PEWARNAAN GRAM

A. Tujuan
1. Melihat jenis bakteri gram
2. Mempelajari pewarnaan gram

B. Landasan teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin
yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen
biru dan air furksin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
 Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram

negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid
4%) tinggi
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

C. Alat dan Bahan

Alat :
1. Mikroskop
2. Lampu spirtus
3. Kaca objek
4. Kaca sediaan
5. Kertas hisap
6. Jarum inokulasi/ose
 Bahan :
1. Biakan murni dari Streptococus aureus dan E. Coli, atau suspensi dari bekteri tersebut dalam
air steril.
2. Zat warna :
a. Crystal violet (modifikasi Hucker)
b. Larutan iodium gram
c. Safranin
3. Alkohol 95%
D. Cara Kerja
1. Menyiapkan 2 buah kaca objek yang bersih
2. Membuat film bakteri pada kaca sediaan, dengan garis tengah _ 1cm.
3. Fiksasi
4. Memberikan zat warna utama kristal violet selama 2 menit.
5. Membuang kelebihan zat warna
6. Membilas dengan air mengalir
7. Setelah agak kering meneteskan larutan pewarna iodium gram, selama 2 menit.
8. Membuang kelebihan zat warna
9. Membilas dengan air mengalir
10. Meneteskan larutan alkohol 95% sedikit demi sedikit, sehingga larutan yang mengalir dari
noda berwarna menjadi tidak berwarna (pemucatan).
11. Membilas dengan air
12. Menteskan zat warna penutup, yaitu larutan safranin berwarna merah atau karbon fuchsin
selama 2-3 meint
13. Membuang kelebihan zat warna
14. Membilas dengan air mengalir
15. Menyerap sisa air dengan kertas hisap

E. Hasil Pengamatan
1. Hasil pengamatan bakteri Streptococus aureus
Berdasarkan gambar berikut dilihat pada perbesaran 10x berwarna merah muda yang
berarti bakteri tersebut termasuk Gram negatif dengan pola penataannya berkoloni, Penataan
bakteri jenis streptococcus (lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan membentuk
rantai). Dari ciri-ciri tersebut bakteri pada preparat olesan tersebut adalah bakteri
streptococcus.
 Perbesaran 10x

Perbesaran 40x

2. Hasil pengamatan bakteri Escherichia coli

Berikut adalah gambar bakteri Escherichia coli yang didapat saat praktikum yaitu
menghasilkan warna ungu. Berarti bakteri tersebut mampu mempertahankan warna ungu,
oleh karena itu termasuk bakteri gram positif.
 Perbesara 10x

Perbesaran 40x

F. Pembahasan
Tabel Hasil Pengamatan,
No Nama Pengamatan Warna Hasil
Ungu Merah Muda
Bakteri gram
1 Bakteri Sampel A - ü
negatif
Bakteri gram
2 Bakteri sampel B ü -
positif
 Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).
Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:
a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.
b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun,
formalin, fenol.
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.
Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.
Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini
merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target.
Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang
bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan
warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan
dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar
cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel
yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang
berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner.
Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses
fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan
bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak
terkena nyala api.
Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya
hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna
oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan
didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin
lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 95% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 5 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya
hilang. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen
dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen
dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol
pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme
(bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol
95% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 95%
gram + : lipid << + alkohol 95% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel
terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)
gram - : lipid >> + alkohol 95% pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel
terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)
Alkohol 95% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 5 detik kemudia
dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada
yang tersisa di dalam gelas benda.
Setelah pembilasan reagen alkohol 95% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya
diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit.
Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan
 pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat
atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding
selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel
dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna
ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan
dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu
pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi
bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap
gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi
kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-
masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan
kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan
diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah
mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan
jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

G. Kesimpulan
1. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram
adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini
berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram
positif dan gram negatif. Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain:
a. Pembuatan olesan bakteri
b. Fiksasi
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.
2. Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
 3. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel A dapat dikelompokkan dalam bakteri
gram negatif karena menunjukkan warna merah muda ketika diamati di bawah mikroskop.
4. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel B dapat dikelompokkan dalam bakteri
gram positif karena menunjukkan warna ungu ketika diamati di bawah mikroskop.

DAFTAR PUSTAKA
Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. [online].tersedia :
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. [19 oktober2012]

Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http //pewarnaan bakteri\Mikroum…
Pewarnaan Gram « RIZQI FAJRIANA BLOG’S.htm/. 19 oktober 2012.