apabila dalam pencampuran media masih terdapat gumpalan

yang belum homogen, maka larutan dipanaskan dahulu
hingga homogen.

Larutan media yang telah homogen, dimasukkan larutan

media nutrien broth ke dalam tabung reaksi. Sedangkan 5 ml
larutan media nutrien agar dimasukkan ke dalam tabung
reaksi dan sisanya dituang didalam cawan petri.

Kemudian media diatas disterilisasi dengan autoclave pada

suhu 121ºC selama 15 menit.


 Setelah steril, tabung nutrient agar dimiringkan pada sudut ±
45 º sampai membeku

1. Teknik biakan murni

 Pemindahan biakan bakteri dari media cair ke media padat

Ose dipanaskan hingga membara

Ose dimasukkan dalam biakan dekat dinding tabung,

kemudian dicelupkan dalam biakan.

Tabung berisi kultur yang akan dipindahkan

dibuka, mulut tabung dipanaskan pada nyala api

Ose dikeluarkan kemudian mulut tabung

dipanasi dan ditutup kembali.

Ose digorekan pada media nutrient agar dekat nyala api

Tutup petridish dibuka sebagian dan diletakkan di dekat

nyala api

Mulut tabung dipanasi kembali kemudian ditutup

 Diinkubasi 37oC Selama 24 jam

 Pemindahan biakan bakteri dari media padat ke media padat

Ose dipanaskan sampai membara

Tutup tabung yang berisi biakan yang akan dipindahkan

dibuka dan mulut tabung dipanasi pada nyala api

Ose dimasukkan kedalam biakan kemudian

diambil satu koloni dan ditutup kembali

Tabung berisi nutrient agar miring dibuka,

kemudian mulut tabung dipanasi dengan
nyala api

Ose digoreskan pada media nutrient agar

miring

Diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam

  Pemindahan biakan bakteri dari media padat ke media cair

Ose dipanaskan sampai membara

Tabung yang berisi kultur yang akan dipindahkan

dibuka, mulut tabung dipanasi pada nyala api

Ose steril dimasukkan dalam biakan, diambil

satu koloni dan ditutup kembali

Tabung berisi kaldu nutrient dibuka, mulut

tabung dipanasi pada nyala api

Ose dimasukkan pada media kaldu nutrient

sambil diaduk

Mulut tabung dipanasi kembali kemudian

ditutup

Diinkubasi 370 C selama 24 jam

VI. PEMBAHASAN
 6.1 Pengecatan Gram

Dilakukan pengamatan bakteri secara mikroskopis dengan pengecatan

gram. Pengecatan bakteri yang dilakukan berfungsi untuk mengetahui jenis
bakteri. Jika hasil pengecatan berwarna ungu maka bakteri digolongkan gram
positif dan jika berwarna merah maka bakteri tergolong gram negatif. Hal ini
dikarenakan pada bakteri gram negatif mengambil warna pembanding setelah
decolorized dengan alkohol. Hal ini disebabkan karena dinding sel bakteri
gram negatif yang terdiri dari lipid mengalami lisis oleh alkohol. Sedangkan
gram positif tidak mengalami lisis karena dinding selnya terdiri dari
peptidoglikan.

Perbedaan warna antara bakteri gram positif dan bakteri gram

negative disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya.
Dinding sel gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan
dinding sel bakteri gram negative banyak mengandung lipopolisakarida.
Kompleks chrystal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakteri gram
positif tidak dapat tercuci oleh alcohol karena adanya lapisan peptidoglikan
yang kokoh pada dinding sel. Sedangkan pada dinding sel bakteri gam
negative, alcohol akan melarutkan lapisan lipopolisakarida. Kompleks
chrystal violet-iodin pada bakteri gram negative dapat tercuci dan
menyebabkan sel bakteri tampak transparan, yang akan berwarna merah
setelah diberikan safranin. Pengamatan bakteri ini dilakukan dengan
menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 kali obyektif. Pada
perbesaran 100 kali obyektif digunakan cairan imersion oil yang berfungsi
untuk memfokuskan cahaya (mencegah/menghilangkan adanya refluksi
cahaya).
 6.2. Teknik Aseptis

Teknik aseptic adalah teknik kerja yang bertujuan untuk menjaga dan
menghindari alat dan bahan uji dari kontaminan. Pada percobaan kali ini
bertujuan untuk dapat memindahkan biakan bakteri dari satu media ke
media lain secara aseptis dan mampu memahami pentingnya teknik aseptis
dalam bekerja di laboratorium mikrobiologi farmasi.
Pertama, dibuat media untuk menanam bakteri, yaitu media nutrien
agar dan nutrien broth. media nutrien agar yang ditempatkan pada tabung
dimiringkan sekitar 45⁰ agar terbentuk media agar miring, sedangkan yang
ditempatkan pada cawan dituang biasa dan semua media yang sudah
ditempatkan di tabung maupun di cawan segera ditutup agar terhindar dari
kontaminasi.
Bahan dasar nutrient agar dan nutrient broth yang sudah terbuat segera
dimasukan kedalam autoklaf selama 15 menit, untuk media cair dan media
agar miring dimasukkan kedalam tabung serta ditutup dengan kapas berlapis
aluminium foil, namun untuk media padat belum dimasukkan ke dalam
cawan. Pada proses sterilisasi dengan autoklaf cawan petridise dibungkus
dengan kertas payung dan diletakan pada posisi terbalik agar pada saat
sterilisasi dengan autoklaf cawan tidak basah terkena uap air dari autoklaf
tersebut. Prinsip autoklaf adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam
keadaan basah dibandingkan dengan keadaan kering. Sterilisasi ini
menggunakan teknik pemanasan uap bertekanan tinggi pada suhu 121⁰C
selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Hal ini bertujuan agar tidak hanya
bakteri saja yang mati tetapi bentuk vegetatifnya yaitu spora yang tahan
pemanasan.
Setelah sterilisasi dengan autoklaf, kemudian semua media dibawa ke
LAF ( Laminar Air Flow ) yaitu, tempat kerja untuk pemindahbiakan dan
pengujian mikroba. LAF termasuk jenis metode sterilisasi dengan cara
mengalirkan udara bersih secara horizontal maupun vertikal. Adapun cara
 penngunaan dari LAF adalah lampu UV dinyalakan terlebih dahulu,
kemudian dibiarkan selama 30 menit. Selanjutnya lampu UV dimatikan
dan dinyalakan FAN dan LAMP. Fungsi dari LAF dalam praktikum ini
adalah untuk menanam media dan memindahkan media. Pastikan pada saat
memindahkan media di dalam LAF selalu dekat dengan sumber api
( bunsen ). Hal ini bertujuan untuk menjaga media tetap steril. Sebelum
digunakan untuk memindahbiakan baktri ose disterilkan dengan
membakarnya pada nyala api sampai membara dan didiamkan sebentar
sampai dingin, karena jika masih panas dikhawatirkan apabila langsung
digunakan untuk mengambil bakteri, bakteri tersebut akan mati.
Sterilisasi adalah setiap proses yang membunuh semua bentuk hidup
terutama mikroorganisme, terdapat tiga macam, yaitu sterilisasi secara
fisik, kimia, dan mekanik. Sterilisasi fisik contohnya pemanasan kering
dan pemanasan basah, pemanasan basah ialah yang dipergunakan dalam
praktikum kali ini, yaitu dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi kimia
ialah menggunakan bahan – bahan kimia yang bersifat antimikroba, antara
lain fenol dan derivatnya, alkohol, halogen beserta gugusannya, logam
berat dan gugusannya, detergent, aldehid, dan gasterilisator ( etilen oksid ).
Contoh sterilisasi mekanik ialah filtrasi, digunakan untuk bahan yang tidak
tahan pemanasan. Fiksasi ialah proses sterilisasi dengan cara pembakaran,
pemanasan ini lebih rendah suhunya daripada autoklaf, yaitu pada suhu 40
⁰C. Fungsi fiksasi yaitu, membunuh bakteri dan menghilangkan lipid, serta
memudahkan pengamatan.

Setelah bakteri selesai ditanam dalam media, kemudian dimasukkan

ke dalam inkubator pada suhu 37 ⁰C selama 18 – 24 jam. Suhu 37 ⁰C
merupakan suhu tubuh, waktu 18 – 24 jam merupakan waktu optimum
bakteri untuk tumbuh dan berkembangbiak. Pada saat dimasukkan ke dalam
inkubator, cawan petri diletakkan terbalik untuk menghindari kontaminasi
karena uap air akan membasahi media jika cawan petri tidak dibalik pada saat
 inkubasi dan dapat mengganggu perkembangbiakan serta pertumbuhan
bakteri yang di tanam. Dilakukan pengamatan setelah di inkubasi selama 24
jam, hasil yang diperoleh pada percobaan, sebagai berikut :

a. Pada pemindahbiakan bakteri dari media cair ke media cair S.Aureus :

sebelum ditambahkan biakan kedalam media, media terlihat berwarna
jernih, namun setelah diberi biakan dan diinkubasi didalam oven (37C)
selama 24 jam, diamati terjadi perubahan warna. Pada tabung reaksi
(media cair) hasilnya sedikit keruh dan terdapat endapan, maka
dapat disimpulkan bahwa media cair ke cair tersebut terdapat
kontaminan di dalamnya.
b. Pada pemindahbiakan bakteri dari media agar miring ke media agar
miring (slant to slant), S. Aureus (Nutrient Agar) : Setelah diinkubasi
didalam oven (37C) selama 24 jam, pertumbuhan bakteri pada kedua
tabung berbeda. Tabung pertama pertumbuhan bakteri sesuai
dengan arah goresan dan terjadi pemisahan koloni, sedangkan
tabung kedua tidak sesuai dengan arah penggoresan dan terdapat
gumpalan putih pada beberapa sisi. Gumpalan tersebut merupakan
kontaminan.
c. Pada Staphylococcus aureus (Nutrient Agar) : Setelah diinkubasi
didalam oven (37C) selama 24 jam, pertumbuhan bakteri tidak
sempurna terbentuk baik pada penggoresan teknik continous
streak maupun teknik penggoresan quadrant streak karena koloni
yang terbentuk hanya terdapat dibeberapa bagian goresan, sebab
masih terlihat gumpalan putih yang merupakan kontaminan berupa
jamur di bagian goresan yang lain pada media plate baik secara
continous dan quadrant streak.

Dari hasil keseluruhan didapatkan bahwa semua media terdapat kontaminan.

Hal ini mungkin disebabkan karena kurang steril dalam pengerjaannya.
VII. KESIMPULAN
1. Teknik aseptic adalah sutu teknik untuk menghindari alat dan bahan
dari adanya mikroorganisme dan kontaminan.
2. Bakteri gram-positif akan berwarna ungu sebab senyawa kompleks
violet-yodium tidak larut, sedangkan bakteri gram-negatif akan
berwarna merah sebab senyawa komplek larut dan digantikan oleh
safranin.
VIII. DAFTAR PUSTAKA

1. Anonim, 2010, Teknik Aseptis , available at :

www.cht.nhs.uk/fileadmin/.../Section_G_-_Aseptic_Technique_Issue_2.pdf,
diakses: 25 september 2010.
2. Waluyo, lud., 2008, Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi, UMM
Press, Malang.
3. Anonim, 2010, Pengertian Aseptis, available at :
http://www.thefreedictionary.com/aseptic, diakses: 25 September 2010.
4. Lay, Bibiana W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja
Grafindo Persada, Jakarta.
5. Anonim, 2008, Pengecatan Gram, available at: http://www. pengecatan-
gram.html, diakses: 25 September 2010.
 LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI

Teknik Aseptik dan Pengecatan Bakteri

Oleh :

Ansharudin Alhaq (C-2)

Nurul Fatimah (C-2)

Tarias Rahayu (C-1)

Endah Nurrohwinta Djuwarno (C-3)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA

2010