LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR

PEWARNAAN BAKTERI

NAMA : Ramadhani Nasution

NIM : 4161141045

KELAS : Biologi Dik D 2016

TGL PELAKSANAAN : Oktober 2018

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

UNIMED

2018
 I. JUDUL : Pewarnaan Bakteri
II. TUJUAN :

1. Mempelajari cara membuat olesan bakteri yang dibutuhkan dalam pewarnaan

bakteri.
2. Mempelajari prosedur pewarnaan sederhana dan gram (differensial) serta
mengetahui reaksi kimia yang terjadi dalam proses pewarnaan bakteri.
3. Untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri
4. Untuk mengetahui jenis-jenis pewarnaan bakteri
5. Untuk mengetahui larutan pewarna yang digunakan pada percobaan pewarnaa

III. TINJAUAN TEORI:

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi
(Dwidjoseputro, 1998).
Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan praktikum kali ini unutk mengetahui
teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pewarnaan sederhana,
pengenceran negative, maupun pengenceran gram serta mengetahui morfologi
mikroorganisme(Sutedjo,1991).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan
pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri
bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai
zat warna (Waluyo, 2004).
Perbedaan reaksi pewarnaan Gram berdasarkan komposisi dinding sel bakteri.
Dinding sel bakteri gram negatif terdiri dari 5- 20% peptidoglikan, selebihnya adalah
polisakarida, sedangkan dinding sel bakteri gram positif mengandung 90%
peptidoglikan selebihnya adalah asam teikoat. Sel bakteri gram positif terlihat berwarna
ungu karena dapat membentuk ikatan komplek dengan pewarna pertama yaitu komplek
ungu kristaliodium. Pada sel bakteri gram negatif pemberian larutan alkohol 95% dapat
 meningkatkan porositas dinding sel dengan melarutkan lipid pada membran luar
sehingga komplek ungu kristal-iodium akan terlepas dan sel menjadi tidak berwarna.
Selanjutnya sel akan berwarna merah karena terwarnai oleh warna pembanding yaitu
safranin (Agustina, dkk. 2013, p. 18).
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengamati morfologi sel dan mengetahui
kemurnian sel bakteri. Pengecetan gram merupakan salah satu pewarnaan yang paling
sering digunakan, yang dikembangkan oleh Christian Gram. (Amalia, 2013, p.138)
Hasil pewarnaan Gram pada satu jenis bakteri dapat menunjukkan Gram
variabel, yaitu dapat bersifat gram positif maupun gram negatif. Hal tersebut
diakibatkan oleh perbedaan umur koloni bakteri tersebut pada saat pewarnaan Gram
dilakukan. Koloni berumur tua akan menunjukkan Gram negatif, sebaliknya jika
berumur muda akan menunjukkan Gram positif (Nugroho, 2006, p. 88).

IV. ALAT & BAHAN:

Alat
Nama Alat Jumlah
Jarum ose 1 buah
Lampu spritus 1 buah
Mikroskop 2 buah
Kaca objek 1 kotak
Pinset 1 buah
Kertas hisap 1 buah
Bunsen 1 buah
Mancis 1 buah

Bahan
Nama bahan Jumlah
Sediaan bakteri hasil inokulasi Secukupnya
Larutan Gram A ( kristal violet) Secukupnya
Larutan Gram B (iodin) Secukupnya
Larutan Gram C ( alkohol) Secukupnya
Larutan Gram D (safranin) Secukupnya
Alkohol 70% Secukupnya
Akuades Secukupnya
Minyak imersi Secukupnya
Metilen Blue Secukupnya
V. PROSEDUR KERJA

a) PEWARNAAN SEDERHANA
1. keringkan kaca benda secara aseptik Letakkan inokulum dengan menggunakan
jarum inokulasi
2. Tuangi sediaan tersebut dengan metilen blue sehingga menutupi seluruh
permukaan sediaan
3. biarkan selama 1 sampai 2 menit
4. bilaslah sediaan dengan air dengan menggunakan botol semprot. air yang
digunakan tidak boleh mengenai sediaan secara langsung.
5. keringkan di udara atau dengan menggunakan botol semprot. air yang digunakan
tidak boleh mengenai sediaan secara langsung.
6. Amati disedian di bawah mikroskop dengan menggunakan perbesaran kecil
sampai ke perbesaran kuat. gunakan minyak imersi.
7. setelah diamati bersihkan lensa objektif dengan menggunakan kapas yang telah
dibasahi silol agar minyak imersi terhapus.
8. Gambarkan hasil pengamatan Anda dengan membuat keterangan misalnya
mikroorganisme bentuk sel dan warna sel
b) PEWARNAAN GRAM
1. bersihkan gelas preparat dengan alkohol 70%
2. tetesi Satu Tetes aquades steril pada gelas preparat dengan oleh sih dengan 1 OC
bakteri ratakan dan biarkan kering.
3. fiksasi dengan melewatkan beberapa kali di atas api
4. dinginkan dan tetesi dengan larutan garam a sebanyak dua sampai tiga tetes pada
apusan bakteri dan biarkan selama 1 menit
5. cuci dengan air mengalir, keringkan dengan kertas isap
6. titrasi larutan B dan biarkan selama
7. cuci dengan air mengalir keringkan dengan kertas isap
8. deteksi dengan larutan g c biarkan selama 30 detik
9. cuci dengan air mengalir dan keringkan
10. teteskan larutan garam d dibiarkan selama 30 detik
 11. cuci dengan air mengalir dan keringkan
12. amati di bawah mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 100X dengan
memakai minyak imersi
13. catat warna susunan dan bentuk bakteri yang didapat
Hasil pewarnaan : Berwarna ungu = gram positif
Berwarna merah = gram negatif

VI. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL PENGAMATAN

N0 SAMPEL GAMBAR KETERANGAN

1 Pseodomonas Perbesaran 100
Berwarna Kuning
Menggunakan Larutan iodin
Gram Negatif

2 Pseudomonas Perbesaran 100

Berwarna Kuning
Mengunakan larutan iodin
Gram Negatif

B. PEMBAHASAN

1. Fungsi Dari Masing Masing Warna Yang Digunakan

(a) Kristal Violet
Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada
membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid
 acid- crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan
alkohol.
(b) Iodin
Iodium merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada
pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
(c) Alkohol
Penggunaan alkohol pada tahap ketiga ini yang akan melarutkan lapisan lipid
pada dinding bakteri (khususnya bakteri gram negatif) dan melunturkan warna
ungu dari kristal violet tadi. Sebaliknya, pada bakteri gram positif pemberian
larutan ini tidak berpengaruh banyak karena kristal violet telah tertanam pada
lapisan peptidoglikannya yang tebal sehingga tidak mudah luntur. Karena
pemberian alkohol menyebabkan lunturnya warna ungu dari dinding sel bakteri
gram negatif (dinding sel tidak berwarna lagi), maka penambahan larutan safranin
akan menyebabkan dinding sel kembali berwarna lagi, namun dengan warna
merah (safranin merupakan larutan berwarna merah).

(d) Safranin
Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks mg-
Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negative.

2. Perbedaan Bakteri Gram Positif Dan Gram Negatif

Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi
bakteri dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk
pewarnaan diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-
bakteri yang bersifat gram negatif dan positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama
kali pada tahun 1884 oleh Criestian Gram.
Bakteri gram positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet)
dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi
oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna
ungu. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
 ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah
muda. Perbedaan
Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna
utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh
zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak
berwarna merah. Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan
zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.

3. Faktor Yang Mempengaruhi Pewarnaan Bakteri

Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Pewarnaan
Pewarnaan sel miroorganisme umunya menggunakan lebih dari satu macam zat
warna. Hasil pewarnaan tergantung beberapa faktor lain, seperti;
1. Fiksasi
Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik dengan pemanasan atau
dengan freeze driying atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan menggunakan
kimia seperti sabun, fenol dan formalin. Fungsi fiksasi sebelum pewarnaan yaitu:
a Merekatkan sel mikroba pada gelas objek
b Membunuh mikroorganisme secara cepat dengan tidak menyebabkan
perbahan-perubahan bentuk dan strukturnya.
c Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna\
d Membuat sel-sel mikroba lebih kuat (keras)
e Melepaskan granuler (butiran) protein menjadi gugu reaktif NH3+ yang
akan bereaksi dengan gugus –OH dari zat warna.
f Mencegah otolisis sel, yaitu pecahnya sel yang disebabkan olehenzim-
enzim yang dikandungnya sendiri
g Mempertinggi sifat reaktif gugus-gugus tertentu (karboksil amino primer
dan sulfhidril).
2. Pelunturan zat warna
Pelunturan zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel
yang telah diwarnai. Ini berfungsi untuk mengahsilkan kontras yang baik pada
bayangan mikroskop. Ditinjau dari kekuatan ikatan anatara sel dengan zat warna,
maka dikenal beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan alcohol, tahan air dan
lain-lain. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna telah diikat kuat oleh sel
sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh asam, begitu juga dengan tahan
alcohol dan tahan air masing-masing tidak dapat dilunturkan oleh alcohol dan air.
Ada beberapa macam peluntur zat warna, antara lain:
a Peluntur warna bersifat asam yakni HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran
asam- asam tersebut dengan alcohol.
b. Peluntur zat warna bersifat basa yakni KOH, NaOH, sabun dan garam
garam basa.
c. Peluntur zat warna lemah, yaitu alcohol, air minya cengkeh, aseton dan
gliserin
d. Garam-garam logam berat AgNO3, CuSO4 dan lain-lain.
e. Garam-garam logam riangan Na2SO4, MgSO4 dan lain-lain
3. Identifikasi pewarnaan
Zat warna dapat diidentifikasikan dengan beberapa cara misalnya dengan
mempertinggi kadar zat warna, mempertinggi temperature pewarnaan 60-90oC
dan menambahkan suatu mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat
menyebabkan zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan
dengan cara pewarnaan tanpa diberi mordan. Ada beberapa mordan, yaitu:
a Mordan basa
b Mordan asam
4. Substrat
Atas dasar macam zat warna yang diserap oleh sel dapat dibedakan:
a Sel-sel basofil
b Sel-sel asidofil/ oksifil
c Sel-sel yang sudanofil
 5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna penutup adalah suatu zat warna basa yang berada warnanya dengan zat
warna mula-mula yang digunakan. Fungsi dari zat warna punutup adalah
memberkan warna pada sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula.
Zat warna punutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan memberikan
kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama.

4. Manfaat Pewarnaan Bakteri

Manfaat dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelasukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan
struktur dalam bakteri seperti dinding sel danvakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan
kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, sertameningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteridengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihatstruktur luar dan
struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,menghasilkan sifat-sifat fisik dan
kimia yang khas daripada bakteri dengan zatwarna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya
VII. KESIMPULAN
 Pewarnaan garam adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada saat praktikum
pewarnaan gram, larutan yang digunakan yaitu larutan Kristal violet, larutan
safranin, larutan lugol, dan larutan peluntur. Bacteri yang dipakai saat
pewarnaan yaitu bacteri yang telah di lakukan enumirasi pada praktikum
sebelumnya. Dari praktikum tersebut didapatkan hasil yaitu bacterinya berwarna
pink (merah muda) yang berarti bacteri tersebut termasuk bacteri gram negative.
 Pewarnaan sederhana hanya dapat digunakan dalam mengamati morfologi
bakteri.
 Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. teknik
pewarnaantersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu.

 Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif
berwarna ungu.
 Dari praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa organisme
yang yang dapat menahan zat pewarna setelah dicuci dengan alkohol disebut
organisme gram positif, dimana indikasinya menunjukkan warna ungu pada
bakteri itu sendiri dan bentuk yang dihasilkan berbentuk Monobacillus.
 DAFTAR PUSTAKA

Agustina, Diana, dkk. (2013). Isolasi dan Karakterisasi Bakteri pada Ikan Kembung
(Rastrelliger sp.) Asin Berkitosan. Jurnal Biospecies, 6(1): 15-19.
Dewi, Khrisna, Amalia. (2013). Isolasi, Identifikasi Bakteri dan Uji Sensivitas
Staphylococcus aureus Terhadap Amoxillin dari Sampel Susu Kambing
Peranakan Ettawa (PE) Penderita Mastitis di Wilayah GiriMulyo,
Kulonprogo, Jogjakarta, Jurnal Sains Veteriner. 31(2): 138-140.
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Simulasi Sederhana Sebagai Kajian Awal Bioremediasi Land Treatment. Jurnal Makara
Teknologi, 10(2):82-89.
Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.
Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press.
Nugroho, Astri. (2006). Biodegradasi Sludge Minyak Bumi dalam Skala Mikrokosmos:

UNIMED 11 OKTOBER 2018

ASISTEN LABORATORIUM PRAKTIKAN

TIM ASISITEN LABORATORIUM RAMADHANI NASUTION

4161141045