LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAA BAKTERI

Dosen Pembimbing
Fatia Rizki Nuraini, M.Si
Dibuat oleh :
Fadilla Arzika Khumaida ( 21114120002 )

DIII TEKNOLOGI BANK DARAH

STIKES RAJEKWESI BOJONEGORO
2021/2022
A. TUJUAN
Tujuan dari praktikum ini adalah melatih mahasiswa agar mampu melakukan pewarnaan
gram, serta melatih mahasiswa agar mampu mengidentifikasi bakteri gram positif dan
gram negatif.
B. DASAR TEORI
1. Mikroba
Mikroba adalah prokariot dengan dinding sel yang terdiri dari struktur khusus yang
disebut dengan peptidoglikan. Hampir semua sel prokariot mempunyai dinding sel
kecuali mikoplasma. Dinding ini umumnya memberi kekuatan pada sel. Dinding sel pada
bakteri tidak sekaku seperti peluru baja, tetapi tipis dan lentur seperti bungkus kulit bola
kaki (Darkuni, 2001). Dinding sel inilah yang akan dijadikan indikator dan penentu pada
pewarnaan gram.
2. Pewarnaan bakteri gram
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang digunakan. Pewarna sendiri merupakan
garam-garam yang tersusun atas ion positif dan ion negatif yang salah satunya berwarna
dan biasa disebut kromogen.
Perbedaan tebal tipisnya struktur peptidoglikan menentukan mekanisme yang
spesifik terhadap penyerapan zat warna. Sifat ini dipergunakan untuk membantu
identifikasi suatu bakteri, sehingga di kenal adanya bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif (Darkuni, 2001).
Teknik pewarnana gram pertama kali diuraikan dalam suatu publikasi pada tahun
1884 oleh seorang ahli baktreriologi Denmark, Christian Gram. Dia mengembangkan
prosedur pewarnaan ini selagi mencari suatu metode untuk memperlihatkan bakteri
pneumokokus pada jaringan paru-paru pasien yang mati karena pneumonia. Pewarnaan
Gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk
mencirikan banyak bakteri. Terutama amat berarti di laboratorium diagnostik rumah sakit
karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang diwarnai dengan
pewarnaan Gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan organisme penyebab suatu
infeksi (Pelczar dan Chan. 2005).
 Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan differensial yang membedakan bakteri
dalam dua kelompok yaitu bakteri Gram positif yang mengikat warna. Pada proses ini
olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan ungu kristal, yodium, alkohol
(bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Sifat
untuk diwarnai ungu tua atau tidak dengan metode pewarnaan yang diperkenalkan Gram
(1884) merupakan ciri taksonomi penting yang juga menunjukkan korelasi dengan sifat-
sifat lain dari bakteri. Menurut Hastuti (2012), prosedur pewarnaan gram dimulai dengan
mewarnai sel bakteri yang sudah difiksasi dengan pewarna basa kristal violet, kemudian
diteruskan dengan memperlakukan dengan iodium. Iodium dengan kristal violet
membentuk lak yang tidak larut air, tapi agak larut dalam alkohol atau aseton. Sel-sel ini
kemudian diberi alkohol atau dengan kata lain di diferensiasi. Sel-sel yang gram positif
akan mempertahankan kompleks iodium zat warna dan akan tetap berwarna biru,
sedangkan sel-sel gram negatif akan kehilangan warnanya oleh alkohol. Sel-sel yang
kehilangan warnanya ini kemudian diwarnai lagi dengan pewarna kontras (fukhsin) agar
nampak.
Pewarnaan gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative. Pada pewarnaan Gram ini, reagen yang
digunakan ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodine, alkohol/dekolorisasi dan safranin.
Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga
ketika diamati mikroskop akan menunjukkan warna ungu, sedangkan bakteri Gram
negative tidak dapat mempertahankan warna ungu dari kristal violet tetapi zat warna
safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga akan memperlihatkan warna merah.
(Pratita, 2012).
A. Bakteri Gram positif
Gram positif ini apabila dilakukan pewarnaan, maka akan terlihat berwarna ungu.
Pada bakteri gram positif, kompleks dari kristal violet yodium (KV-1) tetap
tertangkap dalam dinding sel setelah perlakuan dengan etanol. Hal ini disebabkan
oleh pori-pori pada lapisan peptidoglikan mengecil. Pengecilan pori-pori ini terjadi
karena rendahnya kandungan lipid pada dinding sel bakteri gram positif sehingga
pada saat penambahan alkohol terjadi dehidrasi. Dengan demikian violet yodium
tetap terikat dan sel berwarna ungu (Darkuni, 2001). Selain itu, pada bakteri gram
 positif juga ditemukan adanya senyawa Mg-ribonukleat yang akan bereaksi dengan
kristal violet sehingga zat warna ini tidak mudah dilarutkan oleh larutan pemucat.
B. Bakteri Gram negatif

Sel-sel gram negatif terlihat berwarna merah setelah dilakukan pewarnaan.

Berbeda dengan bakteri gram positif, pada bakteri gram negatif kandungan
peptidoglikannya lebih rendah, tetapi kandungan lipidnya tinggi. Kandungan lipid
yang cukup tinggi ini dapat menyebabkan pembesaran lubang pori-pori dan
meningkatkan permeabilitas zat warna pada saat pencucian. Pori-pori pada
peptidoglikan bakteri ini cukup besar sehingga setelah perlakuan dengan kompleks
violet yodium lepas (tidak terikat) dan sel akan mengikat zat warna kedua (Darkuni,
2001). Selain itu, dalam bakteri gram negatif ini juga tidak ditemukan adanya
senyawa Mg-ribonukleat yang dapat bereaksi dengan kristal violet. Akibatnya kristal
violet mudah larut oleh larutan pemucat.
Pewarnaan gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta
untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negative. Perbedaan warna pada
bakteri gram positif dan gram negatif menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur
dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri gram positif memiliki struktur
dinding sel dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram
negatif memiliki sturktur dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri,
2011).
Pengecatan gram dilakukan pada kultur bakteri umur 24 jam yang
ditumbuhkan pada medium padat. Bakteri gram positif akan memberikan warna ungu
ketika diberi cat gram. Warna ungu tersebut terjadi karena dinding sel bakteri
mengikat cat Kristal violet yang diperkuat oleh iodine dan Kristal violet tersebut tidak
akan hilang pada waktu diberi cat peluntur sehingga tidak terpengaruh pada saat
diberi cat penutup yang berwarna merah (Romadhon,2012).
Pewarnaan dilakukan dengan membuat bekasan isolate digelas objek,
kemudian diwarnai dengan larutan Kristal violet dan yodium secara bergantian
selama satu menit dan dicuci dengan aquadest, selanjutnya dicuci dengan
alkohol/dekolorisasi dan ditetesi dengan larutan cat penutup safranin. Pengamatan
 dilakukan dengan menggunakan mikroskop, bakteri gram positif akan Nampak
berwarna ungu, sedangkan gram negatif berwarna merah (Purwohadisantoso, 2009).

3. Bakteri Escherichia coli

Menurut pernyataan Jawetz (2005) Bakteri Escherichia coli memiliki bentuk
batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7 μm, lebar 0,4-0,7 μm.
pada pernyataan Karimela (2017) yaitu bakteri ini memiliki karakteristik fisiologis yaitu
Gram positif, berbentuk bulat, bergerombol, berdiameter 0,5µm - 1 µm dan non motil.
C. ALAT DAN BAHAN
1. Bunsen
2. Korek api
3. Gram stain kit (kristal violet, iodine, dekolorisasi, safranin)
4. Object glass
5. Cover glass
6. Alkohol
7. Aquadest
8. Handscoon
9. Mikroskop
10. Pipet tetes
11. Glass beker
12. Bakteri E-coli
13. Jarum ose
14. Bengkok medis
D. CARA KERJA

Pertama-tama siapkan alat dan bahan terlebih dahulu

Jika sudah, lewat-lewatkan objek glass dengan cara membolak balik di atas bunsen yang
menyala
 Lalu panaskan ujung jarum ose sampai memerah dan ambil sedikit bakteri E-coli
menggunakan jarum ose

Kemudian letakkan bakteri E-coli tersebut diatas objek glass dan diratakan menggunakan
jarum ose

Lalu panaskan lagi jarum ose diatas bunsen sampai ujung jarum ose memerah

Jika sudah matikan bunsen dan teteskan 1 tetes kristal violet pada objek glass
menggunakan pipet tetes sampai menutupi cetakan dan tunggu selama 1 menit

Setelah 1 menit bilas menggunakan aquadest

Pada tahap kedua teteskan 1 tetes iodin pada objek glass menggunakan pipet tetes sampai
menutupi cetakan dan tunggu selama 1 menit

Setelah 1 menit bilas menggunakan dekolorasi

Pada tahap ketiga teteskan 1 tetes safranin pada objek glass menggunakan pipet tetes
sampai menutupi cetakan dan tunggu selama 1 menit

Setelah 1 menit bilas menggunakan aquadest

Jika sudah, lap area yang bukan cetakan menggunakan tisu

Dan amati hasil menggunakan mikroskop

Merah : gram negatif
biru/ungu tua : gram positif
E. HASIL

Dari praktikum pewarnaan bakteri yang pertama, dilakukan

pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran
100x didapatkan hasil pewarnaan yang tidak jelas (kurang
merata saat mengoleskan bakteri pada objek glass), sehingga
pewarnaan bakteri tidak terlihat jelas.

Pada praktikum pewarnaan bakteri yang kedua dilakukan

pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran
100x didapatkan hasil pewarnaan yang kurang maksimal
dikarenakan kurang bersih pada saat pembilasan, sehingga
pewarnaan bakteri kurang terlihat jelas.

Berwarna merah : gram negatif

F. PEMBAHASAN
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang digunakan. Pewarna sendiri
merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positif dan ion negatif yang salah satunya
berwarna dan biasa disebut kromogen. Menurut Hastuti (2012), prosedur pewarnaan
gram dimulai dengan mewarnai sel bakteri yang sudah difiksasi dengan pewarna basa
kristal violet, kemudian diteruskan dengan memperlakukan dengan iodium. Iodium
 dengan kristal violet membentuk lak yang tidak larut air, tapi agak larut dalam alkohol
atau aseton. Sel-sel ini kemudian diberi alkohol atau dengan kata lain di diferensiasi. Sel-
sel yang gram positif akan mempertahankan kompleks iodium zat warna dan akan tetap
berwarna biru, sedangkan sel-sel gram negatif akan kehilangan warnanya oleh alkohol.
Sel-sel yang kehilangan warnanya ini kemudian diwarnai lagi dengan pewarna kontras
(fukhsin) agar nampak.
Pewarnaan gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative. Pada pewarnaan Gram ini, reagen yang
digunakan ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodine, alkohol/dekolorisasi dan safranin.
Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga
ketika diamati mikroskop akan menunjukkan warna ungu, sedangkan bakteri Gram
negative tidak dapat mempertahankan warna ungu dari kristal violet tetapi zat warna
safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga akan memperlihatkan warna merah.
(Pratita, 2012).
Pengecatan gram dilakukan pada kultur bakteri umur 24 jam yang ditumbuhkan
pada medium padat. Bakteri gram positif akan memberikan warna ungu ketika diberi cat
gram. Warna ungu tersebut terjadi karena dinding sel bakteri mengikat cat Kristal violet
yang diperkuat oleh iodine dan Kristal violet tersebut tidak akan hilang pada waktu diberi
cat peluntur sehingga tidak terpengaruh pada saat diberi cat penutup yang berwarna
merah (Romadhon,2012).
Pada praktikum pewarnaan bakteri ini yang digunakan untuk pengamatan
pewarnaan gram adalah bakteri Escherichia coli, pada pengamatan pewarnaan gram
menggunakan bakteri Escherichia coli yang pertama dilakukan terlihat bahwa bakteri
tersebut tidak jelas hasilnya, dikarenakan kurang merata pada saat mengoleskan bakteri
Escherichia coli pada objek glass. Pada pengamatan pewarnaan gram menggunakan
bakteri Escherichia coli yang kedua menunjukan warna merah yang berarti Escherichia
coli merupakan bakteri Gram negatif.
G. KESIMPULAN

Pewarnaan dilakukan dengan membuat bekasan isolate digelas objek, kemudian

diwarnai dengan larutan Kristal violet dan yodium secara bergantian selama satu menit
dan dicuci dengan aquadest, selanjutnya dicuci dengan alkohol/dekolorisasi dan ditetesi
 dengan larutan cat penutup safranin. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan
mikroskop, bakteri gram positif akan Nampak berwarna ungu, sedangkan gram negatif
berwarna merah (Purwohadisantoso, 2009). Dan setelah dilakukan pengamatan
menggunakan mikroskop terlihat hasil dari pewarnaa bakteri gram tersebut yaitu Gram
negatif. Sel-sel gram negatif terlihat berwarna merah setelah dilakukan pewarnaan. Pada
bakteri gram negatif kandungan peptidoglikannya lebih rendah, tetapi kandungan
lipidnya tinggi. Kandungan lipid yang cukup tinggi ini dapat menyebabkan pembesaran
lubang pori-pori dan meningkatkan permeabilitas zat warna pada saat pencucian. Pori-
pori pada peptidoglikan bakteri ini cukup besar sehingga setelah perlakuan dengan
kompleks violet yodium lepas (tidak terikat) dan sel akan mengikat zat warna kedua
(Darkuni, 2001). Selain itu, dalam bakteri gram negatif ini juga tidak ditemukan adanya
senyawa Mg-ribonukleat yang dapat bereaksi dengan kristal violet. Akibatnya kristal
violet mudah larut oleh larutan pemucat.
H. SARAN
Mahasiswa pada saat melakukan praktikum pewarnaan bakteri gram harus lebih
memperhatikan arahan dari Dosen sehingga pada saat praktikum tidak terjadi kesalahan
I. DAFTAR PUSTAKA

Darkuni, M. Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi, dan Mikologi). Malang:

Universitas Negeri Malang.
Pelczar, Michael J dan Chan, E.C.S. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:Universitas
Indonesia Press.
Hastuti, Utami Sri. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Malang: UMM Press.
Pratita, Maria Yuli E., Surya Rosa P., 2012 , Isolasi dan Identifikasi BakteriTermofilik
Dari Sumber Mata Air Panas Di Songgoriti Setelah Dua HariInkubasi, Jurnal
Teknik Pomits, Vol. 1, No. 1.
Purwohadisantoso, Kristian, Elok Z., Ella S., 2009, Isolasi Bakteri Asam LaktatDari
Sayur Kubis Yang Memiliki Kemampuan Penghambatan Bakteri Patogen, Jurnal
Teknologi Pertanian, Vol. 10, No. 1.
Romadhon, Subagiyo, Sebastian M., 2012, Isolasi dan Karaterisasi Bakteri Asam Laktat
dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin Sebagai Agen Anti bakteria Produk –
Produk Hasil Perikanan, Jurnal Saintek Perikanan, Vol. 8, No.1.
 Jawetz, Melnick, Adelberg (2005). Medical microbiology. 23th Edition. USA: Mc Graw
Hill Company.
Karimela, E. J., Ijong, F. G., and Dien, H. A. 2017. Characteristics of Staphylococcus
aureus Isolated Smoked Fish Pinekuhe from Traditionally Processed from
Sangihe District. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia, 20(1): 188.

J. LAMPIRAN DOKUMENTASI

Bakteri yang sudah di warnai

menggunakan Gram stain kit (kristal
violet, iodine, dekolorisasi, safranin)
dan akan dilakukan pengamatan
menggunakan mikroskop.