LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI 1

PERCOBAAN II
PEWARNAAN GRAM

0LEH :

NAMA : LA ODE MIDSYAM

NIM : A202101033
KELAS : G1
KELOMPOK : III(TIGA)
DOSEN PEMBIMBING : SUWARNY RUHI, S.Si, M.Si
ASISTEN : VITA ARIANTI

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
PROGRAM STUDI D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS MANDALA WALUYA
2022
PEWARNAAN GRAM
A. Waktu dan Tempat

Praktikum percobaan pewarnaan Gram dilaksanakan pada hari Sabtu, 2

juli 2022, pada pukul 13.00-selesai, bertempat dilaboratorium Mikrobiologi,
program Studi D-IV Teknologi Laboratorium Medis, Universitas Mandala
Waluya, Kendari, 2020.

B. Tujuan

Tujuan dari percobaan pewarnaan gram positif dan gram negative

adalah untuk dapat mengetahui perbedaan bakteri gram positif dan gram
negatif.

C. Landasan Teori

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
tersebut diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun
1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella
Pneumonia (Rosnawati, 2019).

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram
negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal
violet. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, karena
dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan
tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut sel bakteri
akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (Ridwan, 2019).

Ditinjau dari komponen penyusun dinding sel bakteri gram positif

relative lebih sederhana berbanding bakteri gram negatif yaitu terdiri dari dua
 sampai tiga lapis membrane sitoplasma yang tersusun dari asam teikhik dan
asam teikhouronik berupa polimer yang larut dalam air, sedangkan dinding sel
bakteri negative lebih kompleks dan lebih tebal, tersusun dari peptidoglikon,
lipoprotein dan lipopolisakarida, sehingga dinding sel bakteri gram positif lebih
permeable terhadap senyawa yang bersifat hidrofil dibandingkan sel bakteri
gram negatif (Hermanto, 2019).

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana, dengan
jumlah peptidoglikan yang relative banyak. Dinding sel bakteri gram negative
memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara structural lebih kompleks.
Membrane bagian luar pada dinding sel gram negatifmengandung
lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri
patogen, yang menyebabkan penyakit, spesies gram negative umumnya lebih
berbahaya dibandingkan dengan spesies gram positif (Saimima, 2015).

Respon hambatan mikroba gram positif lebih kuat dibandingkan

mikroba gram negative. Hal ini disebabkan oleh perbedaan komponen
penyusun dinding sel antara mikroba gram positif dan gram negative. Dinding
sel mikroba gram positif banyak mengandung teikoronat serta molekul
polisakarida. Komponen kimia ini melindungi sel dari kegiatan lisis enzim,
sedangkan zat – zat lain menentukkan reaksi sel pada pengecatan gram dan ada
pula yang menarik dan mengikta bakteriofage (Wibowo, 2015).

D. Alat dan Bahan

 1. Alat

Alat–alat yang digunakan pada percobaan pewarnaan gram terdapat

pada tabel di bawah ini :

Tabel 1.1 Alat dan Fungsinya

NO Nama Alat Fungsi

1 Kaca preparat Untuk meletakan sampel uji yang
akan diamati dibawah mikroskop
secara makroskopis
2 Cover glass Untuk menup sampel uji pada kaca
preparat agar tetap steril
3 Bunsen Untuk memfiksasi sampel uji

4 Jarum ose Batang ose merupakan alat yang

digunakan untuk melakukan
inokulasi.
5 Kertas isap Untuk mendeteksi cairan pada
sampel uji tersebut asam atau basa
6 Mikroskop untuk mengamati objek yang
ukurannya sangat kecil hingga mata
manusia tidak akan mampu untuk
melihatnya

2. Bahan
 Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan pewarnaan bakteri gram
terdapat pada tabel di bawah ini :
Tabel 1.2 Bahan dan Fungsinya

N Nama Bahan Fungsi

O
1. Bakteri staphylococcus Sebagai sampel uji specimen yang akan
aureus dilakukan pewarnaan gram
2. Larutan Kristal
untuk memberikan warna ungu pada
violet(gram A) mikroba sebagai pewarna primer.
3. Larutan iodin(gram B) untuk memperkuat pengikatan warna oleh
bakteri
4. Larutan alcohol(gram C) sebagai zat pendekolorisasi, yaitu untuk
meluruhkan warna ungu (kristal violet)
pada bakteri gram negatif, sedangkan
bakteri gram positif akan tetap berwarna
ungu.
5. Larutan safranin(Gram untuk memberikan warna merah pada
D) mikroba sebagai pewarna sekunder.
6. Alkohol 70% melarutkan zat warna yang berlebih. Pada
pengecatan gram pada bakteri, jika setelah
dibilas dengan alcohol warna bakteri masih
tetap biru atau ungu.
E. Prosedur Kerja

Prosedur Kerja pada percobaan sterilisasi alat, pembuatan media

dan teknik isolasi terdapat pada diagram alir di bawah ini

Pewarnaan Gram

Disiapkan kultur murni bakteri yang akan

diwarnai.

Diambil secara aseptis 1 ulasan jarum ose

kultur bakteri pada permukaan kaca
preparat.

Diratakan degan menggunakan akuades steril

menggunakan jarum ose.

Difiksasi panas dengan cara melewatkan

kaca preparat diatas api bunsen sebanyak 3
kali. Fiksasi digunakan untuk mematikan
bakteri namun tetap mempertahankan bentuk
dan komponen sel.

Diteteskan peawarna primer (Kristal Violet)

secara merata pada ulasan bakteri, dan
tunggu selama 20 detik.

Dibilas pewarna primer menggunakan

akuades steril dan tunggu hingga cukup
kering.

Diteteskan larutan mordant (Lugols Iodine)

pada permukaan ulasan bakteri, dan tunggu
selama 60 detik.
 Dibilas larutan mordant menggunakan
akuades steril dan tunggu hingga cukup
kering.

Diteteskan larutan dekolorizer (Alkohol

Asam) secara merata pada ulasan bakteri
hingga permukaan ulasan tampak jernih.

Dibilas larutan dekolorizer menggunakan

akuades steril dan tunggu hingga cukup
kering.

Diteteskan pewarna sekunder (Safranin)

secara merata pada ulasan bakteri, dan
tunggu selama 20 detik.

Dibilas pewarna sekunder menggunakan

akuades steril dan tunggu hingga cukup
kering.

Ditutup permukaan ulasan selelah kering

dengan penutup kaca dan sampel siap
diamati dibawah mikroskop.

Hasil
F. Hasil Pengamatan
Hasil pengamatan pada percobaan pewarnaan bakteri gram positif
dan gram negatif terdapat pada tabel di bawah ini
Tabel 1.1 Tabel Hasil Pengamatan

karakteristik Gambar
No Mikroskop 1 Mikroskop 2 Gambar 1 Gambar 2
.
1. Warna ungu Warna merah
2. Bentuk koloni Bentuk koloni
staphylococcus E. Coli
atau bulat
3. Koloni berderet Koloni
bergerombol

G. Pembahasan
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
tersebut diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun
1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella
Pneumonia.

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram
negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal
violet. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, karena
dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan
tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut sel bakteri
akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau.
 Percobaan pewarnaan gram bertujuan untuk menegatahui jenis bakteri
gram positif dan gram negative, bakteri yang digunakan pada percobaan ini ada
dua yaitu staphylococcus aureus dan Escherichia Coli, Praktikum pewarnaan
Gram dengan menggunakan cairan pewarna kristal violet pada bakteri yang
diletakkan di atas gelas objek secara merata, lalu didiamkan selama 1 menit
yang bertujuan sebagai indikator bakteri gram positif. kemudian gelas objek
dimiiringkan dibilas dengan menggunakan air mengalir lalu d keringkan
kemudian di tambahkan gram iodium sedikit demi sedikit berfungsi untuk
pembentuk kompleks ungu lalu didiamkan selama 1 menit lalu dibilas kembali
menggunakan air mengalir lalu dikeringkan kemudian ditambahkan alkohol
70% berfungsi untuk menghilangkan warna pada gelas objek sampai warna
tidak luntur lagi (± 20detik) lalu dibilas dan dikeringkan lagi kemudian
ditambahkan dengan pewarnaan larutan safranin yang berfungsi sebagai
indikator bakteri gram nagatif ataupun positif selama ± 20 detik kemudian
dibilas dengan menggunakan aquades dan dikeringkan kemudian di panaskan
dengan menggunakan Bunsen atau di fiksasi sampai menguap bertujuan untuk
memperjelas pewarnaan gram lebih jelas lalu diamati di bawah mikroskop
mendapatkan warna yang khas yaitu warna ungu kebiruan yang menandakan
bakteri Gram positif yang menyerap pewarna kristal violet dan warna
kemerahan untuk bakteri Gramnegatif yang menyerap larutan safranin. Bakteri
gram positif adalah bakteriyang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop.Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna
merah atau merah mudakarena tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.Bakteri
gram positif dinding selnya tersusun oleh peptidoglikan dalam jumlah besar.
Sedangkan bakteri gram negatif mengandung lebih sedikit peptidoglikan
namun strukturnya lebih kompleks, karena dibagian terluarnya tersusun atas
lipopolisakarida (rantai karbohidrat dan lipid). Bakteri gramnegatif lebih
berbahaya karena lipopolisakarida bersifat racun.
 Kelebihan Pewarnaan Gram penting sebagai pedoman awal untuk
memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab
infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena
bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap
berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat
Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram
ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana)
uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi
gonore.

Kekurangan Pewarnaan Gram memerlukan mikroorganisme dalam

jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah
kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur
sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet
(endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa
secara mikroskopis.

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut
kromogen. terjadi ikatanion karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupunpada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat
dibedakan.

Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras

mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang
mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur seldisebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan
yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan
diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positi" dan gram
negati". Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen
yangmemilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan
tidak tahan asam.
H. Kesimpulan

Kesimpulan dari percobaan pewarnaan Gram yaitu terdapat warna

yang khas yaitu warna ungu kebiruan yang menandakan bakteri Gram positif
yang menyerap pewarna kristal violet dan warna kemerahan untuk bakteri
Gramnegatif yang menyerap larutan safranin. Bakteri gram positif adalah
bakteriyang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan
Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop.Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah
mudakarena tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif yaitu staphylococcus aureus dan bakteri
gram negative yaitu Escherichia Coli.