PEWARNAAN GRAM

PRAKTIKUM III

I. JUDUL :Pewarnaan Gram

II. TUJUAN :Untuk Mengetahui Tata Cara Pewarnaan Gram
III. HARI/TANGGAL :Rabu/05 April 2023
IV. Landasan Teori
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil.
Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan
sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian- penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempermudah proses
identifikasi bakteri. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan
gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah
dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan
yang positif berwarna merah (Moda Kevin Febrianus.,2019).
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram
positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Den mark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik
tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan
bakteri Klebsiella Pneumonia. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil
yaitu gram positif dan gram negatif, tergantung dari reaksi dinding sel
terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif
ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri
gram negatif misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak
terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium sp, karena
dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan
tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut sel bakteri
akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (Firmansyah
Iman.,2015).
 Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam.
Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna
disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna
asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan
negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif
banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu
proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan
muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Firmansyah Iman.,2015) .
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk
mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang
bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang
terdapat pada struktur sel. Kadang kala zat warna negatif digunakan untuk
mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa
muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah
bergantung pada ph sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Firmansyah
Iman.,2015).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan
mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini
dapat digunakan zat warna basa yang bermuatan positif maupun zat warna
asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar
belakang di sekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan
kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup
penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas. Prinsip
pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar
(Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri gram positif terlihat
berwarna ungu karena dinding selnya mengikat kristal violet lebih kuat,
sedangkan sel gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-
pori mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol
(Firmansyah Iman.,2015).
 Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu
untuk membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri
dicampur dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan
di tengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan di fiksasi.
Dengan kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci
dengan air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium selama dua
menit, dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Selanjutnya diberi
larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna ungu
tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikering anginkan.
Kemudian digenangi lagi dengan safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan
dibiarkan kering di udara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan
bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif
(Firmansyah Iman.,2015).
Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu
pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan
anggota-anggota dominan bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan
perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
lebih sederhana dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding
sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan
secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel
gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat
dengan lipid. Di antara bakteri patogen, yang menyebabkan penyakit,
spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan
spesies gram-positif. Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel
bakteri gram negatif sering bersifat toksik (racun), dan membran bagian luar
membantu melindungi bakteri gram-negatif patogen melawan sistem
pertahanan inangnya. Lebih jauh, bakteri gram negatif umumnya lebih
resisten terhadap anti biotik dibandingkan dengan gram-positif karena
membran bagian luar itu menghalangi masuknya obat-obatan (Firmansyah
Iman.,2015).
V. CARA KERJA PEWARNAAN GRAM
A. Pra Analitik
1. Alat
a) Botol semprot
b) Jarum ose
c) Mikroskop
d) Preparat
e) Pembakar spritus
f) Pipet tetes
g) Rak tabung
h) Spoit
2. Bahan
a) Biakan murni bakteri e-coli & stapilococus aureus pada media
Na
b) Alkohol
c) Larutan iodin/lugol
d) Larutan kristal violet
e) Larutan nacl
f) Oil imersi
g) Safranin
B. Analitik
1. Menyiapkan objek glas yang sudah dibersihkan dengan alkohol
70%
2. Buat buat preparat olesan dengan cara meneteskan kultur bakteri
kurang lebih 1-2 tetes ( jika dari kultur cair), untuk kultur bakteri
padat dilakukan dengan cara meneteskan aquades steril satu tetes
pada objek glass selanjutnya dioleskan kultur bakteri dengan ose
bulat pada tetesan aquades secara merata.
3. Olesan bakteri di kering anginkan dan selanjutnya di fiksasi
dengan cara melakukan preparat di atas api beberapa kali.
Selanjutnya dilakukan pengecatan gram.
 4. Pewarnaan gram terdiri dari empat tahap yaitu: a). Pemberian cat
utama crystal violet dan dibiarkan selama 1 menit selanjutnya
dibilas dengan air mengalir. Kering angin kan. b). Pemberian
larutan lugol/iodium, biarkan 1 menit lalu bilas dengan air
mengalir dan kering anginkan. c). Pemberian larutan alkohol,
biarkan 30 detik lalu bilas dengan air mengalir, kering angin kan.
d). Pemberian cat penutup safranin, biarkan 1 menit, bilas dengan
air mengalir lalu kering anginkan.
5. Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran 400-1000x.
C. Pasca Analitik
1. Bentuk Basil
2. Berwarna Merah
3. Gambar

PEWARNAAN GRAM
VI. PEMBAHASAN
Pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna
dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena
merupakan tahapan penting dalam langkah awal bantuan. Pewarnaan ini
berdasarkan tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan
banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan gram
positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai
dinding sel yang berada diantara dua lapis membran sel (Firmansyah
Iman.,2015).
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna
metil selama proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru
dan ungu di bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan
berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini
terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Firmansyah Iman.,2015).
Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa
pewarnaan gram. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau
mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten
dalam alat yang akan digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian
melakukan olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi
di api pada pembakar spiritus yang bertujuan untuk mematikan bakteri
dengan cepat pada ose, supaya tidak tercampur dengan bakteri yang akan di
uji. Sebelum melakukan pengolesan bakteri kaca objek di beri tanda
lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk melakukan pengolesan sel
bakteri dari suspensi. Pada percobaan kali ini pengolesan di lakukan dua
kali dengan sampel suspensi campuran bakteri E. coli Dan S. Aureus
(Firmansyah Iman.,2015).
VII. KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang telah kita lakukan dapat disimpulkan
bahwa pewarnaan gram digunakan untuk membedakan mikroorganisme,
khususnya bakteri, yaitu bakteri gram positif dan negatif. Bakteri gram
positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis dan
berwarna ungu, sedangkan gram negatif memiliki dinding sel tipis yang
berada di antara dua lapis membran sel dan berwarna merah.