LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

Pewarnaan Gram

Hari /Tanggal Praktikum : Kamis/4 Maret 2021

Nama : Dira Maharani

NIM : PO714203191.013
Kelompok : A1

LABORATORIUM BAKTERIOLOGI
ANALIS KESEHATAN POLKESMAS
PRODI SARJANA TERAPAN TLM
2021

Nilai TTD
 PEWARNAAN GRAM

I. TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan membedakan
bakteri gram positif dan gram negatif yang terdapat pada sampel
kotoran gigi.

II. PRINSIP
Pewarnaan didasarkan pada Kemampuan dinding sel bakteri
terhadap zat warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian dengan
alcohol 96%. Bakteri gram positif akan mengalami denaturasi protein
pada dinding sel oleh pencucian dengan alkohol, protein menjadi
keras dan beku. pori-pori mengecil sehingga kompleks ungu kristal
violet-iodium dipertahankan dan sel tetap berwarna ungu.
Sedangkan bakteri gram negatif melarutkan zat lipid selama
pencucian dengan alkohol, pori-pori pada dinding sel membesar
sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepas, kemudian
mengambil zat warna merah dari safranin.

III. TEORI DASAR

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua klompok
besar, yaitu gram positif dan gram negatif. Berdasarkan sifat kimia
dan sifat fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama
berdasarkan penemunya Ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumococcus dan bakteri klebsiella
pneumoniae (Karmana, 2008).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat asam dan
basa. Pada zat warna basa yang bagian yang berperan dalam
memberikan warna disebut kromofor dan bermuatan positif.
Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan dalam
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa
lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di
dinding sel, membran sel dan sifat plasma. Sewaktu proses
pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berikatan
dengan muatan negatif di dalam sel sehingga mikroorganisme lebih
jelas terlihat (Dwidjoseputro, 2005).
Prinsip Pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel
terhadap zat warna dasar (kristal violet), setelah pencucian alkohol
96%. Bakteri gram positif terlihat berwarna ungu karena dinding
selnya mengikat kristal violet lebih kuat sedangkan sel gram negatif
mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar
dan kristal violetb mudah larut pada saat pencucian alkohol (Fardiaz,
1989).
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif
dan gram negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta
safranin atau kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah
Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus. Sedangkan bakteri
gram negatif contohnya Eschericia coli. Beberapa bakteri tidak
terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium sp.
karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga
digunakan pewarnaan tahan asam untuk identifikasinya (James,
2008).
Pewarnaan gram menggunakan 4 jenis reagen, yaitu kristal
violet, iodin/lugol, alkohol dan safranin. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga ketika
diamati pada mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan
bakteri gram negatif tidak dapat mempertahankan warna ungu dari
kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding sel
sehingga akan memperlihatkan warna merah (Pratita, 2012)
IV. ALAT DAN BAHAN
Alat
1) Object glass
2) Mikroskop
3) Pipet tetes
4) Bak pewarnaan
5) Lampu spiritus
6) Korek api

Bahan
1) Safranin
2) Carbol gentian violet
3) Lugol
4) Alkohol 95%
5) Oil imersi
6) Cotton bud
7) Sampel kotoran gigi
8) Aquadest
9) Tissue

V. PROSEDUR KERJA
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Menuliskan identitas pada obeject glass
3. Mengambil sampel kotoran gigi dengan menggunakan cotton
bud, kemudian dibuat sediaan di atas object glass dengan
memutar dari arah dalam hingga keluar sampai terbentuk
sediaan yang baik (lonjong).
4. Sediaan dikeringkan kemudian difiksasi di atas nyala api spiritus
dengan cara bagian bawah object glass dilewatkan dari depan
ke belakang 2-3 kali
 5. Sediaan yang telah difiksasi diletakkan pada bak pewarnaan
6. Menggenangi preparat dengan pewarna carbol gentian violet
selama 2-3 menit
7. Sisa cat dibuang kemudian ditambahkan lugol selama 45-60
detik
8. Menetesi sediaan dengan alkohol 95% selama 30 detik
9. Membilas dengan air mengalir hingga tidak da zat warna yang
menetes
10. Menggenangi dengan larutan safranin selama 2 menit
11. Membilas preparat dengan air mengalir hingga tidak ada zat
warna yang menetes
12. Preparat kemudian dikeringkan dengan udara
13. Setelah preparat kering, ditambahkan oil imersi sebanyak 1 tetes
di atas permukaan sediaan yang telah diwarnai
14. Melakukan pengamatan pada mikroskop dengan menggunakan
pembesaran objektif 100x.

VI. HASIL PENGAMATAN

Coccus

Diplococcus

Ditemukan bakteri gram positif berbentuk coccus

Keterangan
Susunan : coccus dan diplococcus
 Warna : Ungu
Sifat : Gram positif

VII. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan gram untuk
mengatahui sifat gram bakteri agar dapat dibedakan bakteri gram
positif dan negatif. Sampel yang digunakan berasal dari kotoran gigi.
Reagen yang digunakan terdiri atas 4 jenis yang meliputi carbol
gentian violet, lugol, alkohol 96%, dan safranin.
Carbol gentian violet merupakan cat pewarna utama (primer)
yang akan mewarnai bakteri gram positif sehingga berwarna ungu.
Pewarna ini bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. carbol gentian violet yang
digenangi selama 2-3 menitt bertujuan agar cat atau pewarna dapat
melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Penambahan lugol
bertujuan sebagai larutan mordan, yaitu pewarna yang yang
berfungsi untuk menfiksasi pewarna primer yang dapat diserap
mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna
oleh bakteri. Kompleks zat lugol akan terperangkap anatara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. Adapun alkohol
96% berfungsi sebagai pemucat/peluntur (dekolorisasi). Pemberian
alkohol dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu
mikroorganisme akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak
berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan
terekstraksinya lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding
sel. Sedangkan safranin sebagai pewarna tandingan berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama
setelah perlakuan pencucian dengan alkohol 96%. Safranin akan
memberikan warna merah pada bakteri gram negatif.
 Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan dengan
menggunakan mikroskop pembesaran objektif 100x dengan bantuan
oil imersi ditemukan bakteri gram positif dengan susunan/bentuk
coccus dan diplococcus yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena
bakteri gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding
selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan
beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal violet yang
berwarna ungu dipertahankan menyebabkan bakteri tetap berwarna
ungu. Terjadinya ikatan warna oleh bakteri didasarkan pada struktur
dinding sel yang tebal sehingga dapat melawan dekolorisasi dan
mempertahankan warna ungu dari zat warna utama yaitu carbol
gentian violet.

VIII. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan dapat
disimpulkan bahwa pada pewarnaan gram ditemukan bakteri gram
positif berbentuk coccus dan diplococcus dengan warna ungu.

IX. DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang:
Djambatan.
Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat antar
Universitas Pangan dan Gizi. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
James, J. 2002. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Jakarta:
Erlangga.
Karmana, O. 2008. Biologi. Jakarta: PT Grafindo Media Pratama.
Pratita, M.Y.E. & Putra, S.R. 2012. Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Termofilik dari Sumber Mata Air Panas di Songgoriti Setelah
Dua Hari Inkubasi. Jurnal Teknik Pomits. 1(1): 1-5.