LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Disusun Oleh:
Kelompok 9
Annisa Fitriyah 1906287686
Farah Fathiyah 1906347400
Fatya Zirwatin 1906287805
Hervee Novelda 1906287843
Putri Widyaningsih 1906347413

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS INDONESIA
2020
Praktikum : Pewarnaan Bakteri
Hari, tanggal Praktikum : Selasa, 10 November 2020
Waktu : 08.00 - 09.50 WIB
Tempat : Youtube dan Microsoft Teams

I. PENDAHULUAN
Bakteri memiliki struktur, sifat, dan bentuk yang bermacam-macam. Pada
umumnya, sel bakteri memiliki panjang 2 – 8 mikron dan diameter 0,2 – 2 mikron. Struktur
sel bakteri tersusun atas struktur eksternal, dinding, dan struktur internal. Sedangkan
bentuk bakteri beragam, ada yang berbentuk spiral, kokus atau bulat, dan spiral. Untuk
mengamati bentuk dan struktur bakteri, sel bakteri perlu mengalami pewarnaan untuk dapat
dilihat dengan jelas. Zat warna terikat dengan protoplasma bakteri secara kimia. Zat warna
yang digunakan biasanya berbentuk garam dan dibagi menjadi zat warna basa dan zat
warna asam. Pada zat warna basa, kation berfungsi sebagai pewarna, sedangkan pada zat
warna asam, yang berfungsi sebagai pewarna adalah anionnya. Terdapat beberapa metode
pewarnaan pada bakteri, yaitu pewarnaan sederhana, diferensial, Gram, negatif, dan
khusus.
Pada percobaan ini, metode pewarnaan yang dilakukan adalah pewarnaan Gram.
Nama pewarnaan Gram diambil dari nama penemunya, yaitu Hans Christian Gram,
seorang dokter berkebangsaan Denmark. Pada tahun 1884, Hans Christian Gram membuat
zat warna khusus yang sangat penting dalam bidang bakteriologi. Metode ini menjadikan
lapisan peptidoglikan pada dinding bakteri sebagai faktor yang menentukan suatu bakteri
dimasukkan ke dalam kategori bakteri Gram positif atau Gram negatif. Pada bakteri Gram
positif, bakteri memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan kuat mengikat zat warna
kristal ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif, lapisan peptidoglikan yang dimiliki
oleh bakteri tipis dan memiliki lapisan lipid yang tebal sehingga pori-pori dinding sel dapat
terbuka lebar. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu pada akhir pewarnaan Gram
karena dapat mengikat zat warna kristal ungu dan bakteri Gram negatif akan berwarna
merah pada pewarnaan Gram karena akan mengikat zat warna Fuchsin yang ditambahkan
di akhir pewarnaan setelah zat warna kristal ungu terlepas. Pewarnaan Gram termasuk
dalam metode pewarnaan sederhana karena hanya menggunakan pewarna tunggal.
 Gambar. Struktur Bakteri Gram Positif (Maksum, 2010)

Gambar. Struktur Bakteri Gram Negatif (Maksum, 2010)

II. PRINSIP DAN TUJUAN

2.1 Prinsip
Dinding sel bakteri tersusun dari asam nukleat yang mengandung gugus fosfat
bermuatan negatif. Gugus fosfat tersebut dapat mengikat zat warna basa yang bermuatan
positif. Zat warna asam tidak dapat mewarnai sel bakteri dan dipergunakan untuk mewarnai
latar belakangnya. Zat-zat warna umum digunakan untuk mempelajari morfologi bakteri.
Zat warna terikat dengan protoplasma bakteri secara kimia dan zat warna yang
dipergunakan berbentuk garam. Zat warna basa mengandung kation pewarna dan anion
bukan pewarna, sedangkan zat pewarna asam mengandung kation bukan pewarna dan
anion pewarna.
Bakteri Gram-Positif memilik lapisan peptidoglikan lebih tebal (kurang lebih 30
lapisan) dibandingkan dengan bakteri Gram-negatif (hanya 1-2 lapisan). Perbedaan warna
bakteri Gram-positif dan Gram-negatif berkaitan dengan permeabilitas dinding sel yang
 didasarkan pada ketebalan lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Pada bakteri Gram-
positif permeabilitas dinding sel bakteri kurang dan kompleks ungu kristal iodium tidak
dapat keluar dari dinding sel, sehingga bakteri Gram-positif berwarna ungu. Sebaliknya,
pada bakteri Gram-negatif permeabilitas dinding sel bakteri Gram-negatif lebih besar dan
memungkinkan keluarnya kompleks ungu kristal iodium dari dinding sel.
Menurut teori Salton, bakteri Gram-positif memberikan warna ungu karena pada
saat pencucian dengan alkohol 96% menyebabkan protein pada dinding sel mengalami
denaturasi sehingga pori-pori mengecil dan kompleks ungu kristal iodium tetap terjerat
pada dinding sel, sedangkan bakteri Gram-negatif tidak berwarna karena dinding selnya
mengandung sekitar 20% kadar lipid yang tinggi yang dapat larut pada tahap pencucian
sediaan dengan alkohol 96% akibatnya pori-pori pada dinding sel membesar dan zat warna
yang sudah diserap oleh sel akan dilepaskan kembali.
2.2. Tujuan Praktikum
1. Untuk mengamati dan mengidentifikasi morfologi bakteri dengan metode pewarnaan.
2. Untuk mengetahui tahap-tahap dan cara teknik pewarnaan Gram
3. Untuk membedakan bakteri yang termasuk golongan gram posif atau golongan gram
negatif.

III. ALAT DAN BAHAN

Alat Gambar Kegunaan
Batang ose Mengambil bakteri

Rak tabung reaksi Tempat meletakkan tabung

reaksi yang berisi bakteri
Baskom berisi air Tempat menampung sisa
zat warna bakteri setelah
dibilas dengan aquades

Jembatan Tempat meletakkan kaca

objek saat pewarnaan
bakteri

Kaca objek Tempat meletakkan

bakteri

Spiritus Mensterilkan batang ose

dan kaca objek.
Korek api Menyalakan spiritus

Tissue Membersihkan meja

praktikum dari cairan yang
tertumpah, alas memegang
kaca preparat yang telah
disterilisasi oleh spiritus

Pensil kaca Membuat pola lingkaran

pada kaca objek

Pinset Menjepit kaca objek

Mikroskop Mengamati hasil

pewarnaan bakteri
 Bahan Gambar Kegunaan
Bacillus subtilis Objek pengamatan

Biakan cair Objek pengamatan

Larutan NaCl 0,9% Medium pengencer

Botol semprot berisi aquades Membilas preparat dari zat

pewarna kristal violet dan
fuchsin.
Alkohol 96% Membilas preparat dari zat
pewarna lugol

Botol semprot berisi alkohol Mensterilkan meja kerja

70%

Fuchsin Pewarna bakteri

Kristal violet Pewarna bakteri

Lugol Pewarna bakteri

Minyak immersi Memperjelas objek saat

diamati di mikroskop
IV. PROSEDUR KERJA
No Prosedur Kerja Gambar
1. Menyiapkan alat dan bahan

2. Membuat preparat sampel

• Mensterilkan gelas objek dengan memanaskannya
pada api.

• Membuat batas bulatan pada gelas objek dengan

pensil.

• Pada medium padat, pembuatan preparat sampel

dengan pembuatan suspensi, dengan cara
memanaskan kawat OC dan memanaskan leher
tabung NaCl, kemudian meneteskan NaCl 0,9%
pada gelas objek yang steril.
• Memanaskan kawat OC kembali dan mengambil
biakan bakteri yang akan diuji (Bacillus subtilis)

• Menaruh biakan bakteri pada gelas objek dan

mencampurkan dengan larutan NaCl 0,9%

• Sedangkan pada medium cair, dapat langsung

memanaskan kawat OC dan mengambil biakan
bakteri yang akan diuji (Escherichia coli) kemudian
meletakannya diatas gelas objek
 • Mengeringkan gelas objek dengan cara melewatkan
gelas objek diatas api (fiksasi)

3. Meneteskan larutan Kristal Violet pada gelas objek

sampai bagian bakteri tertutupi seluruhnya, kemudian
mendiamkan selama 5 menit

4. Mencuci gelas objek dengan air menggunakan botol

semprot

5. Meneteskan larutan Lugol pada gelas objek sampai

seluruh bagian bakteri tertutupi, kemudian mendiamkan
selama 60 detik

6. Mencuci kembali gelas objek dengan air menggunakan

botol semprot

7. Mencuci kembali gelas objek dengan cara mencelupkan

dalam bejana berisi alkohol 96% dan menggoyang-
goyangkan selama 30 detik atau sampai zat warna pada
gelas objek bersih

8. Membilas gelas objek dengan air menggunakan botol

semprot

9. Meneteskan larutan Fuchsin pada gelas objek sampai

seluruh bagian bakteri tertutupi, kemudian mendiamkan
selama 2 menit
10. Mencuci kembali gelas objek dengan air menggunakan
botol semprot

11. Mengeringkan gelas objek menggunakan tisu

12. Menaruh gelas objek pada meja mikroskop dan

menambahkan minyak immerse pada gelas objek

13. Memeriksa bakteri dibawah mikroskop dengan

perbesaran 100x

V. HASIL PENGAMATAN
Gambar hasil pengamatan Keterangan
Melalui hasil disamping dapat dilihat bahwa
hasil dari pewarnaan gram menunjukkan hasil
akhir berwarna keunguan dan terlihat
morfologi bakteri berbentuk seperti batang.
Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus subtilis
merupakan bakteri Gram positif.

Bacillus subtilis
 Melalui hasil disamping dapat dilihat bahwa
hasil dari pewarnaan gram menunjukkan hasil
akhir berwarna kemerahan dan terlihat
morfologi bakteri berbentuk seperti batang.
Hal ini menunjukkan bahwa Escherichia coli
merupakan bakteri Gram negatif.

Escherichia coli (biakan cair)

VI. PEMBAHASAN
Praktikum pewarnaan gram ini bertujuan untuk mengetahui dan membedakan jenis bakteri,
yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif serta untuk menidentifikasi morfologi bakteri.
Hal pertama yang harus dilakukan yaitu menyiapkan alat dan bahan. Setelah itu, melakukan
preparasi sampel menggunakan kaca preparat yang dikeringkan dengan beberapa kali dilewatkan
pada api spiritus untuk menghilangakan lemak yang ada dan memudahkan dalam peggambaran
batas oval pada kaca preparat. Kemudian, kaca preparat dibersihkan menggunakan tisu dan
digambarkan bentuk oval pada permukannya. Setelah itu, kawat ose dipijarkan di atas api spiritus
sampai berwarna kemerahan. Lalu, kawat ose yang sudah panas dimasukkan secara perlahan ke
dalam tabung reaksi berisi NaCl 0,9%, ambil sebanyak tiga sengkelit, dan disebarluaskan pada
kaca preparat sesuai bulatan oval yang telah dibuat. Kemudian, sterilkan kawat ose kembali dengan
memijarkannya di atas api lalu ambil Bacillus subtilis pada tabung reaksi yang sudah disiapkan
dengan cara menempelkan kawat ose secara perlahan-lahan. Setelah itu, letakkan pada kaca
preparat dan disebarluaskan. Kemudian, kaca preparat yang telah mengandung bakteri dikeringkan
dengan dilewatkan di atas pijaran api lalu diletakkan kembali di atas jembatan yang letaknya di
atas wadah baskom.
Tahap selanjutnya yaitu pewarnaan sampel bakteri menggunakan larutan uji dengan
munggunakan larutan kristal violet, larutan lugol, alkohol, dan larutan fuchsin. Pertama, teteskan
larutan kristal violet hingga semua bagian oval tertupi, diamkan selama 5 menit. Kemudian, sisa
larutan ditumpahkan pada baskom dan cuci kaca preparat dengan dibilaskan dengan botol semprot
berisi aquadest. Setelah itu, teteskan larutan lugol hingga menutupi batas oval kaca praparat,
diamkan 1 menit. Kemudian, tuangkan sisa cairan lugol ke dalam baskom dan bilas kaca preparat
menggunakan aquadest. Preparat yang sudah dicuci dicelupkan ke dalam alkohol 96% lalu
digoyangkan untuk menghilangkan sisa warna. Setelah itu, preparat diletakkan di atas jembatan
besi kembali lalu teteskan larutan fuchsin hingga semua batas oval tertutupi lalu diamkan selama
2 menit dan cuci kembali menggunakan botol semprot berisi aquadest. Keringkan kaca preparat
hingga kering sepenuhnya menggunakan tisu, teteskan minyak imersi pada kaca preparat
kemudian amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. Amati hasilnya. Setelah itu,
ulangi perlakuan seperti di atas menggunakan bakteri uji Escherichia coli.
Apabila hasil pengamatan menunjukkan warna keunguan menandakan bahwa bakteri
tersebut merupakan bakteri Gram positif sebab dinding selnya sebagian besar tersusun atas
peptidoglikan yang mampu mengikat warna dasar dari larutan kristal violet dan tidak rusak jika
dilakukan pencucian menggunakan alkohol. Alhasil, warna yang teramati tetap berwarna ungu
sesuai larutan uji yang pertama kali digunakan yakni kristal violet. Sementara itu, sampel bakteri
tergolong dalam bakteri Gram negative apabila hasil pengamatan dari uji pewarnaan bakteri
menunjukkan warna merah. Hal ini terjadi karena dinding sel bakteri Gram negatif sebagian besar
tersusun atas lipid yang dapat rusak bila dicuci dengan alkohol sehingga bakteri ini akan
menampakkan warna kedua yaitu merah dari hasil pentetesan oleh larutan fuchsin.
Setelah dilakukan pengamatan, hasil pewarnaan Gram bakteri dari bakteri Bacillus subtilis
menunjukkan morfologi dari bakteri yang berbentuk batang (bacillus) serta warna keunguan yang
menandakan bahwa bakteri ini merupakan bakteri Gram positif sebab dinding selnya sebagian
besar tersusun atas peptidoglikan yang mampu mengikat warna dasar dari larutan kristal violet dan
tidak rusak jika dilakukan pencucian menggunakan alkohol. Alhasil, warna yang teramati tetap
berwarna ungu sesuai larutan uji yang pertama kali digunakan yakni kristal violet.
Sementara itu, pada pengamatan uji pewarnaan Gram bakteri pada Escherichia coli
menunjukkan menunjukkan morfologi dari bakteri yang berbentuk batang (bacillus) serta warna
kemerahan yang menandakan bahwa bakteri ini merupakan bakteri Gram negatif. Hal ini dapat
terjadi karena karena dinding sel bakteri Gram negatif sebagian besar tersusun atas lipid yang dapat
rusak bila dicuci dengan alkohol sehingga bakteri ini akan menampakkan warna kedua yaitu merah
dari hasil pentetesan oleh larutan fuchsin.

VII. KESIMPULAN
Praktikum pewarnaan bakteri bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengklasifikasikan
bakteri. Berdasarkan hasil percobaan pewarnaan bakteri, bakteri terbagi menjadi 2 kelompok yaitu
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan dari kedua bakteri ini bisa dilihat dari
perbedaan ketebalan lapisan peptidoglikan pada dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki
lapisan peptidoglikan yang tebal, hal ini menyebabkan warna dari kristal violet yang diberikan
pada bakteri tetap bertahan dan menghasilkan warna ungu saat diamati dengan mikroskop.
Sedangkan untuk bakteri gram negatif, lapisan peptidoglikan pada dinding selnya tipis sehingga
warna dari kristal ungu akan memudar saat dibilas oleh lugol dan warna yang bertahan adalah
warna merah dari larutan fuschin sehingga saat diamati di bawah mikroskop bakteri gram negatif
akan berwarna merah. Pada praktikum ini, bakteri yang diamati adalah Bacillus subtilis dan
Escherichia coli. Berdasarkan hasil pengamatan dengan mikroskop, bakteri ini termasuk bakteri
gram positif karna warna yang muncul adalah warna biru keunguan. Sedangkan hasil pengujian
pada bakteri Escherichia coli menunjukan bahwa bakteri ini termasuk bakteri gram negatif karena
warna yang muncul adalah warnanya merah.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Radji, M. 2009. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran.
Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Tim Penyusun. (2018). Penuntun Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Praktikum
Mikrobiologi Farmasi. Depok : Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.