Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Pewarnaan Mikroorganisme
5 Tujuan : Mampu mempersiapkan kultur bakteri dan mengetahui perbedaan
Bakteri berdasarkan zat warna

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop perbesaran 100x10
yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit
terlihat. Tujuan dari pewarnaan adalah :
a. Untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop
b. Memperjelas ukuran dan bentuk bakteri
c. Untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel atau
lainnya
d. Menghasilka sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna
Pada umumnya zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah
satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negataif.
Senyawa-senyawa kimia ini dapat digunakan untuk membedakan bakteri karena reaksinya
dengan sel bakteri akan memberikan hasil yang berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan
sebagai dasar pada pewarnaan bakteri. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)
sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif)
Factor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan adalah fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
a. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna untuk :
1. Melekatkan sel bakteri pada gelas objek
2. Membunuh bakteri, karena sel-sel yang mati lebih mudah diwarnai
3. Melepaskan granular protein menjadi gugusan reaktif (NH 3+) yang akan bereksi
dengan gugus OH dari zat warna
4. Membuat sel-sel lebih kuat
5. Mencegah terjadinya otolisis sel yaitu pecahnya sel yang disebabkan oleh enzim-
enzim yang dikandungnya sendiri
6. Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna
Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan atau free drying atau dapat juga
dengan menggunakan bahan kimia seperti sabun, penol dan formalin. Cara fiksasi yang
paling banyak digunakan dalam pewarnaan bakteri ilaha dengan membuat lapisan

27
 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

suspense bakteri diatas gelas objek kemudian dikering anginkan dan lewatkan beberapa
kali di atas nyala api.
b. Peluntur warna
Peluntur zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel yang telah
diwarnai. Berguna untuk menghasilkan kontras yag baik pada bayangan mikroskop. Pada
umumnya sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan warnanya.
Ditinjau dari kekuatan ikatan antara sel dengan zat warna, maka dikenal istilah tahan
asam, tahan alcohol, tahan air dan lain-lain. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna
telah diikat kuat oleh sel sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh asam,
demikian pula tahan alcohol dan tahan air.
Beberapa macam zat peluntur warna antara lain :
1. Peluntur zat warna asam yaitu : HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran asam tersebut
dengan alcohol.
2. Peluntur zat warna basa yaitu : KOH, NaOH, sabun dan garam-garam basa
3. Peluntur zat warna yang lemah yaitu : alcohol, air, minyak, cengkeh, aseton dan
gliserin.
4. Garam-garam logam berat : AgNO3, CuSO4 dan lainnya
5. Garam-garam logam ringan : Na2SO4, MgSO4 dan lainnya.
c. Substrat
Zat warna asam dan basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa tertentu. Oleh karena
itu senyawa-senyawa organic seperti protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan
mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, makan
dapat dibedakan tiga macam sel yaitu : sel-sel asidofil, basophil dan sudanofil. Sel-sel
asidofil yaitu sel yang dapat mengikat zat warna asam, sel sudanofil dapat mengikat zat
warna yang dapat larut dalam minyak.
d. Intensifikasi pewarnaan
Zat warna dapat diintensifkan dengan cara menambahkan mordan yaitu suatu zat kimia
yang dapat menyebakan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena zat warna
terikat lebih kuat daripada jaringan sel.
Mordan dibagi atas dua macam yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam
adalah mordan yang bereaksi dengan zat warna basa misalnya tannin dan asam pikrat
Mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam seperti FeSO 4,
kalium antimonium.
Disamping dengan penambahan mordan, intensifikasi pewarnaan dapat dilakukan
dengan meningkatkan kadar zat warna dan suhu pewarnaan (60oC-90oC).
e. Zat warna penutup
Zat warna penutup adalah zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna
mula-mula yang digunakan. Guna dari zat warna lawan ini ialah untuk memberikn warna
pada sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Bakteri-bakteri yang
tidak segera dilunturkan warnanya oleh zat warna ini akan mempertahankan warna dari

28
 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

zat warna mula-mula. Sedangkan bakteri yang segera dilunturkan atau dihilangkan
warnanya akan mengambil warna dari zat warna lain.
Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberi
kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama, seperti pewarnaan gram.
Beberapa zat warna penutup antara lain, methylene blue, safranin, erytrosin dan lainnya.

Jenis Pewarnaan
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana atau pewarnaan tunggal adalah salah satu cara pewarnaan yang
hanya menggunakan satu macam zat warna. Zat warna yang dapat digunakan ialah
methylene blue, Kristal violet atau safranin.

a. Pewarnaan positif
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas objek glass yang
kemudian di fiksasi. Jangan menggunakan suspense bakteri yang terlalu padat, tetapi
jika suspense terlalu encer, maka juga akan ditemukan kesulitas saat mencari bakteri
di bawah mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel
bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur cahaya.
Cara kerja :
- Bersihkan objek glass dengan kapas
- Jika menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan. Jika digunakan
biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inoculum, satu ulasan saja
kemudian diberi akuades dan disebarkan secara merata.
- Keringkan ulasan tersebut samba memfiksasinya dengan Bunsen (lewatkan di
atas api 2-3 kali)
- Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna
(dapat digunakan methylene blue, safranin, Kristal violet) dan tunggu kurang
lebih 30 detik.
- Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tisu
- Periksa dengan mikroskop
-

29
 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

b. Pewarnaan negative
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan
pewarnaan negative. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai
lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam.
Cara kerja :
- Ambil dua objek glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu
objek glass
- Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu
dicampurkan
- Tempelkan sisi objek glass yang lain kemudian gesekkan kesamping kiri
- Biarkan preparat mongering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan diatas api.

2. Pewarnaan diferensial
a. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram bertingkat adalah suatu cara kerja pewarnaan yang paling berguna
dilakukan dalam bakteriologi. Dengan menggunakan cara kerja ini maka bakteri dapat
digolongkan menjadi dua golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negative.
Pewarnaan ini mula-mula dikembangkan oleh ahli histologi bernama Christian Gram
(1884) dan kemudian disempurnakan oleh ahli-ahli lainya.
Perbedaan reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang
tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma dan bakteri yang tergolong bakteri tahan
asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia.
Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial
(berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak
permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai
oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau gram.
Sel – sel bakteri mempunyai muatan yang agak negative bila pH lingkungannya
mendekati netral. Muatan negative dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif
dari ion zat warna misalnya methylene blue, sehingga hasilnya tersebut akan berwarna.
Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna
dengan sel bakteri.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan lipid dari dinding sel organisme gram negatif
dengan pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran

30
 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan
peptidoglikannya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri.
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau
multilayer.
- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat didalam
- Lapisan kaku, tidak mengandung asam tekoat.
- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
- Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
- Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
- Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
- Peka terhadap streptomisin
- Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
- Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan
ada yang sebagai lapisan tunggal.
- Mengandung asam tekoat.
- Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
- Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
- Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
- Tidak peka terhadap streptomisin
- Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Pewarnaan gram membutuhkan empat macam larutan yang berbeda, yaitu warna dasar,
mordan, zat warna penutup dan zat warna peluntur.
Cara kerja :
- Buatlah preparat ulas bakteri
- Berikan zat warna Kristal violet dan biarkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan
akuades, kering anginkan
- Beri grams iodin selama 30 detik
- Dengan cepat siran dengan aseton alcohol (decolorize), kemudian bilas dengan
akuades

31
 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

- Genangi slide dengan larutan safranin (zat warna tandingan)selama 1 menit, bilas
dengan akuades dan keringkan dengan tissue.
Sel-sel bakteri yang bersifat gram positif adalah bakteri yang mengikat zat warna dasar
(utama) dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh zat peluntur dan tidak dapat
diwarnai lagi oleh zat warna tandingan. Pada pengamatan mikroskopis, sel bakteri gram
positif berwarna biru ungu (violet).
Bakteri gram negative adalah bakteri yang daya pengikatan zat warna dasarnya tidak
kuat, sehingga dapat dilunturkan dan dapat diwarnai kembali oleh zat warna tandingan.
Pada pengamatan mikroskopis, sel bakteri gram negative akan tampak berwarna merah.
Disamping kedua jenis bakteri diatas ada juga bakteri yang bersifat gram variable.
Bakteri-bakteri ini mempunyai sifat intermedier antara gram positif dengan gram
negative. Bakteri ini kadang bersifat gram positif, kadang bersifat gram negative.

Hasil
Tahap Perlakuan
Gram + Gram -
Pewarnaan Awal Kristal violet Warna ungu Ungu
Mordan Iodin Warna ungu Ungu
Decoloriza Alcohol 95% ungu Tidak berwarna
Zat warna tandingan safranin Ungu Merah

Gambar : Teknik Pewarnaan Gram

(Sumber : aleschemistry.blogspot.com)

b. Pewarnaan tahan asam

Prinsip dasar pewarnaan asam adalah :

32
 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

a. Pewarnaan tahan asam atau disebut juga pewarnaan ziehl Neelsen merupakan
teknik pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai bakteri golongan
Mycrobacterium ( M. tuberculosis/ M. leprae ) dan Actinomycetes.
b. Penetrasi zat warna merupakan mekanisme masuknya zat warna ke dalam
dinding sel atau membrane sel, yang disebut juga sebagai difusi zat.
c. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam memiliki sifat impermeable
terhadap zat pewarna atau bahan kimia lainnya karena susunan dinding selnya
yang terdiri dari lemak dengan arabinogalaktan dan peptidiglogikan di
bawahnya.
d. Pewarnaan dengan pemanasan pada dinding sel bakteri bertujuan untuk
memuaikan dinding sel sehingga zat pewarna dapat masuk, pada pemanasan ini
tidak terlalu panas karena akan menyebabkan dinding sel bakteri rusak
Pewarnaan tahan asam merupakan pewarnaan bertingkat yang mengukur ketahanan
dari sel yang telah diwarnai terhadap dekolorisasi oleh asam. Pewarnaan ini meliputi
pewarnaan dengan carbol fuchsin panas, dekolorisasi dengan larutan alcohol dan
pemberian zat warna tandingan.
Cara kerja :
- Gelas objek dibersihkan dengan alcohol, kemudian panaskan
- Ambil akuades secara aseptic dan letakkan diatas gelas objek
- Ambil secara aseptic satu ose biakan letakkan di atas gelas objek
- Kering anginkan kemudian fiksasi dengan panas
- Berikan carbol fuchsin selama 5 – 10 menit. Jangan biarkan preparat mongering
selama pewarnaan
- Cuci dengan air mengalir
- Lunturkan kembali dengan alcohol
- Cuci kembali dengan air mengalir
- Tambahkan larutan metilen blue selama 30 detik (tanpa pemanasan)
- Cuci dengan air dan kering anginkan
- Periksa dibawah mikroskop. Bakteri yang bersifat tahan asam akan tampak berwarna
merah, sedangkan yang tidak taha asam akan berwarna biru.
3. Pewarnaan khusus
a. Pewarnaan Endospora
Endospora diproduksi oleh spesies dari Bacillus dan Clostridium. Berbeda dengan sel
vegetative yang memproduksinya, endospore ini mempunyai hidup dalam kondisi
lingkungan yang jelek, seperti suhu yang tinggi atau adanya bahan kimia yang
beracun. Endospore akan mempertahankan dan bila telah diwarnai tidak dapat
luntur oleh zat peluntur dan zat warna tandingan.
Salah satu pewarnaan endospore adalah dengan menggunakan malachite green
panas sebagai zat warna yang intensif dan tidak dapat dihilangkan dari endospore
dengan pencucian dan menggunakan safranin sebagai zat warna tandingan.

33
 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Endospore akan berwarna hijau, tetatpi sisa bagian sel yang tidak mengandung
endospore akan berwarna merah terang.
Cara kerja :
- Siapkan preparat Bacillus cereus
- Kering anginkan dan fiksasi dengan panas
- Letakkan gelas objek diatas ras yang terletak diatas air mendidih
- Lapisi preparat dengan secarik kertas kecil, biarkan dijenuhkan dengan malachite
green 5% dan lanjutkan pemanasan hingga 5 menit
- Cuci hati-hati dengan air
- Tambahkan safranin selama 30 detik
- Periksa dibawah mikroskop dengan minyak imersi
- Gambarkan hasil pengamatan.
b. Pewarnaan Kapsul
1. Secara Welch
Banyak bakteri dilapisi dengan suatu lapisan yang bervariasi ketebalannya. Lapisan
ini disebut kapsul dan pewarnaannya kurang jelas dibandingkan dengan sel
Cara kerja ;
- Bersihkan gelas objek dengan alcohol, kemudian lewatkan diatas api
- Ambil 5 atau 6 ose dari biakan bakteri dan letakkan di atas gelas objek
- Tutup dengan asam asetat glasia, biarkan selama tidak lebih dari 10 detik
- Cuci asam tersebut dengan meneteskan carbol fuchsin dan biarkan zat warnanya
mengalir
- Cuci carbol fuchsin dengan laruta garam fisiologis. Sel yang diwarnai akan
berwarna merah gelap, sedangkan kapsul berwarna merah pucat
- Letakkan gelas penutup tipis pada preparat basah tersebut dan periksa di bawah
mikroskop
- Gambarkan kapsul yang teramati.
2. Secara Anthony
- Jika menggunakan biakan susu, sebarkan satu ose di atas gelas onjek dan biarkan
mongering di udara. Jika digunakan biakan cair atau agar, letakkan setetes serum
pada gelas objek, suspensikan biakannya di dalam serum tadi, sebarkan menjadi
lapisan yang tipis dan biarkan mengering di udara
- Warnai selama 2 menit dengan larutan Kristal violet cair 1% (jangan dipanaskan)
- Cuci dengan larutan CuSO4 20%
- Keringkan dan periksa dibawah mikroskop. Kapsul akan berwarna biru ungi
sedangkan selnya berwarna biru gelap.
- Gambarkan kapsul yang terlihat.

34