PRAKTIKUM PEWARNAAN GRAM

Analisis Mikrobiologi

Elsa Rahmawati XII KA B

Jln. Raya Karangpawitan Garut, Kab. Garut, Indonesia, Jawa Barat, 44182
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Bakteri termasuk sebagai mikroorganisme yang memiliki daya sebar paling luas di
alam. Tingkat daya sebar yang tinggi disebabkan oleh kemampuan bakteri untuk hidup di
berbagai tempat dan mampu menguraikan senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih
sederhana. Sel-sel individu bakteri memiliki berbagai macam bentuk yaitu, coccus, basil dan
spiral. Bakteri dapat hidup soliter ataupun berkoloni dan memperbanyak diri nya dengan cara
membelah diri. Bakteri memiliki berbagai macam bentuk diantaranya, bentuk batang/basil,
bulat/kokus, lengkung/spiral.
Salah satu cara yang digunakan untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme adalah
dengan teknik pewarnaan Gram yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi. Untuk
pengamatan morfologi mikroskopik mikroorganisme dengan sifatnya yang khas dapat
menggunakan pewarnaan tertentu (pewarnaan Gram) sebagai identifikasi awal. Metode
pewarnaan ini pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. 
untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pewarnaan
sederhana, pewarnaan negatif maupun pewarnaan gram serta mengetahui morfologi
mikroorganisme. Faktor-faktor penentu keberhasilan di dalam pewarnaan mikroba adalah
Fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan zat warna penutup/warna
tandingan. 
Ada beberapa jenis teknik pewarnaan yang paling sering digunakan dalam
mengidentifikasi bentuk-bentuk morfologi dari mikroorganisme, diantaranya: 
a. Pewarnaan Negatif
Pewarnaan ini ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, pada metode ini bukan
untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai lingkungan sekitarnya karena pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami
perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, sehingga penentuan sel dapat diperoleh
dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat asam seperti eosin atau nigrosin.
b. Pewarnaan Sederhana
Metode ini merupakan proses pewarnaan yang paling umum digunakan. Pada
metode ini hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme.
Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif).
Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam
 tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada
olesan yang diwarnai. Pewarnaan dilakukan dengan memakai satu macam larutan cat.
c. Pewarnaan Gram
Pewarnaan ini dikembangkan oleh Christian Gram (1884) dan populer dengan
istilah pewarnaan Gram.
Pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi
dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka.
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya
akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan
kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna
tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah.
Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya. 
d. Pewarnaan Spora
Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap panas dan bahan kimia.
Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang
tidak menguntungkan bagi bakteri. Contoh bakteri yang membentuk spora adalah Bacillus,
Clostridium, Thermactinomyces dan sporosacina. Spora terbentuk di dalam sel sehingga
disebut sebagai endospora. Dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora. 
Dalam lingkungan yang menguntungkan spora bergerminasi kembali menjadi sel
vegetative, jika lingkungan tidak memungkinkan maka sel vegetative aka berubah menjadi
spora. 
1.2. Tujuan
Untuk mengetahui bakteri gram positif dan gram negatif, dengan menggunakan prosedur
pewarnaan gram.
1.3. Tinjauan Pustaka
Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan Gram
(Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkananggota- anggota dominan bakteria ke
dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yanglebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel
bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secarastruktural lebih
kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida,
yaitu karbohidrat yang terikat denganlipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan
penyakit,spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-
positif.Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif sering bersifat
toksik (racun), dan membran bagian luar membantu melindungi bakteri gram-negatfi patogen
melawawn sistem pertahanan inangnya. Lebih jauh, bakteri gram negatif umumnya lebih
resisten terhadap antibiotikdibandingkan dengan gram-positif karena membran bagian luar
itumengahalangi masuknya obat-obatan.
 BAB II

ALAT DAN BAHAN

1.
2.

2.1. Alat

Nama Alat Jumlah

Pipet Tetes 4 Buah
Glass Objek 1 Buah
Botol Semprot 1 Buah
Spirtus 1 Buah
Baki 1 Buah
Korek 1 Buah

2.2. Bahan

Nama Alat Jumlah

Biakan Bakteri 1 Tetes
Kristal Violet 1 Tetes
Iodin 1 Tetes
Ethanol 96% 1 Tetes
Safranin 1 Tetes
Aquades Secukupnnya
Tissu Secukupnnya
 BAB III

PROSEDUR KERJA

1. Buat preparat ulas (smear) yang telah difiksasi dari bakteri gram positif misal Bacillus subtilis dan
gram negatif misal Escherichia coli.

2. Teteskan kristal violet sebagai pewarna utama,usahakan semua terwarnai dan tunggu selama ± 1
menit

3. Cuci dengan aquades mengalir

4. Teteskan mordant (lugol, s iodin) lalu tunggu ± 1 menit

5. Cuci dengan aquades mengalir

6. Beri larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi setetes sehingga etanol yang jauh berwarna
jernih. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize)

7. Cuci dengan aquades mengalir

8. Teteskan counterstain (safranin) dan tunggu selama ± 45 detik

9. Cuci dengan aquades mengalir

10. Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempatkan disisi ulasan (jangan sampai merusak
ulasan) lalu biarkan mengering diudara

11. Amati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100× dan 400×

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

3. a
4. a

4.1. Hasil
Pengamatan
Pembesaran :100×
Mikroba : Bacillus Subtilis
Bentuk : Batang
Warna : Ungu/ Violet

Gambar 4.1.

4.2. Pembahasan
Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel denganlapisan
peptidoglikan yang tebal. Bakteri ini akan berwarna ungu jikadiwarnai dengan pewarnaan
Gram. Contohnya Neisseria gonnorrhoaeae, Treponema pallidum, Vibrio Cholerae dan
Bacillus subtilis. SedangkanBakteri Gram Negatif adalah bakteri yang memiliki dinding sel
denganlapisan peptidoglikan yang tipis. Bakteri ini akan berwarna merah muda ataumerah,
kila diwarnai dengan pewarnaan gram. Contohnya Streptococcusmutans, Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli.
Pada praktikum kali ini saya menggunakan biakan bakteri yang sudah tersedia di dalam
tabung reaksi, lalu teteskan biakan bakteri tersebut ke glass objek menggunakan pipet tetes
sebanyak 1 tetes lalu glass objek di panaskan menggunakan pembakar spirtus sampai
mengering setelah di rasa sudah mengering lakukan fiksasi sebanyak 3kali, lalu teteskan
kristal violet sebagai perwarna utama sebanyak 1 tetes hingga menutupi biakan bakteri yang
sudah mengering lalu tunggu selama kurang lebih 1menit, setelah menunggu selama 1menit
bilas glass objek menggunakan aquades secara perlahan di ujung atas glass objek supaya
aquades mengalir tanpa menghilangkan biakan bakteri bilas sampai kristal violet benar benar
tidak ada di glass objek atau sampai tidak menggumpal warna kristal violet, biakan bakteri
setelah di tambah kan kristal violet berubah warna menjadi sedikit ke ungu an,lalu teteskan
iodin sebanyak 1tetes hingga menutupi biakan bakteri tunggu selama kurang lebih 1menit
setelah menunggu selama 1menit bilas kembali glass objek menggunakan aquades secara
perlahan di ujung atas glass objek supaya aquades mengalir tanpa menghilangkan biakan
bakteri dan iodin, biakan bakteri setelah di tambah kan iodin berubah warna menjadi kuning
kecoklatan, setelah itu teteskan etanol sebanyak 1tetes hingga menutupi biakan bakteri yang
sudah di tetesi kristal violet dan iodin, tunggu selama kurang lebih 1menit lalu bilas kembali
glass objek menggunakan aquades secara perlahan supaya biakan bakteri tidak ikut terbilas,
biakan bakteri setelah di tambah kan etanol menjadi bening atau jernih setelah di bilas warna
nya menjadi luntur, lalu di tetes kan safranin sebanyak 1tetes hingga menutupi biakan bakteri
tunggu selama kurang lebih 45detik, biakan bakteri setelah di tambah kan safranin berubah
warna menjadi merah, setelah menunggu selama kurang lebih 45 detik glass objek di bilas
menggunakan aquades secara perlahan di ujung atas glass objek supaya aquades mengalir
tanpa menghilangkan biakan bakteri dan safranin, keringkan glass objek menggunakan tissue
yang di tempatkan di sisi ulasan jangan sampai merusak atau mengenai ulasan, lalu biarkan
mengering di udara setelah di rasa cukup mengering amati glass objek di bawah mikroskop
dengan pembesaran 100x dan 400x. Atur pencahayaan dan kesiapan mikroskop untuk menguji
sampel pada glass objek setelah di rasa pencahayaan sudah pas amati glass objek dengan
pembesaran 100x, hasil dari pembesaran 100x terlihat sangat jelas terdapat biakan bakteri
berbentuk basil berwarna ungu atau violet karena bakteri gram positif memiliki dinding sel
yang stabil di banding bakteri gram negatif.
 BAB V

KESIMPULAN

Dapat mengamati bakteri negatif dan positif menggunakan prosedur perwarnaan gram, biakan yang
saya uji coba adalah bakteri gram positif karena berwarna ungu/ violet dan bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal di banding bakteri gram negatif, Nama bakterinya adalah Bacillus
subtilis berbentuk batang atau basil.
 DAFTAR PUSTAKA

Aryulina, Diah.2004.Biologi Umum. Jakarta : Erlangga.

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.