A.

JUDUL
Pengecatan Gram
B. TUJUAN
Dengan Praktikum ini, Mahasiswa mampu membuat pulasan
bakteri dan melakukan pengecatan gram.
C. DASAR TEORI
Mikrobioligi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk
hidup yang kecil, yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop. Makhluk
hidup yang kecil ini disebut mikroba atau mikro-organisme. Bakteri
berasal dari kata latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok
raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil kebanyakan
uniseluler dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nucleus. Istilah
“bakteria” telah diterapkan untuk semua prokariota atau kelompok besar
mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri
adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar
ditanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen
merupakan bakteri. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai
morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri.
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana
el-sel bakteri tersebut di suspensikan,. salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah degan
metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangakaian pengecatan (Entjang, 2003).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri
sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan
menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 kali atau lebih. Sel
bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat
berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri
lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna
kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran,
bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran.
(Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri
dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat
struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,
menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri
dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan
sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan
menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad
renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada
lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara
sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Bakteri yang diwarnai dengan tenik pewarnaan gram terbagi
menjadi dua golongan, yaitu gram positif dan gram negatif ialah setelah
diberi zat pewarna fenomenanya berhubungan dengan struktur dan
komposisi dinding sel perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu
dapat merupakan hal yang penting, dinding sel bakteri gram negaitf
umumnya lebih tipis dari yang dimiliki gram positif, presentasi
kandungan lipid bateri negatif lebih tinggi daripada gram positif,
kenyataan dalam eksperimen pengecatan menunjukkan bahwa perlakuan
dengan alkohol mengekstrak lipid yang menyebabkan polsitas atau
permeabilitas dinding sel meningkat. (Umsi. 2008)
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 3 jenis reagen, reagen
pertama disebut warna dasar berupa warna basa jadi pewarna ini akan
mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna,
tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila
komponen dinding sel kuat mengikat warna maka warna tidak akan
 tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna
dasar maka warna akan tercuci. Reagen trakhir adalah warna pembanding
akan terlihat. (Tracy. 2005)

D. ALAT DAN BAHAN

No. ALAT BAHAN

1. Gelas preparat Kultur murni bakteri
2. Jarum ose Crystal violet
3. Bunsen Iodine
4. Label preparat Alkohol 96%
5. Penjepit kayu Safranin
6. Tissue Minyak Immersi
7. Mikroskop cahaya Isolat Murni Bakteri
8. Pipet Aquadest

E. PROSEDUR KERJA
A. Pembuatan pulasan bakteri
 Bersihkan gelas benda/preparat dengan alkohol kemudian dikeringkan
dengan menggunakan tissue, nyalakan lampu Bunsen.
 Ambil tabung reaksi yang berisi kultur murni bakteri kemudian buka
penutup tabung reaksi. Setelah itu, panaskan mulut tabung reaksi.
 Ambil jarum ose dengan menggunakan tangan kanan kemudian
panaskan dengan menggunakan api lampu bunsen. Setelah itu,
dinginkan beberapa saat.
 Ambil kultur murni bakteri dengan menggunakan jarum ose yang
telah disterilkan.
 Setelah itu, tutup kembali tabung reaksi yang berisi kultur murni
bakteri, ambil gelas benda/preparat yang telah steril kemudian jepit
dengan menggunakan penjepit gelas benda yang steril.
 Letakkan kultur murni bakteri tersebut pada gelas benda/preparat
secara merata dan tersebar.
 Lakukan fiksasi (pemanasan gelas benda/preparat dengan
mendekatkannya ke api lampu bunsen secara berulang-ulang)
 Pulasan bakteri siap digunakan untuk pengecatan gram.

B. Cara kerja pengecatan gram

 Siapkan gelas benda/preparat yang berisi pulasan bakteri.
 Teteskan gelas benda/preparat tersebut dengan crystal violet kemudian
diamkan selama 1-2 menit. Setelah itu bersihkan dengan
menggunakan aquades dan keringkan dengan menggunakan tissue.
 Teteskan gelas benda/preparat tersebut dengan larutan iodene/lugol
kemudian diamkan selama 1 menit. Setelah itu, bersihkan dengan
menggunakan aquades.
 Teteskan gelas benda/preparat tersebut dengan alkohol kemudian
diamkan selama 20 detik.
 Teteskan gelas benda/preparat tersebut dengan larutan safranin
kemudian diamkan selama 30 detik. Setelah itu bersihkan dengan
menggunakan aquades dan keringkan dengan menggunakan tissue.
 Teteskan minyak immersi kemudian amati bakterinya dengan
menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000x
 Gambarkan hasil-hasil pengecatan bakteri dan jelaskan sifat gram dari
bakteri tersebut.
F. HASIL PENGAMATAN
Kelompok 1

Kelompok 2

Kelompok 3
 Kelompok 4

G. PEMBAHASAN
Pewarnaan Gram adalah Pewarnaan atau pengecatan diferensial
yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium
mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal
identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram yang dibagi menjadi dua, yaitu
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel
yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan gram negatif mempunyai
dinding sel tipis yang berada diantara dua lapisan membran sel.
(Manurung. 2010)
Tujuan dari pewarnaan atau pengecatan gram bakteri yaitu :
(Waluyo. 2008)
a. Memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop
b. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba
c. Melihat stuktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola
d. Dapat menghasilkan sifat-sifat fisika dan kmia dari bakteri dengan zat
warna.
Macam-macam pewarnaan atau pengecatan bakteri, ialah :
1) Pewarnaan sederhana, memungkinkan untuk melihat bakteri dengan
jelas tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda
dalam morfologi yang sama.
2) Pewarnaan tahan asam, untuk bakteri yang mengandung sejumlah
besar zat lipid didalam dinding selnya yang menyebabkan tidak
permeabel terhadap zat warna yang umum.
3) Pewarnaan spora, untuk bakteri yang membentuk endapan yang tahan
terhadap kondisi ekstrim sehingga dibutuhkan perlakuan yang keras.
4) Pewarnaan kapsuk dan pewarnaan negative.
Perbedaan Gram positif dan Gram negatif berdasarkan warna,
Gram positif ungu dan Gram negatif merah. (Fitria. 2009)
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram
negatif(-)

Komposisi dinding Kandungan lipid Kandungan lipid

sel rendah (1-4%) tinggi

Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan

penisilin

Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat

pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies Relatif sederhana
relatif kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

(Manurung. 2010)
Tujuan dari proses fiksasi yaitu untuk menguapkan air sehingga
hanya akan didapat bakteri saja, agar bakteri benar-benar melekat pada
gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak terhapus
apabila dilakukan pencucian.
Ada 5 larutan sampel yang digunakan dalam percobaan pengecatan
warna, yaitu Safranin, Crystal Violet, Iodine, Alkohol 96% dan minyak
immersi yang mempunyai fungsinya masing-masing.
 a) Iodine merupakan pewarna mordan, berfungsi untuk memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama dan untuk memperkuat warna gram
positif.
b) Alkohol 96% merupakan solven organik yang berfungsi untuk
membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri.
c) Safranin merupakan pewarna sekunder berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah diberi
perlakuan dengan alkohol, masuk kedalam sel dan menyebabkan
sel menjadi warna merah pada bakteri gram negatif.
d) Crystal Violet merupakan pewarna primer berfungsi untuk
membentuk ikatan mg-ribonucleid acid pada membran atau
dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-ribonucleid
acid bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan dinding sel
yang bersifat asam, berwana ungu untuk gram positif.
Fungsi mikroskop cahaya ialah untuk mengamati bakteri secara
lebih terperinci struktur didalam sel bakteri tersebut yang tentu saja tidak
bisa diamati dengan mata telanjang. (Afrian. 2012)
Dalam praktikum kali ini kami menggunakan bakteri
Propionibacterium Acne, Staphylococcus Epidermidis, SP 1 dan SP 2.
Hasil yang kami dapatkan, yaitu :
Pada bakteri Propionibacterium acne, bakteri berbentuk basil
terlihat dari mikroskop cahaya dan juga berwana ungu, karena bakteri
menyerap larutan crystal violet yang artinya bakteri PA bersifat gram
positif.
Pada bakteri Staphylococcus epidermidis, hasil yang didapat
setelah diamati dengan mikroskop cahaya bakteri berbentuk kokus tidak
beraturan dan berwana ungu, sama seperti bakteri PA yang berarti bakteri
SE termasuk Gram positig.
Pada bakteri SP 1, hasil yang didapat pada mikroskop cahaya
bakteri ini berwarna merah dan berbentuk kokus tidak beraturan, karena
 bakteri menyerap larutan safranin yang berarti bakteri tersebut termasuk
gram negatif.
Pada bakteri SP 2, setelah diamati menggunakan mikroskop
terlihat bakteri berbentuk kokus tidak beraturan dan berwarna ungu yang
berarti bakteri ini menyerap larutan crystal violet, jadi bakteri tersebut
termasuk gram negatif.

H. KESIMPULAN
Pewarnaan atau pengecatan gram bertujuan untuk mengetahui
bakteri yang diuji termasuk bakteri gram positif atau gram negatif
menggunakan larutan primer dan sekunder yaitu crystal violet dan
safranin. Bakteri propionibacterium acne, staphylococcus epidermidis dan
SP 2 termasuk Gram Positif, sedangkan Bakteri SP 1 termasuk Gram
negatif.

I. DAFTAR PUSTAKA
Entjang, Indan. 2003. Mikrobiologi Dan Parasitologi Untuk Akademi
Perawat Dan Sekolah Tenaga Kesehatan yang Sederajat. PT.
CITRA ADITIA BAKTI. Bandung.

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007.Elements of Microbiology. Mc Graw

Hill BookCompany: New York.

Umsl. 2008. Staining Bacteria. www. umsl. Edu/ ~ microbes/ pdf/

staining bacteria. pdf, Diakses pada tanggal 7 Juni 2016.

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta

Tracy. 2005. Gram Staining. www. tracy. k12. ca. us/ thsa dvbio/ pdfs/
gram %20 stain. pdf, Diakses pada tanggal 7 Juni 2016.
Manurung, Pebrian. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. Jakarta

Purwoko, Tjahjadi. Dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi:

Laboratorium mikrobiologi UNS

Fitria, Bayu. 2009. Perwarnaan Gram (Gram Positif dan Gram Negatif).
Jakarta Universitas Indonesia

Afrian, M. 2012. Kamus Lengkap Biologi. Erlangga. Jakarta

Waluyo, L. 2008. Teknik Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. UMM

Press. Pp. 222.258