NAMA : Banyu Alam Purnama

NIM : 1207020011
LAPORAN PRAKTIKUM PEWARNAAN BAKTERI

A. PENDAHULUAN
a. Waktu Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan dengan metode studi literatur yang dilaksanakan
pada hari Rabu tanggal 5 Mei 2021 pukul 12.30 - 13.45 WIB. Tempat pelaksanaan
di rumah pribadi Jl. KH Usman Dhomiri No 59, Kecamatan Cimahi Tengah, Kota
Cimahi.
b. Tujuan
1. Mahasiswa mampu mempelajari bentuk struktur (morfologi) bakteri dengan
jelas dengan aplikasi teknik pewarnaan sel dan mikroskop
2. Mahasiswa mempunyai kemampuan mengidentifikasi bakteri melalui teknik
pewarnaan
3. Mahasiswa mengetahui sifat-sifat bakteri terhadap suatu jenis pewarnaan
c. Dasar Teori
Mikrobiologi adalah studi tentang organisme hidup mikroskopis. Dunia
mikroba terdiri dari lima jenis organisme: bakteri, protozoa, virus, serta mikroalga
dan jamur. Di bidang mikrobiologi, kita telah mempelajari banyak aspek
mikroorganisme ini (disebut juga mikroorganisme atau protista yang ada,
karakteristiknya, kekerabatan antara satu sama lain dengan kelompok biologis
lainnya, pengendaliannya, dan pengaruhnya terhadap kesehatan dan Peranan kita
dalam kesejahteraan- makhluk). Hal ini erat kaitannya dengan kehidupan kita, ada
yang berhubungan dengan pembuangan sampah, ada yang bermanfaat, dan ada yang
merugikan (Michael J. Pelczar, 2008).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteru baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000x atau lebih (Waluyo, 2004). Pewarnaan bateri untuk
memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk
bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteru seperti dinding sel
dan vakuola, menghasilakn sifat-sifat fisik dan kimia yang khas dari bakteri dengan
zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu
pengecetan diferensial dan pengecetan structural. (Michael J. Pelczar, 2008).
 Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan gram terbagi dua golongan,
yaitu: Gram positif, bila warna zat pewarna pertama (Karbol gential violet) tetap
bertahan, dengan demikian warna bakteri tampak ungu tua; dan Gram negative, bila
warna zat pewarna pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna
tandingannya, missal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat lainnya (Razali, 1987).
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yitu Gram positif dan Gram
negative ialah setelah diberi zat pewarna berhubungan dengan struktur dan
komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan anatara kedua golongan, di mana
dinding sel bakteri gram negative pada umumnya lebih tipis dibandingkan bakteri
gram positif. Perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri yaitu pada
bakteri Gram negative kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga
kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada bakteri Gram positif. Pori-poti
dalam peptidoglikan bakteri Gram negative tetap masih cukup besar untuk dapat
disari keluar kompleks karbol gential violet dan lugol. Selanjutnya apabila sel-sel
Gram positif diperlakukan dengan lisozimuntuk menyingkirkan dinding selnya. Sisa
strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan terlihat oleh karbol
gential violet dan lugol. Tetapu sel ini mudah dihapus oleh alkohol. Menunjukan
bahwa struktur sel bakteri Gram positif yang menjadi tempat melekatna zat pewarna
pertama karbol gential violet. (Razali, 1987).
B. METODE
a. Alat dan Bahan
Alat
- Pc
Bahan
- Video Youtube
- Internet
- Materi Pewarnaan

b. Prosedur Kerja

Disiapkan Pc dengan internet yang stabil

Materi pengenalan dibuka dan dibaca

Video youtube diakses dan perhatikan dengan seksama

Dibuat laporan dari kedua materi tersebut

C. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari video yang telah diakses mengenai pewarnaan, didapat beberapa metode yang
dapat dilakukan. Pewarnaan Gram adalah prosedur pewarnaan diferensial yang dapat
membedakan jenis bakteri berdasarkan reakasi yang timbul pada struktur dinding sel
selama prosedur pewarnaan.
Teknik pewarnaan Gram dimulai dari pengambilan spesimen, kemudian
dilanjutkan dengan persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan slide di
bawah mikroskop. Bakteri Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal (20-
80 nm), sehingga akan mengambil kompleks stain-mordant primer dan akan tampak
biru atau ungu di bawah mikroskop. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki
lapisan peptidoglikan yang tipis (1-3 nm) dan persentase ikatan silang yang rendah
diikuti dengan lapisan membran luar yang tipis (7-8 nm), sehingga tidak mengikat
kompleks stain-mordant dan akan tampak merah di bawah mikroskop (Rita B. Moyes,
2009).
Pada video youtube pertama di mana dengan judul pewarnaan negaif dari kultur
murni, dengan prinsip mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap (tidak
mewarnai bakteri). Adapun alat dan bahan yang digunakan adalah: jarum ose, Bunsen,
mikroskop, objek glass, medium kultur murni bakteri, dan nigrosin. Langkah dan hasil
dari metode ini sebagai berikut:
No Prosedur Gambar
1 Teteskan nigrosine pada salah satu sisi objek
glasss

2 Pijarkan jarum ose di atas api bunsen

3 Diambil bakteri dari kultur murni menggunakan

jarum ose
 4 Bakteri yang sudah diambil lalu suspensikan
pada objek glass

5 Letakkan objek glass membentuk sudut 450

terhadap objek glass yang mengandung
suspense bakteri. Dorong objek glass hingga
suspensi pewarna menyebar.
6 Keringkan diudara (tidak dipanaskan) lalu beri
minyak imersi

7 Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran

1000x

Sumber: https://youtu.be/e8T_PlCeOAo

Dari hasil metode pewarnaan Gram dengan pewarnaan latar belakang menjadi
hitam dan tidak mewarnai bakteri didapat hasil pada perbesaran 1000x bakteri terlihat
jelas berbentuk batang bewarna putih. Pewarnaan Negatif; pewarnaan ini bertujuan
untuk mengetahui morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarnaan sederhana.
Merode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya. Metode
ini dilakukan dengan cara mencampur mikroorganisme dengan setetes tinta cina,
kemudian disebarkan pada kaca objek. Dengan metode ini maka mikroorganisme atau
badan sel yang diamati menjadi transparan diantara medan yang gelap. Hal ini terjadi
karena pewarna tersebut tidak menembuis organisme. Pada metode ini bakteri tidak
dapat diidentifikasi apakah bakteri tersebut Gram positif atau Gram negative sebab tidak
adanya warna yang menunjukan hal tersebut. Di mana apabila bakteri tersebut termasuk
Gram positif maka bakteri akan bewarna ungu dan apabila bakteri Gram negative maka
akan bewarna merah. Metode ini cocok untuk melihat bakteri dengan jelas tanpa
mengetahui termasuk Gram positive atau Gram negative.
 Berbeda pada video youtube kedua menggunakan metode diferensial adapun alat
dan bahan yang digunakan sebagi berikut: Bunsen, pewarna kristal violet, aquadest,
pewarna safrani, lugol, etanol 96%, pipet, objek glass, penjepit tabung, jrum ose,
mikroskop, korek api, tissue, dan kultur bakteri (E. coli dan B. subtilis). Langkah dan
hasil metode ini sebagai berikut:

No Prosedur Gambar
1 Bersihkan meja kerja menggunakan alkohol
70%

2 Nyalakan Bunsen menggunakan korek api

3 Bersihkan objek glass menggunakan tissue,

lalu beri label dengan bakteri yang akan
dipakai

4 Teteskan aqudest pada kedua objek glass

5 Pijarkan jarum ose diatas api Bunsen.

6 Inokulasi kultur bakteri dengan mengambil

sedikit bakteri (E. coli dan B. subtilis)
7 Oleskan pada objek glass yang berisi aquadest
secara perlahan.

8 Lakukan fiksasi terhadap kedua objek glass di

atas api

9 Setelah kering, teteskan pewarna kristal violet

pada kedua objek glass. Diamkan selama 1
menit

10 Bilas menggunakan aqudest

11 Lalu teteskan lugol kedua objek glass dan

tunggu selama 1 menit kembali

12 Bilas dengan menggunakan etanol 96%

dengan perlahan

13 Teteskan kembali objek glass menggunakan

safranin dan tunggu kembali selama 1 menit

14 Bilas menggunakan aquadest, lalu keringkan

dan amati dibawah mikroskop
 15 Hasil dari bakteri (B. subtilis)

16 Hasil dari bakteri (E. coli)

Sumber: https://youtu.be/GaqCIwik7Fk
Dari hasil pengamatan video dengan menggunakan metode pewarnaan diferensial
didapat hasil bahwa bakteri B.subtilis berwarna ungu dan bakteri E. coli berwarna
merah. Pewarnaan diferensial merupakan metode pewarnaan yang membedakan macam
sel melalui perbedaan warna. Prosedur pewarnaan diferensial yang digunakan di dalam
pewarnaan bakteri adalah Pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram dikembangkan oleh
Christian Gram pada tahun 1884 dan dimodifikasi oleh Hucker pada tahun 1921.
Pewarnaan Gram memisahkan bakteri ke dalam dua kelompok Bakteri gram positif
yang mempertahankan zat warna utama (kristal violet) dan Bakteri gram negatif yang
menyerap warna dari counterstain/pewarna penutup (biasanya safranin O). (Setiawan,
2013).
Pewarnaaan Differensial; Bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat bakteri terhadap
suatu jenis pewarnaan dan untuk mengidentifikasi. Pewarnaan ini menggunakan lebih
daari satu pewarna. Contoh pewarnaan differensial dan bersifat pewarnaan khusus
adalah: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Spora, Pewarnaan Kapsul, dan lain-lain.
Perbedaan hasil dari pewarnaan ini disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel
antara kedua kelompok tersebut. Pewarna kristal violet pada awalnya diserap oleh kedua
kelompok tersebut. Langkah berikutnya, larutan lugol sebagai penguat, menstabilkan
kristal violet ke dalam lapisan peptidoglikan dinding sel. Lapisan peptidoglikan pada
dinding sel bakteri gram positif lebih tebal dibanding pada gram negatif. Pada bakteri
gram positif, peptidoglikan yang tebal terdapat pada bagian terluar menyelubungi
membran sitoplasma, sedangkan pada bakteri gram negatif lapisan peptidoglikan
dilapisi lagi oleh membran luar yang banyak mengandung lipida. Oleh karena itu,
pewarna kristal violet terkurung lebih banyak di dalam peptidoglikan bakteri gram
positif (Goldman, 2009)
 Gambar 1. 1 Diagram skematik dinding sel bakteri Gram positif (a) dan
bakteri Gram negatif (b)

Sumber (Madigan MT, 2012)

Pada video bakteri yang digunakan adalah bakteri E. coli dan B. subtilis. Bakteri
E. coli termasuk famili enteraceae. Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif
berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7 μm, lebar
0,4-0,7μm dan bersifat anaerob fakultatif. Tidak ditemukan spora, selnya bisa tunggal,
berpasangan, rantai pendek dan biasanya tidak berkapsul. E. coli membentuk koloni
yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Adelberg, 2008). Bakteri ini
tidak mempunyai nukleus, organel terbungkus membrane maupun sitoskeleton. E. coli
memiliki organel eksternal yakni pili yang merupakan filament tipi untuk menangkap
substrat spesifik dan flagel yang merupakan antifilamen tipis dan lebih Panjang untuk
berenang. Pembiakan bakteri E. coli bersifat aerob atau anaerob fakultatif, pertumbuhan
optimum pada suhu 370C (Hendrayati, 2012).
Bakteri B. subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram positif.
Sel dari bakteri Bacillus subtilis berbentuk batang dan lurus, Panjang tubuhnya 0,5-2,5
x 1,2-10 um. Sering tersusun berpasangan atau membentuk rantai, dengan membulat
atau berakhir melingkar. Termasuk bakteri Gram positif dan motil atau bergerak dengan
flagella. Endospora berbentuk oval atau sesuatu yang bulat atau silindris dan sangat
resisten pada kondisi yang merugikan atau tidak mendukung. Bakteri ini tersusun atas
peptidoglikan yang merupakan polimer dari gula dan asam amino. Peptidoglikan yang
ditemukan di bakteri disebut murein melapisi dinding selnya. Sel membentuk tembok
penghalang antara lingkungan, mempertahankan bentuk sel (Schaechter M., 2006)
 SOAL
1. Jelaskan prinsip kerja pada pewarnaan Gram!
2. Mengapa bakteri gram negative dan Gram positif memperlihatkan hasil warna yang
berbeda setelah diberikan perlakuan pewarnaan Gram ini?
3. Mengapa bakteri Gram positif tidak memperlihatkan warna merah setelah diberi
pewarnaan safranin?
4. Jelaskan morfologi dari masing-masing bakteri pada hasil praktikum kali ini

Jawab

1. Prinsip pewarnaan Gram

- Teknik perwarnaan Gram mampu membedakan bakteri menjadi dua kelompok
utama, yaitu Gram positif dan Gram negative.
- Kedua kelompok bakteri dibedakan berdasarkan pebedaan struktur membrane
dinding sel.
Bakteri Gram Positif Berwarna Ungu
- Bakteri Gram positif mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal
sehingga kuat mengikat pewarna primer berupa Kristal Violet, setelah diikuti
penambahan larutan mordant berupa lugols Iodine.
- Kristal Violet dan Lugols Iodine akan membentuk ikatan komplek dengan
peptidoglikan.
- Ketika sudah terbentuk ikatan komplek antara Kristal Violet dan Lugols Iodine,
pewarna akan sulit diluruhkan dengan larutan dokolirizer seperti alkohol asam.
Peptidoglikan akan tetap mengikat warna kristal violet dan meninggalkan warna
biru tua atau ungu.
- Ketika ditambah warna pembanding seperti Safranin, peptidoglikan masih
mempertahankan warna primer.
Bakteri Gram Negatif Berwarna Merah
- Bakteri Gram negatif tidak mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal
pada dinding sel nya.
- Saat diaplikasikannya pewarna Kristal Violet dan Lugols Iodine tidak dapat
membentuk ikatan kuat dengan peptidoglikan.
- Ikatan yang terbentuk antara pewarna dengan peptidoglikan secara mudah
diluruhkan atau terbilas oleh larutan dekolorizer
- Alkohol asam akan mendehidrasi dinding sel dan membentuk sebuah pori-pori
atau lubang pada membran sel, sehingga akan menghilangkan pewarna primer.
 - Pewarna pembanding berupa Safranin mewarnai ulang peptidoglikan yang tidak
mengikat lagi pewarna Kristal Violet, sehingga bakteri akan tampak berwarna
merah.
2. Perbedaan hasil dari pewarnaan ini disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel
antara kedua kelompok tersebut. Pewarna kristal violet pada awalnya diserap oleh kedua
kelompok tersebut. Langkah berikutnya, larutan lugol sebagai penguat, menstabilkan
kristal violet ke dalam lapisan peptidoglikan dinding sel. Lapisan peptidoglikan pada
dinding sel bakteri gram positif lebih tebal dibanding pada gram negatif. Pada bakteri
gram positif, peptidoglikan yang tebal terdapat pada bagian terluar menyelubungi
membran sitoplasma, sedangkan pada bakteri gram negatif lapisan peptidoglikan
dilapisi lagi oleh membran luar yang banyak mengandung lipida. Oleh karena itu,
pewarna kristal violet terkurung lebih banyak di dalam peptidoglikan bakteri gram
positif
3. Bakteri Gram positif mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga kuat
mengikat pewarna primer berupa Kristal Violet, setelah diikuti penambahan larutan
mordant berupa lugols Iodine.
4. Morfologi bakteri
- Bakteri E. coli
E.coli termasuk famili enteraceae. Escherichia coli merupakan bakteri Gram
negatif berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter
0,7 μm, lebar 0,4-0,7μm dan bersifat anaerob fakultatif. Tidak ditemukan spora,
selnya bisa tunggal, berpasangan, rantai pendek dan biasanya tidak berkapsul.
E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang
nyata (Adelberg, 2008). Bakteri ini tidak mempunyai nukleus, organel
terbungkus membrane maupun sitoskeleton. E. coli memiliki organel eksternal
yakni pili yang merupakan filament tipi untuk menangkap substrat spesifik dan
flagel yang merupakan antifilamen tipis dan lebih Panjang untuk berenang.
Pembiakan bakteri E. coli bersifat aerob atau anaerob fakultatif, pertumbuhan
optimum pada suhu 370C
- Bakteri B. subtilis
Bakteri B. subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram positif.
Sel dari bakteri Bacillus subtilis berbentuk batang dan lurus, Panjang tubuhnya
0,5-2,5 x 1,2-10 um. Sering tersusun berpasangan atau membentuk rantai,
dengan membulat atau berakhir melingkar. Termasuk bakteri Gram positif dan
motil atau bergerak dengan flagella. Endospora berbentuk oval atau sesuatu
yang bulat atau silindris dan sangat resisten pada kondisi yang merugikan atau
tidak mendukung. Bakteri ini tersusun atas peptidoglikan yang merupakan
polimer dari gula dan asam amino. Peptidoglikan yang ditemukan di bakteri
disebut murein melapisi dinding selnya. Sel membentuk tembok penghalang
antara lingkungan, mempertahankan bentuk sel
D. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Bakteri E.coli termasuk famili enteraceae. Escherichia coli merupakan bakteri Gram
negatif berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7
μm, lebar 0,4-0,7μm. Sedangkan Bakteri B. subtilis merupakan bakteri yang
berbentuk batang yang Gram positif. Sel dari bakteri Bacillus subtilis berbentuk
batang dan lurus, Panjang tubuhnya 0,5-2,5 x 1,2-10 µm
2. Berdasarkan teknik pewarnaan dapat diidentifikasi bahwa bakteri E. coli
menunjukan warna merah di mana dapat disimpulkan bakteri tersebut termasuk
bakteri Gram negative. Berbeda dengan bakteri B. subtilis , yang menunjukan warna
ungu, yang berarti termasuk bakteri Gram positive.
3. Sifat-sifat bakteri dapat diketahui dengan menggunakan jenis pewarnaan di mana
bakteri yang menunjukan warna akhir ungu termasuk bakteri Gram Positif yang
memiliki lapisan peptidoglikan tebal. Sedangkan bakteri yang menunjukan warna
akhir merah termasuk bakteri Gram Negatif karena tidak dapat mengikat warna
ungu yang disebabkan lapisan peptidoglikan yang tipis.
 E. DAFTAR PUSTAKA
Adelberg, J. M. (2008). Medical Microbiology (23th ed.). Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Farah, I. (2021, Mei 4). PEWARNAAN GRAM. Retrieved Mei 8, 2021, from youtube:
https://www.youtube.com/watch?v=GaqCIwik7Fk

Goldman, E. d. (2009). Practical Handbook of microbiology ( 2nd ed.). CRC Press.

Hendrayati, T. I. (2012). PERUBAHAN MORFOLOGI Escherichia coli AKIBAT PAPARAN

EKSTRAK ETANOL BIJI KAKAO (Theobroma cacao) SECARA IN VITRO.

Madigan MT, M. J. (2012). Brock Biology of Microorganisms (13th ed.). San Francisco:
Pearson Education.

Michael J. Pelczar, J. E. (2008). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Razali. (1987). Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD.

Renardi. (2019, Oktober 2). Tutorial Pewarnaan Negatif Bakteri Kultur Murni. Retrieved Mei
8, 2021, from youtube: https://www.youtube.com/watch?v=e8T_PlCeOAo

Rita B. Moyes, J. R. (2009). Differential Staining of Bacteria: Gram Stain. Current Protocols
in Microbiology.

Schaechter M., d. I. (2006). Microbe. Washington DC: ASM Press.

Setiawan, W. A. (2013, September 7). PEWARNAAN DIFERENSIAL: PEWARNAAN GRAM.

Retrieved Mei 8, 2021, from infomikrobiologi:
http://infomikrobiologi.blogspot.com/2013/09/pewarnaan-diferensial-pewarnaan-
gram_7.html

Waluyo. (2004). Mikrobiologi Tanah. Jakarta: CV Rajawali.