PRAKTIKUM

PEWARNAAN MAJEMUK
(PEWARNAAN GRAM)
A. Landasan Teori
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri
dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk
melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan
vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme
dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat
dibedakan

menjadi

tiga

macam

yaitu

pengecatan

sederhana,

pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna

pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan
tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian
sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan,
2007).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi
dua golongan, yaitu: Gram positif , bila warna zat pewarna pertama
(karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan demikian warna se
bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna
pertamatidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna
tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna
tandingan lainnya (Razali, 1987).
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan
Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini,
berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan
ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang
penting; dinding sel bakteri Gram negatifpada umumnnya lebih tipis
dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid

bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya

dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan
alkohol

mengeskstrak

lipid,

yang

menyebabkan

poisitas

atau

permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks

karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram
negatif

terwarnakan.

Keterangan

lain

yang

hampir

sama

juga

mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan

bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan
jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit
daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram
negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks
karbol gentian violet dan lugol. Selanjutnya, bila sel-sel Gram positif
diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa
strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan
tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel
ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa
struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat
tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet (Razali,
1987).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang
salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif
dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk
membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua
golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif
dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada
ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa
adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan
anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat
warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat

dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah

bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi
oleh

faktor-faktor

seperti

fiksasi,

peluntur

warna,

substrat,

intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo,

1991).
B. Tujuan Praktikum
Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan menggunakan
beberapa macam zat warna dengan metode gram.

C. Alat dan Bahan

No.

Alat

1.

Bunsen

2.

Jarum

3.

Bahan
Spirtus Larutan Iodium

Ose Alkohol 95%

Zat Warna Fuchsin

Kaca Objek

4.

Gentia Violet

Tabung Reaksi
5.

Aquadest

Pipet Tetes
6.

Mikroskop
7.

Tissue
D. Langkah Kerja
Buat preparat
bakteri, keringkan
dan fiksasi
Preparat diberi
larutan iodium/lugol
selama 30 detik
Preparat dibilas
dengan aquadest

Preparat dibilas
dengan aquadest

Preparat diberi zat

warna awal gentian
violet selama 30
Preparat dibilas
dengan aquadest

Preparat perlu
dihilangkan
warnanya
dihilangkan dengan
menambah larutan
Preparat diwarnai
kembali dengan zat
warna lawan yaitu
fuchsin selama 30
detik

Kelebihan air
dihilangkan dengan
aquadest
E. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Preparat bakteri
yang sudah siap,
diamati dibawah
mikroskop dengan
pembesaran lensa

Pembahasan
Berdasarkan hasil pengamatan praktikum proses pewarnaan
gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan
supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya
menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes
aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil
dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak
diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan
dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri
akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya
satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan
diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar
melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus
apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses
fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak
terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan
Gentia Violet sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 30 detik.
Kemudian bilas dengan aquades dan dibiarkan sampai kering dengan
cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian
bawah ojek gelas.
Kemudian ditambahkan larutan iodium larutan yang berfungsi
untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri
sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas
warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna.
Kemudian bilas dengan aquades dan dibiarkan sampai kering dengan
cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian
bawah ojek gelas.
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri
untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan

pewarnaan biru dari komplek methylen blue pada gram negatif, karena
mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap
mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan.
Larutan ini juga berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane
bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar
sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue.
Biarkan selama 15 detik.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin sebanyak
1-2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Cat yang terdiri dari campuran
safranin 0, 25 gram , etil alkohol 95% 10 ml, dan akuades 90 ml.
Safranin tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri
positif karena persenyawaan kompleks methylene blue tetap terikat
pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan
menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna
biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya
membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D
atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat
warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian bilas dengan aquades dan
kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat
sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna
mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna
yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan
cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi
bakteri jenis termofilik yang mempunyai bentuk coccus (bulat) dan
berwarna biru, bakteri ini digolongkan ke dalam bakteri gram positif
karena ciri-cirinya menunjukkan ciri bakteri gram positif. Sedangkan
untuk sampel bakteri kedua, diidentifikasi bakteri E.coli yang
mempunyai bentuk basil (batang) dan berwarna merah, bakteri ini
digolongkan ke dalam bakteri gram negatif, karena menunjukkan ciriciri dari bakteri gram negatif.
Hasil pengamatan tersebut dapat dinyatakan berhasil dan benar,
karena berdasarkan literatur yang ada bakteri E.coli merupakan
golongan bakteri gram negatif.
F. Diskusi
1. Apa yang dimaksud pewarnaan majemuk?
Pewarnaan majemuk ini digunakan lebih dari satu macam bahan
cat. Dengan cara ini bahan-bahan cat yang dipakai ada kalanya
terpisahdan ada kalanya tercampur dan digunakan dalam satu

larutan. Dua macam pengecetan yang terpenting dari golongan ini

adalah pengecetan gram dan pengecetan tahan asam.
2. Mengapa perlu dilakukan pencucian dengan alkohol?
Untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan
pewarnaan biru dari komplek methylen blue pada gram negatif,
karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap
mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan.
Larutan ini juga berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane
bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel
membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan
methylene blue.
3. Mengapa hasil warna sel bakteri yang diperoleh antara gram positif
dan gram negative berbeda? Jelaskan!
Karena Gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat
warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan
berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Disisi lain, bakteri
gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan
dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,
sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.
Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi
peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative
lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

G. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan dapat ditarik
kesimpulan sebagai berikut:
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat
digunakan untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram
positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi
bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan
bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna
methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini
mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan
warna methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini

mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.

Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteri
E.coli merupakan golongan bakteri gram negatif, sedangkan bakteri
jenis termofilik merupakan golongan bakteri gram positif.
H. Daftar Pustaka
Pelczar, M, Chan, E. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. Jakarta:
Universitas Indonesia Press.
Razali, U. 1987. Miikrobiologi Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.