LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

Pewarnaan Gram

Rabu / 17 Februari 2021

Nama : Muh.Ali

NIM : PO714203191.021

Kelompok : A2

LABORATORIUM BAKTERIOLOGI
ANALIS KESEHATAN POLKESMAS
PRODI D4 TLM
2021

Nilai TTD

PEWARNAAN GRAM
I. TUJUAN
Untuk menentukan gram positif dan gram negatif.

II. PRINSIP
Kuman gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding
sel oleh pencucian dengan alcohol, protein menjadi keras dan
beku, pori – pori mengecil sehingga kompleks ungu Kristal
iodium dipertahankan dan sel tetap ungu. Sedangkan kuman
gram negatif melarutkan zat lipid selama pencucian dengan
alcohol, pori –pori pada dinding sel membesar sehingga zat
warna yang sudah diserap mudah dilepas, kemudian
mengambil zat warna merah dari fuchsin.

III. TEORI DASAR

Pewarnaan gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri
menjadi 2 yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Pada pewarnaan gram ini, reagen yang digunakan ada 4 jenis,
yaitu Kristal violet, iodine, alkohol, dan safranin. Bakteri gram
positif akan mempertahankan warna ungu dari Kristal violet
sehingga ketika diamati mikroskop akan menunjukkan warna
ungu sedangkan bakteri gram negative tidak dapat
mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna
safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga akan
memperlihatkan warna merah (Pratita, 2012).

Pewarnaan gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel

bakteri serta untuk membedakan bakteri gram positif dan gram
negatif. Perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram
negative menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur
dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri gram
positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan
peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram negatif
memiliki struktur dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi
(Fitri, 2011).

Pengecatan gram dilakukan pada kultur bakteri umur 24 jam

yang ditumbuhkan pada medium pdat. Bakteri gram positif akan
memberikan warna ungu ketika diberi cat gram. Warna ungu
tersebut terjadi karena dinding sel bakteri mengikat cat Kristal
violet yang diperlukan oleh iodine dan Kristal violet tersebut
tidak akan hilang pada waktu diberi cat peluntur sehingga tidak
terpengaruh pada saat diberi cat penutup yang berwarna merah
(Romadhon, 2012).

Pewarnaan dilakukan dengan membuat bekasan isolate

digelas objek, kemudian diwarnai dengan larutan Kristal violet
dan yodium secara bergantian selama beberapa menit dan
dicuci dengan aquadest, selanjutnya dicuci dengan alcohol dan
ditetesi dengan larutan cat penutup safranin. Pengamatan
dilakukan dengan menggunakan mikroskop, bakteri gram positif
akan Nampak berwarna ungu, sedangkan gram negatif
berwarna merah (Purwohadisantoso, 2009).

Metode pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui

morfologi dari bakteri, serta membedakan bakteri gram positif
dengan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif akan berwarna
ungu, jika dilihat dari mikroskop itu karena bakteri gram positif
dapat menahan kompleks pewarna primer karbol gention violet
iodium sampai akhir prosedur pewarnaan. Bakteri gram negatif
akan berwarna merah jika dilihat di bawah mikroskop, itu karena
 bakteri gram negatif kehilangan kompleks warna dengan proses
pembilasan alcohol, kemudian yang terwarnai oleh pewarna
tandingan air fuksin (Cappucino, 1987).

IV. ALAT DAN BAHAN

Alat : Bahan :
- Objek glass - Sampel kotoran gigi
- Lampu spirtus - Carbol gention violet
- Korek api - Lugol
- Bak pewarna - Alkohol 95 %
- Mikroskop - Safranin
- Cotton bud - Oil imersi
- Pipet tetes - Tissue

V. PROSEDUR KERJA
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Mensterilkan objek glass dengan cara dicuci dengan
menggunakan detergen dan air mengalir. Kemudian
keringkan dengan tissue
3. Mengambil sampel kotoran gigi dengan menggunakan
cotton bud
4. Membuat sediaan diatas objek glass dengan cara memutar
membentuk pola lingkaran dari arah dalam keluar. Kemudian
keringkan
5. Memfiksasi sediaan objek glass dengan cara dilewatkan
diatas api bunsen sebanyak 3 kali
 6. Melakukan proses pewarnaan gram dengan cara sediaan
digenangi menggunakan zat warna carbol gention violet
selama 2 – 3 menit
7. Membilas objek glass dengan air
8. Meneteskan larutan logol ke sediaan objek glass dan
diamkan selama 45 – 60 detik
9. Membilas objek glass dengan menggunakan alkohol 95 %
selama 30 detik
10. Meneteskan safranin ke sediaan objek glass dan diamkan
selama 2 menit
11. Membilas objek glass dengan air. Kemudian keringkan di
udara
12. Memberikan oil imersi pada objek glass yang akan diamati
13. Melihat dan mengamati objek glass dengan mikroskop
perbesaran 10 x 100

VI. HASIL PENGAMATAN

Bakteri yang teramati yaitu

terdapat warna merah yang
mendominasi (bakteri gram
negatif) dan sedikit biru keunguan
(bakteri gram positif). Bentuk
bakteri basil.

VII. Pembahasan

Pada praktikum pewarnaan gram ini dilakukan pada sampel

kotoran gigi. Pewarnaan gram digunakan berbagai macam
reagen atau pewarna seperti carbol gention violet, lugol, dan
safranin. Penambahan carbol gention violet diteteskan pada
objek glass yang telah dibuat sediaan dan didiamkan selama 2
– 3 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat
sempurna pada dinding sel bakteri. Lalu, penambahan lugol
( iodin + KI ) yang merupakan larutan mordan dan didiamkan
selama 45 – 60 detik bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat. Selanjutnya, diteteskan
alkohol 95 % kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu,
objek glass dibilas dengan air mengalir hingga warnanya hilang.
Alkohol 95 % berfungsi untuk membilas kelebihan zat warna
pada sel bakteri. Kemudian, diteteskan safranin dan didiamkan
selama 2 menit.

Pembilasan reagen atau pewarna yang berganti dari satu

pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan
disebabkan karena zat – zat warna tersebut dapat berikatan
dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat.
Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke
yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri
berlangsung cepat. Bakteri gram positif akan mempertahankan
zat warna carbol gention violet (ungu gelap) setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tersusun atas
liposakarida (lipid) yang tipis sehingga pada saat dicuci dengan
alkohol 95 %. Zat warna carbol gention violet akan luntur dan
akan menyerap kembali warna merah safranin yang diberikan.

Bakteri pada sampel kotoran gigi adalah dominan bakteri

gram negatif dan sedikit bakteri gram positif. Hal ini
menyebabkan warna biru keunguan dan merah muncul
bersamaan mungkin dikarenakan kurangnya pembilasan
dengan air. Warna merah yang muncul menandakan bakteri
gram negatif karena hilangnya pewarna carbol gention violet
pada waktu dekolarisasi dengan alkohol kemudian sel bakteri
 menyerap safranin. Pemberian alkohol berfungsi untuk
dekolarisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam
sel muncul.

VIII. KESIMPULAN

Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan

bahwa bakteri gram positif akan menyerap zat warna induk
sehingga akan berwarna ungu/biru sedangkan bakteri gram
negatif menyerap zat warna tandingan sehingga berwarna
merah.

IX. DAFTAR PUSTAKA

Cappucino, JG. & Sherman, N. 1987. Microbiology: A

Laboratory Manual. California: The Benjamin/Cummings
Publishing Company. Inc

Fitri, L., Yekki., 2011, Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni

Bakteri Kitinolitik. Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Vol. 3, No. 2

Pratita, Maria Yuli E., Surya Rosa P., 2012, Isolasi dan
Identifikasi Bakteri Termofilik Dari Sumber Mata Air Panas Di
Songgoriti Setelah Dua Hari Inkubasi, Jurnal Teknik Pomits,
Vol.1, No. 1

Purwohadisantoso, Kristian, Elok Z., Ella S., 2009, Isolasi

Bakteri Asam Laktat Dari Sayur Kubis Yang Memiliki
Kemampuan Penghambatan Bakteri Patogen, Jurnal Teknologi
Pertanian, Vol.10, No.1

Romadhon, Subagiyo, Sebastian M., 2012, Isolasi dan

Karaterisasi Bakteri Asam Laktat dari Usus Udang Penghasil
Bakteriosin Sebagai Agen Antibakteria Produk – Produk Hasil
Perikanan, Jurnal Saintek Perikanan, Vol. 8, No. 1