Analisis cara kerja

Secara alami mikroorganisme di alam ditemukan dalam populasi campuran, hanya

dalam keadaan tertentu saja populasi ini ditemukan dalam keadaan murni. Hal ini
berarti bahwa harus diperoleh biakan murni yang hanya mengandung satu macam
mikroorganisme. Isolasi mikroba adalah memisahkan mikroba satu dengan mikroba
lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Mengisolasi mikroba dengan cara
menumbuhkan (menanam ) dalam medium padat. Hal ini karena dalam medium
padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni yang tetap pada tempatnya.

Beratus spesies mikroba menguasai tubuh manusia, alam sekitar baik tanah, air
maupun udara dihuni oleh kumpulan mikroorganisme. Penelitian yang layak
mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk
memisahkan populasi campuran bakteri. Pemisahan populasi bakteri campuran ini
menjadi spesies yang berbeda-beda disebut biakan murni. Biakan murni ini berawa
dari satu populasi sel yang berasal dari satu sel induk.

Biakan murni merupakan suatu kultur yang terdiri dari satu macam mikroorganisme.
Teknik pengenceran suspensi bakteri dari sampel atau sumber isolate dari lingkungan
dilakukan sebagai upaya untuk mendapatkan kuantitas bakteri dalam jumlah yang
dapat terhitung. Sebelum mulai membiakan mikroba, pertama-tama kita harus
mempertimbangkan bagaimana cara menghindari kontaminan. Mikroba terdapat
dimana-mana, tersebar di udara atau pada permukaan suatu benda, oleh karena itu
kita harus melakukan sterilisasi media, yang biasa dilakukan dengan pemanasan. Hal
ini perlu dilakukan untuk menghilangkan mikroba kontaminan. Maka semua bahan
dan alat yang bersentuhan dengan suatu biakan murni harus steril. Teknik yang
digunakan dalam pencegahan kontaminasi selama membuat dan mensterilkan
medium kultur disebut teknik aseptik. Penguasaan teknik ini diperlukan dalam
keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu
metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi pemula.
Teknik biakan murni (cara menyendirikan bateri murni). Di alam bebas tidak ada
mikroba yang hidup tersendiri dan terlepas dari spesies yang lain. Dalam teknik
biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi
juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar.

Untuk membuat biakan murni harus disiapkan media yang mengandung bahan dan
kondisi yang sesuai untu pertumbuan spesies tersebut. Dalam melakukan praktikum
kai ini kami menggunakan media padatan dan semi padat. Media padatan yang kami
gunakan , yaitu media CCA (Chromogenic Coliform Agar ) dan media TSIA (Triple
Sugar Iron Agar) sedangkan media semi cair yang kami gunakan adalah media SIM
(Sulfide Indole Moility). Dalam melakukan pembuatan biakan murni teknik
pembuatan medianya pun berbeda. Berikut ini teknik yang digunakan dalam
pembuatan agar biakan murni.

1. Media Agar Datar

Media agar datar adalah media agar yang dibiarkan memadat dalam plate. Salah
satu contohnya adalah Chromocul Coliform Agar (CCA) adalah suatu media
selektif yang mengandung dua kromogenik substrat untuk mendeteksi bakteri
Total coliform dan bakteri Escherichia coli. Substrat kromogenik yang berada
didalam media ini adalah β-glukuronidasi substrat (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl- β
-D-glucoronide) yang dikenal sebagai X-GLUC atau BCIG khusus untuk bakteri
Escherichia coli dan substrat (6-chloro-3-indoxyl- β-D-galactoside) yang diketahui
sebagai Salmon GAL. (Turner,2000).
Bakteri Escherichia Coli adalah β–glukuronidasi dan β –galaktosidasi maka
akan menunjukkan warna biru gelap koloni ungu pada media CCA (Turner, 2000).
Proses terbentuknya warna biru gelap keunguan disebabkan karena β-galaktosidasi
yang memotong substrat Salmon-GAL pada media CCA menjadi senyawa
kromogenik ditambah dengan β–glukuronidasi yang memotong substrat
XGlukuronidasi menghasilkan substrat X dan Substrat Glukoronidasi sehingga
 muncul warna biru gelap keunguan pada media CCA. Pada biakan murni
pembuatan media ini digunakan untuk mencari koloni tunggal yang ditanamkan
pada media CCA dengan metode sebar.
2. Media Agar Miring
Media agar miring adalah media agar padat dalam tabung reaksi yang diletakkan
miring dengan tujuan mempunyai permukaan media yang lebih luas daripada
permukaan agar tegak. Media yang menggunakan teknik ini adalah media TSIA.
Media TSIA adalah media diferensial dengan indicator pH yang dapat
membedakan mikroorganisme berdasarkan kemampuannya dalam memecah
karbohidrat spesifik dengan atau tanpa menghasilkan gas. Dengan menggunakan
media ini, bakteri dapat dibedakan menjadi mikroba non fermenter, fermenter
glukosa, atau fermenter glukosa dan laktosa yang ditandai dengan perubahan
warna pada media menjadi kuning. Media TSIA ini terdiri dari dua bagian yaitu
daerah lereng (slant) dan daerah dasar (butt). Uji positif media ini ditunjukkan
dengan perubahan warna menjadi kuning. Jika perubahan warna terjadi hanya
pada bagian dasar media, maka mikroorganisme yang diinokulasikan hanya
mampu memfermentasi glukosa. Sedangkan ketika goresan pada daerah lereng dan
dasar berubah warna menjadi kuning maka mikroorganisme yang diinokulasikan
mampu memfermentasi ketiga jenis gula pada media ini.
Selain itu, media ini digunakan untuk menunjukkan kemampuan bakteri dalam
memfermentasi H2 dan CO2 yang menghasilkan gelembung pada media yang dapat
dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai
dengan adanya endapan berwarna hitam, endapan ini terbentuk karena bakteri
mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H2S,
dan H2S akan bereaksi dengan Fe+ yang terdapat pada media dan menghasilkan
endapan hitam TSIA mengandung karbohidrat berupa glukosa, sukrosa, dan
laktosa, fenol merah sebagai indicator pH, serta natrium tiosulfat. Media Agar
Tegak
3. Media Agar Tegak
 Tabung yang berisi agar dibiarkan tegak hingga beku. Agar tegak ini digunakan
untuk membiakkan bakteri dengan cara menusukkan ujung jarum yang di
dalamnya terdapat inoculum dan dimasukkan ke dalam media. Salah satu contoh
media agar tegak, yaitu media SIM (Sulfide Indole Motility). Media SIM
bentuknya semisolid yang digunakan untuk mengetahui produksi H2S, indol dan
motilitas atau pergerakan suatu bakteri. Produksi indol dapat diketahui dengan
meneteskan 1-3 tetes reagen kovacs atau Erlich ke dalam biakan bakteri. Hasil
positif indol akan ditandai warna merah pada permukaan biakan. Untuk
mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan asam amino menjadi sulfur
seperti lisin dan metionin positif apabila H2S bereaksi dengan garam-garam logam
berat yang ditandai dengan terbentuknya logam sulfit yang berwarna hitam. Selain
itu, uji SIM ini dapat menunjukkan kemampuan pergerakan (motilitas) dari bakteri
yang ditandai dengan keruhnya media. Kandungan NA semisolid dalam media
SIM memungkinkan bakteri yang memiliki flagella seperti E. Coli melakukan
pergerakan dalam media tersebut.
Berikut ini langkah-langkah dalam membuat biakan murni.
A. Pembuatan media
1. Pembuatan media CCA (Chromocul Coliform Agar)
Untuk membuat media ini kami menimbang 9,835 gram stock media CCA
lalu kami larutkan ke dalam 350 ml akuades. Untuk melarutkan media ini
diperlukan bantuan hotplate dan magnetic stirrer dengan suhu pemanasan
50◦C dan kecepatan pengadukan 30 rd agar nutrisi yang terdapat pada media
tidak rusak. Sebelum melarutkan media di atas hotplate kami menutup mulut
Erlenmeyer menggunakan kapas dan alluminium foil untuk mencegah
penguapan dan kontaminasi dari bakteri sehingga media yang dihasilkan
dalam keadan yang steril. Setelah larut media kami autoklaf pada suhu 121◦C
lalu kami diginkan pada suhu kamar. Media dipindahkan ke 4 buah cawan
petri hingga menutupi permukaan cawan petri. Proses penuangan media
dilakukan dekat dengan api Bunsen dengan tutup cawan tidak dibuka penuh
 untuk mencegah kontaminasi. Selanjutnya media kami simpan di dalam
lemari pendingin dalam posisi terbalik.
2. Pembuatan Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Untuk membuat media ini kami menimbang 3 gram stock media TSIA lalu
kami larutkan ke dalam 100 ml akuades. Untuk melarutkan media ini
diperlukan bantuan hotplate dan magnetic stirrer dengan suhu pemanasan
50◦C dan kecepatan pengadukan 30 rd agar nutrisi yang terdapat pada media
tidak rusak. Sebelum melarutkan media di atas hotplate kami menutup mulut
Erlenmeyer menggunakan kapas dan alluminium foil untuk mencegah
penguapan dan kontaminasi dari bakteri sehingga media yang dihasilkan
dalam keadan yang steril. Setelah larut media kami autoklaf pada suhu 121◦C
lalu kami diginkan pada suhu kamar. Media dipindahkan sebanyak 10 ml
kedalam 2 buah tabung reaksi dengan bantuan pipet lalu dibiarkan memadat
dalam posisi miring. Tabung reaksi digunakan untuk mempermudah
pengamatan kesempurnaan hasil fermentasi karbohidrat dari mikroorganisme
dengan adanya lereng dan dasar pada media ini. Posisi miring digunakan
untuk memperluas permukaan untuk tumbuhnya mikroorganisme. Proses
penuangan media dilakukan dekat dengan api Bunsen untuk mencegah
kontaminasi. Selanjutnya media kami simpan di dalam lemari pendingin
dalam posisi tegak dengan rak tabung reaksi.
3. Pembuatan Media SIM
Untuk membuat media ini kami menimbang 6,5 gram stock media SIM lalu
kami larutkan ke dalam 100 ml akuades. Untuk melarutkan media ini
diperlukan bantuan hotplate dan magnetic stirrer dengan suhu pemanasan
50◦C dan kecepatan pengadukan 30 rd agar nutrisi yang terdapat pada media
tidak rusak. Sebelum melarutkan media di atas hotplate kami menutup mulut
Erlenmeyer menggunakan kapas dan alluminium foil untuk mencegah
penguapan dan kontaminasi dari bakteri sehingga media yang dihasilkan
dalam keadan yang steril. Setelah larut media kami autoklaf pada suhu 121◦C
lalu kami diginkan pada suhu kamar. Media dipindahkan sebanyak 10 ml ke
 dalam 10 tabung reaksi lalu dibiarkan memadat dalam posisi tegak. Proses
penuangan media dilakukan dekat dengan api Bunsen dengan tutup cawan
tidak dibuka penuh untuk mencegah kontaminasi. Selanjutnya media kami
simpan di dalam lemari pendingin dalam posisi tegak dengan rak tabung
reaksi.
B. Sterilisasi Alat
Dalam melakukan praktikum bakteriologi praktikan harus bekerja secara
aseptis. Sebelum melakukan praktikum meja kerja harus didisinfeksi
menggunakan alkohol 70%. Peralatan yang digunakan juga harus di sterilisasi.
Sebelum mensterilisasi alat, semua alat-alat dibungkus menggunakan kertas buram
hingga semua bagiannya tertutup dengan rapi. Kemudian di lakukan proses
sterilisasi baik menggunakan oven maupun autoklaf pada suhu 121◦C.
C. Prosedur Inokulasi Mikroorganisme
1. Inokulasi Mikroorganisme pada Media CCA
Inokulasi pada media CCA dilakukan dengan metode sebar. Sampel yang
digunakan berupa bikan bakteri E. coli. Sampel yang tumbuh pada media
tersebut selanjutnya diinokulasikan pada media CCA dengan metode sebar
atau teknik spread plate adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menghapuskan stok kultur
bakteri di atas media agar yang telah memadat. Kelebihan teknik ini adalah
mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan
agar. Cara melakukannya yaitu dengan menggoreskan satu ose inokulum
diletakkan di pinggir medium agar CCA yang telah memadat , dalam cawan
petri, dan dengan menggunakan ose yang steril, inokulum itu disebarkan di
permukaan medium dengan 4 kuadran penyebaran. Dimulai dari goresan
sangat rapat, rapat, agak rapat, dan longgar. Kemudian diinkubasi pada suhu
37◦C selama 24-48 jam lalu amati koloni yang tumbuh. Koloni bakteri E.Coli
yang tumbuh akan berwarna ungu. Dari ungu muda hingga ungu tua. Berikut
contoh pembentukan kuadran goresan ose pada metode sebar.
 Gambar: kuadran penggoresan metode sebar
2. Inokulasi Mikroorganisme pada Media TSIA
Untuk melakukan inokulasi mikroorganisme pada media ini pertama-tama
fiksasi ose agar terhindar dari kontaminan. Tabung reaksi yang berisi media
dilidah apikan dengan melewatkan sekilas melalui api.Isolat bakteri pada
kuadran keempat yang terdiri dari koloni tunggal diambil dari stok sebanyak 1
ose kemudian diinokulasikan kedalam medium TSIA yang mengandung
laktosa, sukrosa, dan glukosa dengan cara ditusukkan kedalam medium
tersebut hingga mencapai
bagian tegak/dasar (butt) atau mencapai ¾ bagian tabung. Selanjutnya diambil
1 ose biakan dan ditusukkan tegak lurus media lalu di keluarkan perlahan
sambil mengerakkan ose secara zig zag. Diinkubasi pada temperatur 37◦C
selama 2x 24 jam dan diamati perubahan warna yang terjadi.
3. Inokulasi Mikroorganisme pada Media SIM
Untuk melakukan inokulasi mikroorganisme pada media ini pertama-tama
fiksasi ose agar terhindar dari kontaminan. Tabung reaksi yang berisi media
dilidah apikan dengan melewatkan sekilas melalui api. Untuk melakukan
inokulasi pada media ini digunakan ose tusuk untuk mempermudah inokulasi
mikroorganisme, mencegah rusaknya media, dan membuat hasil inokulasi
lebih baik dan jelas. Ambil isolate bakteri dalam bentuk koloni tunggal
diambil menggunakan ose. Ose ditusuk sampai dasar lalu tutup kembali
 dengan kapas. Diinkubasi pada temperatur 37◦C selama 2x 24 jam dan
diamati perubahan yang terjadi.
D. Pengamatan
1. Pengamatan pada Media CCA
Pada media CCA yang diamati adalah bentuk koloni bakteri yang dihasilkan
pada setiap kuadran. Karena dalam praktikum ini isolate bakteri yang
digunakan adalah E. coli maka koloniyang dihasilkan akan berwarna ungu.
Dimana kuadran pertama akan menghasilkan koloni bakteri yang sangat rapat,
kuadran kedua menghasilkan koloni yang rapat, kuadran ketiga menghasilkan
koloni yang jarang, dan pada kuadran keempat koloni yang dihasilkan sangat
jarang. Koloni pada kuadran empat inilah yang selanjutnya akan
diinokulasikan pada media TSIA dan SIM.
2. Pengamatan pada Media TSIA
Pengamatan media ini dilakukan pada bagian kemiringan dan kedalaman
untuk menunjukkan sifat alkali dan asam. Perubahan warna medium menjadi
kuning pada bagian dasar menandakan bahwa mikroorganisme hanya mampu
memfermentasi satu gula saja, yaitu glukoasa sedangkan apabila perubahan
warna terjadi baik di dasar maupun lereng dari media maka mikroorganisme
mampu memfermentasi ketiga jenis gula (glukosa, sukrosa, dan laktosa),
warna hitam menandakan terbentuknya H2S dan jika medium terangkat
(terbentuk gelembung) menandakan bahwa mikroba tersebut mampu
menghasilkan gas.
3. Pengamatan pada Media SIM
Produksi indol dapat diketahui dengan meneteskan 1-3 tetes reagen kovacs
atau Erlich ke dalam biakan bakteri. Hasil positif indol akan ditandai warna
merah muda pada permukaan biakan. Untuk mengetahui kemampuan bakteri
dalam menguraikan asam amino menjadi sulfur seperti lisin dan metionin
positif apabila H2S bereaksi dengan garam-garam logam berat yang ditandai
dengan terbentuknya logam sulfit yang berwarna hitam. Selain itu, uji SIM ini
dapat menunjukkan kemampuan pergerakan (motilitas) dari bakteri yang
 ditandai dengan keruhnya media. Kandungan NA semisolid dalam media SIM
memungkinkan bakteri yang memiliki flagella seperti E. Coli melakukan
pergerakan dalam media tersebut.
E. Hal-Hal yang Perlu Diperhatikan

1. Dalam melakukan praktikum uji Biakan Murni ingatlah dalam memberikan

label pada setiap tabung reaksi sesuai dengan jenis media dan jumlah sampel
yang akan dipipet. Pelabelan berungsi untuk menghindari kesalahan
pemeriksaan karena tertukarnya sampel.
2. Dalam melakukan penanaman sampel pada media usahakan agar pipet yang
digunakan tidak menyentuh media karena ditakutkan dapat membawa
kontaminan sehingga media menjadi tidak steril. Untuk menghomogenkan
media dengan sampel dilakukan dengan mengocok atau menggoyang-
goyangkan tabung reaksi.
3. Tetap bekerja secara aseptis. Desinfeksi media kerja sebelum melakukan
penanaman. Bekerjalah selalu dekat dengan api Bunsen. Jangan sesekali
bekerja tanpa api Bunsen karena dikhawatirkan media akan lebih banyak
berisi kontaminan.
4. Jangan sesekali menaruh kapas penutup tabung reaksi di meja kerja. Jepitlah
kapas dengan jari-jari agar tidak terkontaminasi mikroorganisme lain.
5. Tidak memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga
pengenceran kurang optimal.
6. Penggunaan inoculum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel
ketika digores