PANDUAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI III

DOSEN PENGAMPU :
ELIYA MURSYIDA, M.Si
dr. OLVARIA MISFA, M.Biomed

PROGRAM STUDI DIII ANALIS FARMASI DAN MAKANAN

FAKULTAS FARMASI DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ABDURRAB
PEKANBARU
2021
i|Page
 PANDUAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI III
KODE MATA KULIAH: K4505

NAMA MAHASISWA :
KELAS :

PROGRAM STUDI DIII ANALIS FARMASI DAN MAKANAN

FAKULTAS FARMASI DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ABDURRAB
PEKANBARU
2021

ii | P a g e
 VISI, MISI, DAN TUJUAN

PROGRAM STUDI D III ANALIS FARMASI DAN MAKANAN

Visi
Menjadi program studi analis farmasi dan makanan yang terkemuka, unggul di bidang
keamanan pangan dan kualitas air berbasis nilai-nilai Islami di tingkat nasional pada tahun
2035

Misi
1. Menyelenggarakan pendidikan, penelitian dan pengabdian kepada masyarakat di bidang
analisis farmasi dan makanan
2. Mengembangkan program studi analis farmasi dan makanan yang unggul di bidang
keamanan pangan dan kualitas air
3. Mempersiapkan dosen dan mahasiswa yang berprestasi di tingkat nasional
4. Membentuk insan akademik yang melaksanakan nilai-nilai islami
5. Menjalin kerjasama dengan berbagai instansi dalam dan luar negri

Tujuan
1. Terselenggaranya pendidikan, penelitian dan pengabdian kepada masyarakat di bidang
analisa farmasi dan makanan
2. Terbentuknya program studi analis farmasi dan makanan yang unggul di bidang
keamanan pangan dan kualitas air
3. Menghasilkan dosen dan mahasiswa yang berprestasi di tingkat nasional
4. Menghasilkan insan akademik yang melaksanakan nilai-nilai Islami
5. Terjalinnya kerjasama dengan berbagai instansi dalam dan luar negri

iii | P a g e
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, kami panjatnya puji dan syukur kehadirat Allah swt sehingga penulis
dapat menyelesaikan Panduan Praktikum Mikrobiologi III ini. Panduan ini merupakan
panduan praktikum bagi mahasiswa dalam pelaksanaan praktikum. Keaktifan mahasiswa
sangat penting dalam keberhasilan pelaksanaan Praktikum Mikrobiologi III. Oleh karena itu
penulis sangat mengharapkan mahasiswa dapat aktif dalam pelaksanaan praktikum ini.
Penulis mohon maaf jika masih banyak kekurangan dalam Panduan Praktikum
Mikrobiologi III ini, untuk itu penulis berharap masukan dan saran dari berbagai pihak agar
modul ajar praktikum ini dapat lebih baik dimasa yang akan datang. Semoga panduan
praktikum ini dapat memberikan manfaat yang sebesar besarnya bagi mahasiswa dan
pembaca. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang sudah membantu
dalam penyusunan Panduan Praktikum Mikrobiologi III.

Pekanbaru, September 2021

Penyusun

iv | P a g e
 DAFTAR ISI

Halaman
VISI, MISI, DAN TUJUAN PRODI DIII ANAFARMA iii
KATA PENGANTAR iv
DAFTAR ISI v
1. Asistensi, kontrak kuliah, dan pembagian kelompok 1
2. Pembiakan dan peremajaan bakteri 6
3. Uji angka lempeng total pada sampel daging, telur dan susu 14
4. Uji angka kapang/ khamir pada sampel selai buah 15
5. Menghitung jumlah koloni kapang/ khamir pada sampel selai buah 21
6. Uji presumtif (pendugaan) Most Probable Number (MPN) Coliform pada
sampel daging, telur, dan susu 25
7. Uji konfirmasi (penegasan) Most Probable Number (MPN) Coliform dan
MPN Escherichia coli 28
8. Identifikasi bakteri Escherichia coli pada medium spesifik 33
9. Identifikasi bakteri Escherichia coli pada media gula-gula dan media
biokimia 37
10. Identifikasi bakteri Salmonella thypi pada sampel daging, telur dan susu
pada media spesifik 47
11. Identifikasi bakteri Salmonella thypi pada media gula-gula dan media
biokimia 51
12. Identifikasi bakteri Staphylococcus aureus pada sampel susu menggunakan
medium Blood Agar dan Manitol Salt Agar 57
13. Uji katalase dan koagulase terhadap Staphylococcus aureus 60

v|Page
 1. ASISTENSI DAN KONTRAK KULIAH

Komitmen Praktikum
1. Mahasiswa wajib mematuhi peraturan yang berlaku di Laboratorium Mikrobiologi
dan Parasitologi Universitas Abdurrab.
2. Berpakaian rapi menggunakan seragam sesuai jadwalnya dan memakai sepatu.
3. Memakai jas lab ketika memasuki ruang laboratorium.
4. Keterlambatan maksimum 15 menit dari jadwal yang sudah ditentukan.
5. Dosen berkomunikasi dengan ketua kelompok tentang informasi terkait kegiatan
praktikum dan informasi lainnya.
6. Bila mahasiswa tidak hadir atau terlambat masuk kelas, wajib memberi tahu dosen
melalui telpon/sms/surat dan tidak menerima titip pesan lewat teman.
7. HP disilentkan ketika praktikum dan dikumpulkan di dalam loker ketika praktikum.
8. Setiap mahasiswa wajib membawa APD (Alat Pelindung Diri) seperti handscoon,
masker, antiseptik.
9. Mahasiswa dibagi menjadi kelompok kecil praktikum dan piket.
10. Mahasiswa dapat memberikan saran dan masukan yang membangun kepada dosen.
11. Saling menghargai dan menghormati, menjaga suasana nyaman dan menyenangkan
selama praktikum

Kompetensi Mata Kuliah

Mampu melakukan pembiakkan dan peremajaan bakteri, identifikasi bakteri, analisis
cemaran mikrobiologi pada sampel dengan metode Angka Paling Mungkin (APM) /
Most Probable Number (MPN), Angka Lempeng Total (ALT), dan Angka
Kapang/Khamir.

Tujuan Mata Kuliah

1. Setelah mengikuti mata kuliah ini, mahasiswa mampu memahami dan melakukan
peremajaan dan pembiakkan bakteri pada media pengkayaan dan media selektif.
2. Mahasiswa mampu melakukan identifikasi cemaran bakteri Gram negatif dan Gram
positif pada sediaan obat, kosmetik, makanan, dan minuman.

1|Page
3. Mahasiswa mampu melakukan analisis cemaran mikrobiologi pada sampel sediaan
obat, kosmetik, makanan, dan minuman dengan metode Angka Paling Mungkin
(APM) / Most Probable Number (MPN), Angka Lempeng Total (ALT), Angka
Kapang/Khamir, identifikasi Escherichia coli, Salmonella typhi, dan
Staphylococcus aureus.

Deskripsi Mata Kuliah

Membahas tentang prosedur pembiakkan dan peremajaan bakteri, identifikasi bakteri,
analisis cemaran mikrobiologi pada sampel dengan metode Angka Paling Mungkin
(APM) / Most Probable Number (MPN), Angka Lempeng Total (ALT), Angka
Kapang/Khamir, identifikasi Escherichia coli, Salmonella typhi, dan Staphylococcus
aureus.

Strategi Pembelajaran :
1. Masing-masing mahasiswa/praktikan berperan aktif dalam mempraktikkan kegiatan
praktikum.
2. Adanya pembagian tugas secara bergantian dalam setiap kelompok kecil praktikum,
sehingga semua anggota kelompok berperan, tidak ada praktikan yang hanya
mengharapkan temannya saja yang bekerja.
3. Mahasiswa dapat mahir melakukan pekerjaan apabila mau mengerjakannya
berulang-ulang, jangan takut salah, karena dalam proses belajar. Jika salah, mau
belajar memperbaikinya untuk praktikum selanjutnya.
4. Laporan praktikum dikerjakan oleh masing-masing individu, jangan mencontek
laporan orang lain.

Tugas
1. Setiap mahasiswa wajib membuat daftar media mikrobiologi dan kegunaannya
masing-masing.
2. Setiap mahasiswa membuat laporan praktikum sesuai format pada buku laporan
setelah praktikum selesai.
3. Sebelum memulai praktikum akan dilaksanakan responsi baik tulisan maupun lisan
terkait judul praktikum yang akan dilaksanakan.

2|Page
Metode Evaluasi :
1. Keaktivan individu : 10 %
2. Tugas dan Responsi : 10 %
3. Laporan Individu : 20 %
4. Ujian Tengah Semester (UTS) : 30 %
5. Ujian Akhir Semester (UAS) : 30 %
Jika tidak hadir praktikum karena sakit atau izin yang jelas, diizinkan mengerjakan
laporan praktikum yang ditinggalkannya sehingga ada nilai laporannya. Jika tidak hadir
tanpa izin, maka nilai laporannya pada judul praktikum yang ditinggalkannya adalah
nol.

Kegiatan Praktikum
1. Asistensi, kontrak kuliah, dan pembagian kelompok.
2. Pembiakkan dan peremajaan bakteri.
3. Uji angka lempeng total (ALT) pada sampel daging, telur, dan susu.
4. Uji angka kapang/khamir pada selai buah.
5. Menghitung jumlah koloni kapang/khamir pada sampel selai buah.
6. Uji presumtif (pendugaan) Most Probable Number (MPN) Coliform pada sampel
daging, telur, dan susu
7. Uji konfirmasi (penegasan) Most Probable Number (MPN) Coliform dan MPN
Escherichia coli.
8. Identifikasi bakteri Escherichia coli pada medium spesifik
9. UTS
10. Identifikasi bakteri Escherichia coli pada media gula-gula dan media biokimia.
11. Identifikasi bakteri Salmonella thypi pada sampel daging, telur, dan susu pada
medium spesifik
12. Identifikasi bakteri Salmonella thypi pada media gula-gula dan media biokimia.
13. Identifikasi bakteri Staphylococcus aureus pada sampel susu menggunakan medium
Blood Agar dan Manitol Salt Agar.
14. Uji katalase dan koagulase terhadap Staphylococcus aureus.
15. Review materi persiapan UAS
16. UAS

3|Page
Tugas : Hafalkan dan lengkapi kegunaan dari media berikut

No Singkatan Nama Media Kegunaan

Buffered Pepton
1 BPW
Water
Brilliant Green
2 BGLBB
Lactose Bile Broth

Brain Heart
3 BHI
Infusion

Brain Heart
4 BHIB
Infusion Broth

5 BPA Baird-Parker Agar

Bismuth Sulfite
6 BSA
Agar

Ethylene Diamine
7 EDTA
Tetraacetic Acid
Escherichia coli
8 ECB
Broth
Levine Eosin
9 LEMBA Methylene Blue
Agar

Foetal Bovine
10 FBS
Serum

Hektoen Enteric
11 HEA
Agar
Kalium Cyanide
12 KCNB
Broth

13 LIA Lysine Iron Agar

4|Page
 Lysine
14 LDB Decarboxylase
Broth

15 LB Lactose Broth

Lauryl Sulfate
16 LSTB
Tryptose Broth

17 PCA Plate Count Agar

Selenite Cystine
18 SCB
Broth
Triple Sugar Iron
19 TSIA
Agar

Tetra Thionate
20 TTB
Broth

Trypticase Soy
21 TSTB
Tryptose Broth

22 TB Tryptose Broth

Xylose Lysine
23 XLDA
Deoxycholate

Koser Citrate
24 KCB
Broth

Simmons Citrate
25 SCA
Agar
Bacteriological
26 BP
Pepton

5|Page
 2. PEMBIAKAN DAN PEREMAJAAN BAKTERI

Tujuan
1. Melakukan pembiakan bakteri dengan cara memindahkan bakteri dari medium
yang lama ke medium yang baru sehingga bakteri dapat tumbuh kembali.
2. Melakukan peremajaan bakteri

Tinjauan Pustaka
Peremajaan bakteri dilakukan dengan cara memindahkan atau memperbarui
biakan mikroba dari biakan lama ke medium yang baru. Umumnya dilakukan secara
berkala misalnya saat akan dilakukanya uji-uji atau sebulan sekali / dua bulan sekali
saat di simpan sebagai stok. Teknik ini merupakan cara paling tradisional yang
digunakan untuk memelihara koleksi isolat mikroba di laboratorium. Cara ini juga
digunakan untuk penyimpanan dan pemeliharaan isolat mikroba yang belum diketahui
cara penyimpanan jangka panjangnya. Peremajaan berkala tidak dianjurkan untuk
penyimpanan jangka panjang. Teknik ini mempunyai berbagai kendala yaitu
kemungkinan terjadi perubahan genetik melalui seleksi varian, peluang terjadinya
kontaminasi dan terjadinya kekeliruan pemberian label. Kendala tersebut memberi
peluang yang lebih besar terjadinya kehilangan isolat dibandingkan dengan teknik lain.
Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan
memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat
ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih
dahulu diusahakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar
tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi.
Pembenihan atau media yaitu campuran bahan-bahan tertentu dengan akuades
yang dapat menumbuhkan bakteri, jamur, virus, atau parasit pada derajat keasaman dan
inkubasi tertentu.
Komposisi bahan baku dan bahan penunjang untuk membuat media yaitu :
1. Nutrien : protein, pepton, asam amino, dsb.
2. Energi : karbohidrat
3. Logam dan mineral : kalsium, magnesium, besi, posfat, nitrat, dsb.
4. Indikator : phenol red, brom thymol blue, brom cresol purple, dsb.

6|Page
 5. Bahan selektif : bahan kimia, antibiotik.
6. Bahan pembuat padat : agar-agar, protein, serum, gelatin

Menurut wujudnya, dikenal ada 3 jenis media yaitu :

1. Liquid media (pembenihan cair)
Contohnya : Nutrient Broth, Brain Hearth Infusion, Lactose Broth.
Pembenihan cair dibuat dalam tabung atau botol yang ditegakkan.
2. Solid media (pembenihan padat)
Contohnya : Nutrient Agar, TSI agar, TS agar, Ma Conkey agar, dsb.
Pembenihan padat dibuat dalam tabung dimiringkan, ditegakkan, atau di dalam
cawan petri.
3. Semi solid media (pembenihan setengah padat)
Contohnya : SIM medium, MIO medium, Carry & Blair
Pembenihan setengah padat dibuat dalam tabung atau botol yang ditegakkan.

Menurut sifatnya dikenal beberapa jenis media yaitu :

1. Transport media
Media ini digunakan untuk mengirim spesimen klinik dari suatu tempat ke
laboratorium, di dalam media ini bakteri yang ada tidak mati dan tidak
berkembang biak. Contohnya, Carry & Blair, Armies, Stuart.
2. Enrichment media
Media ini digunakan untuk memperbanyak/ menumbuhkan bakteri menjadi lebih
banyak. Ada yang bersifat umum dan ada yang bersifat khusus.
Contoh yang bersifat umum : Nutrient Agar, Nutrient Broth, Brain Heart
Infussion Agar, Brain Heart Infussion Broth, Blood Agar, dsb.
Contoh yang bersifat khusus : air pepton alkalis, Selenit Broth, Telluriet Broth,
Mannitol Salt Broth, dsb.
3. Selective media
Media yang dapat digunakan untuk memilih koloni satu jenis bakteri dari
koloni-koloni yang lain. Sering disebut media isolasi karena dapat digunakan
untuk memisahkan koloni-koloni bakteri yang berbeda. Ada yang bersifat umum
dan ada yang bersifat khusus.

7|Page
 Contoh yang bersifat umum : Blood Agar (untuk Gram negatif dan Gram
positif), MacConkey agar (untuk Gram negatif batang), Eosin Methilen Blue
Agar, dsb.
Contoh yang bersifat khusus : TCBS agar, SS agar, Telluriet agar, Mannitol Salt
Agar.
4. Universal media
Media yang dapat ditumbuhi oleh hampir semua jenis bakteri.
Contohnya : Blood Agar, BHI agar, BHI broth, Tryptose Soy Broth, dsb.
5. Identification media
Media untuk identifikasi, menentukan jenis bakteri, biasanya digunakan
beberapa jenis media bersama-sama.
Contohnya : media gula-gula (glukosa, laktosa, maltosa, manitol), Simmon
Citrat Agar, SIM, Nitrat agar, TSI agar, urea agar, dsb.

Metode Penanaman Bakteri

A. Penanaman bakteri pada media padat bentuk plate
1. Goresan sejajar : (isolasi)
a. Ose dibakar sampai steril, didinginkan
b. Diambil sampel atau kultur bakteri, dipulaskan/dioleskan di salah satu
sisi/tepi medium (jangan menyentuh dinding cawan petri)
c. Pulasan digoreskan sejajar sampai memenuhi permukaan media
2. Goresan sejajar melingkar
a. Ose dibakar sampai steril, didinginkan
b. Diambil sampel atau kultur bakteri, dipulaskan/ dioleskan di salah satu
sisi/tepi media (jangan menyentuh dinding cawan petri)
c. Media diputar 90o, dengan ose steril yang lain diambil kultur bakteri,
dioleskan di tepi media, dioleskan kembali sejajar. Selanjutnya media
diputar 90o, dengan ose steril yang lain diambil kultur bakteri, dioleskan
sejajar di tepi media, dilakukan sampai memenuhi permukaan media
3. Cara taburan : (isolasi dan memperbanyak)

8|Page
 a. Suspensi sampel, sampel cair, atau kultur bakteri dalam media cair diambil
dengan pipet steril sebanyak 0.1 ml, diteteskan di permukaan medium tepat
ditengah-tengahnya
b. Tetesan tersebut diratakan pada seluruh media menggunakann spatel/ batang
L yang terbuat dari kaca atau kawat.
4. Cara penuangan : (penghitungan)
a. Suspensi sampel, sampel cair, atau kultur bakteri dalam medium, cair
diambil dengan pipet steril sebanyak 0.1 atau 1 ml
b. Secara steril dituangi medium padat steril yang dicairkan pada suhu 40o -
45oC sampai menutupi semua permukaan dasar cawan petri
c. Dihomogenkan dan ditunggu sampai medium membeku
d. Dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi cawan petri terbalik.
Pembacaan :
 Pertumbuhan bakteri pada medium padat disebut koloni yaitu kelompok-
kelompok bakteri yang tumbuh pada medium tersebut.
 Koloni pada medium padat dengan tujuan isolasi dapat dibedakan berdasarkan
kriteria berikut :
Ukuran : diukur diameternya dengan satuan mm
Warna : putih, kuning, hitam, hijau, merah, dsb
Bentuknya : bulat, batang, serabut, bergelombang, dsb
Permukaan : datar, cembung, cekung, kasar, halus (smooth)
Sifatnya : keruh, jernih, kering, berlendir, menjalar, haemolisis, non
haemolisis
 Koloni yang tumbuh pada medium dengan tujuan memperbanyak, penting
diperhatikan selain adanya pertumbuhan koloni juga kemurnian koloni tersebut
 Koloni yang tumbuh pada medium dengan tujuan penghitungan, kriteria koloni
tidak perlu diperhatikan, tinggal dihitung saja.

B. Penanaman bakteri pada medium padat dalam tabung bentuk miring

Tujuan : memperbanyak koloni, identifikasi, menyimpan bakteri
1. Goresan zig-zag
a. Koloni bakteri diambil dengan ose yang sudah steril dan dingin.

9|Page
 b. Tutup media dibuka dengan menjepit menggunakan jari kelingking kanan, mulut
tabung dibakar dengan nyala api.
c. Ose yang sudah berisi koloni bakteri digoreskan zig-zag pada permukaan media
di tengah, tidak terlalu ke atas/ ke bawah dan juga tidak terlalu ke kiri/ ke kanan.
Contohnya pada media nutrient agar
2. Goresan zig-zag ditusuk
Setelah digoreskan zig-zag kemudian ditusukkan ke tengah-tengahnya 1 sampai
2 kali. Contohnya pada media tripel sugar iron agar
Pembacaan : koloni yang tumbuh diperhatikan kemurniannya, kemudian dibaca
perubahan-perubahan yang terjadi pada media dengan atau tanpa penambahan
reagensia.

C. Penanaman pada media semi solid di dalam tabung

Tujuan : untuk identifikasi, menyimpan bakteri
a. Jarum ose disterilkan, didinginkan
b. Diambil koloni bakteri
c. Tutup media dibuka dengan menjepit menggunakan jari kelingking kanan
d. Mulut tabung dibakar dengan nyala api, ose yang sudah ada koloni bakterinya
ditusukkan tegak lurus di permukaan medium bagian tengah sampai dasar
tabung.
e. Mulut tabung dibakar lagi dan ditutup kembali, ose dibakar/disterilkan kembali.
Pembacaan : koloni yang tumbuh diperhatikan kemurniannya, kemudian dibaca
perubahan-perubahan yang terjadi pada media itu (warna, gerak, dsb) dengan atau tanpa
penambahan reagensia.

D. Penanaman pada media cair

Tujuan : untuk memperbanyak kultur bakteri, untuk melihat gerak bakteri, untuk
identifikasi
Cara penanaman
a. Ose dibakar sampai steril, didinginkan
b. Diambil koloni bakteri dengan ose yang sudah steril
c. Tutup media dibuka, mulutnya dibakar

10 | P a g e
 d. Ose yang sudah berisi koloni bakteri dicelupkan dan digores-goreskan pada
dinding tabung reaksi di dalam medium.
e. Mulut tabung dibakar, ditutup kembali.
f. Ose dibakar sampai steril
Pembacaan : pertumbuhan bakteri ditandai dengan medium menjadi keruh, kalau tidak
tumbuh mediumnya tetap jernih. Selain kekeruhan juga dapat diikuti perubahan warna
indikatornya yang merupakan pertanda adanya perubahan/ pemecahan gula/ bahan
kimia yang terkandung di dalam media tersebut.

Alat dan Bahan

Alat : Autoklaf, inkubator, Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, hot plate, jarum
ose, rak tabung reaksi, timbangan, lampu spiritus, gelas ukur.
Bahan : Kultur bakteri Escherichia coli, Salmonella typhi, dan Staphylococcus aureus,
medium Nutrient Agar, akuades, kapas, kasa, aluminium foil, tisu, kertas label, etanol
70%.

Prosedur Kerja
1. Medium NA dibuat sebanyak 250ml dengan cara ditimbang sebanyak 7g dan
dilarutkkan dalam 250ml akuades di dalam Erlenmeyer, lalu dipanaskan hingga
mendidih (lihat cara pembuatan media pada kemasan masing-masing medium,
contohnya untuk NA 28g dalam 1L) .
2. Medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 10ml sebanyak 8
tabung, tabung ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa/aluminium foil.
3. Medium di dalam tabung reaksi, medium sisa di dalam Erlenmeyer, dan cawan
petri (8 buah) dimasukkan ke dalam autoklaf dan disterilkan pada suhu 121oC
selama 15 menit.
4. Laminar Air Flow (LAF) dihidupkan, kerja penanaman bakteri dilakukan di
dalam LAF.
5. Medium dikeluarkan dari autoklaf, medium dalam tabung reaksi didinginkan
dalam posisi tabung miring hingga medium padat. Sisa medium dituangkan
sebanyak 20ml ke dalam cawan petri, ditutup, dan dibiarkan memadat.

11 | P a g e
 6. Kawat ose disterilkan dengan cara dibakar, kemudian didinginkan, lalu diambil
kultur bakteri dengan kawat ose yang steril.
7. Penanaman pada medium miring pada tabung reaksi: kapas penutup tabung
reaksi dibuka dengan cara dijepit dengan kelingking tangan kanan, mulut tabung
reaksi dibakar, kawat ose berisi kultur bakteri digoreskan pada permukaan
medium agar miring secara zig-zag.
8. Mulut tabung reaksi dibakar, ditutup kembali dengan kapas/aluminium foil.
9. Penanaman pada medium di cawan petri dengan cara goresan sejajar dan
melingkar.
10. Medium yang sudah ditanam bakteri diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35-
36oC selama 24 jam. Pada cawan petri diinkubasi dalam keadaan terbalik.
11. Kultur bakteri yang sudah diremajakan disimpan di dalam kulkas, diberi label
nama strain bakteri dan tanggal penanaman.

Hasil
Lihat hasil inokulasi bakteri pada permukaan medium agar miring dan pada permukaan
medium datar di cawan petri, jika terdapat koloni bakteri yang berwarna putih atau
warna lainnya, berarti bakteri yang diinokulasikan telah tumbuh. Jika permukaan
medium tetap jernih, berarti tidak ada bakteri yang tumbuh.
Lampirkan foto hasil medium yang sudah ditumbuhi bakteri

12 | P a g e
Pembahasan

Kesimpulan

Saran

Pekanbaru, …………………
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(Eliya Mursyida, M.Si) ( )

13 | P a g e
 3. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) / TOTAL PLATE COUNT (TPC)
PADA SAMPEL DAGING, TELUR, DAN SUSU

Prinsip
Angka Lempeng Total (ALT) / Total Plate Count (TPC) dimaksudkan untuk
menunjukkan jumlah mikroba yang terdapat dalam suatu produk dengan cara
menghitung koloni bakteri y ang ditumbuhkan pada media agar.\

Tujuan
Mengetahui jumlah cemaran bakteri total yang terdapat pada daging, telur, dan susu.

Alat dan Bahan

Alat : cawan petri, tabung reaksi, pipet volumetrik, botol media, timbangan,
Erlenmeyer, vortex, kawat ose, lampu spritus, autoklaf, incubator, gelas ukur,
termometer, penghitung koloni (colony counter), korek api.
Bahan : daging, telur, susu, media BPW (Buffered Pepton Water) / BP (Bacteriological
Pepton) / NaCl 0,9% steril, Plate Count Agar (PCA), akuades.

Prosedur Kerja
1. Persiapan sampel
a. Sampel padat dan semi padat ditimbang sebanyak 5g atau sampel cair diukur
sebanyak 5ml secara aseptik, kemudian dimasukkan ke dalam wadah steril.
b. Ditambahkan 4 ml larutan pengencer BPW 0.1%/ BP 0.1% / NaCl 0,9%
steril ke dalam wadah steril yang berisi sampel, dihomogenkan dengan
vorteks atau bolak-balik menggunakan tangan (kecuali untuk sampel susu
cair). Ini merupakan larutan dengan pengenceran 10-1.
2. Dipindahkan sebanyak 1ml larutan pada pengenceran 10-1 tersebut dengan pipet
volume atau mikropipet steril ke dalam 9ml larutan pengencer untuk
mendapatkan pengenceran 10-2.
3. Dibuat pengenceran hingga 10-3, 10-4, 10-5 dan seterusnya dengan cara yang
sama, sesuai kebutuhan.

14 | P a g e
 Gambar 1. Metode pengenceran

4. Selanjutnya dimasukkan sebanyak 1ml suspensi dari setiap pengenceran ke

dalam cawan petri secara duplo.
5. Medium PCA dibuat sesuai jumlah yang dibutuhkan (baca aturan pembuatan
pada kemasan medium). Setelah disterilkan medium didinginkan hingga
temperatur 45°C ± 1°C, lalu ditambahkan 15ml - 20ml pada masing-masing
cawan yang sudah berisi suspensi. Supaya larutan sampel dan medium PCA
tercampur seluruhnya, dilakukan pemutaran cawan ke depan dan ke belakang
atau membentuk angka delapan dan didiamkan hingga memadat.
6. Selanjutnya, diinkubasikan pada temperatur 34°C - 36°C selama 24 - 48 jam
dengan meletakkan cawan pada posisi terbalik yang telah dibungkus kertas atau
dibungkus plastik bening steril. Khusus untuk produk susu, diinkubasikan pada
temperatur 32°C ± 1°C selama 24 - 48 jam dengan meletakkan cawan pada
posisi terbalik.
7. Setelah diinkubasi, dihitung jumlah koloni pada setiap seri pengenceran kecuali
cawan petri yang berisi koloni menyebar (spreader colonies). Pilih cawan yang
mempunyai jumlah koloni 25 - 250 koloni.

15 | P a g e
Interpretasi hasil
Cawan dengan jumlah koloni kurang dari 25
 Bila cawan duplo dari pengenceran terendah menghasilkan koloni kurang dari
25, hitung jumlah yang ada pada cawan dari setiap pengenceran.
 Rerata jumlah koloni per cawan dan kalikan dengan faktor pengencerannya
untuk menentukan nilai TPC.
 Tandai nilai TPC dengan tanda bintang (Tabel 1 nomor 3) untuk menandai
bahwa penghitungannya diluar 25 - 250 koloni per cawan.

Cawan dengan jumlah koloni lebih dari 250

 Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 250, hitung koloni- koloni pada cawan
untuk memberikan gambaran penyebaran koloni secara representatif.
 Tandai penghitungan TPC dengan tanda bintang untuk menandai bahwa
penghitungannya diluar 25 – 250 koloni per cawan (Tabel 1 nomor 4).

Spreaders
Koloni yang menyebar (spreaders) biasanya dibagi dalam 3 bentuk:
a) Rantai koloni tidak terpisah secara jelas disebabkan oleh disintegrasi rumpun
bakteri.
b) Terbentuknya lapisan air antara agar dan dasar cawan.
c) Terbentuknya lapisan air pada sisi atau permukaan agar.
Bila cawan yang disiapkan untuk sampel lebih banyak ditumbuhi oleh spreader seperti
(a), dan total area yang melebihi 25 % dan 50 % pertumbuhannya dilaporkan sebagai
cawan spreader.
Rerata jumlah koloni dari setiap pengenceran, kemudian laporkan jumlahnya sebagai
TPC (Tabel 1 nomor 5).
Selain 3 (tiga) bentuk spreader, dapat dihitung sebagai satu pertumbuhan koloni.
Untuk tipe a) bila hanya terdapat satu rantai, hitunglah sebagai koloni tunggal. Bila ada
satu atau lebih rantai yang terlihat dari sumber lain, hitung tiap sumber itu sebagai satu
koloni, termasuk untuk tipe b) dan c) juga dihitung sebagai koloni.
Gabungkan perhitungan koloni dan perhitungan spreader untuk menghitung TPC.

16 | P a g e
Cawan tanpa koloni
Bila cawan petri dari semua pengenceran tidak menghasilkan koloni, laporkan TPC
sebagai kurang dari 1 kali pengenceran terendah yang digunakan. Tandai TPC dengan
tanda bintang bahwa penghitungannya diluar 25 - 250 koloni (Tabel 1 nomor 6).

Cawan duplo, cawan yang satu dengan 25 - 250 koloni dan cawan yang lain > 250
koloni
Bila cawan yang satu menghasilkan koloni antara 25 - 250 dan yang lain > 250 koloni,
hitung kedua cawan dalam penghitungan TPC (Tabel 1 nomor 7).

Cawan duplo, satu cawan dari setiap pengenceran dengan 25 - 250 koloni
Bila 1 cawan dari setiap pengenceran menghasilkan 25 - 250 koloni, dan cawan lain
<25 koloni atau menghasilkan > 250 koloni, hitung keempat dalam penghitungan TPC
(Tabel 1 nomor 8).

Cawan duplo, dua cawan dari satu pengenceran dengan 25 - 250 koloni, hanya 1
cawan yang > 25 - 250 koloni dan dari cawan yang lain dengan 25 - 250 koloni
Bila kedua cawan dari satu pengenceran menghasilkan 25 - 250 koloni, hitung keempat
cawan termasuk cawan yang < 25 atau yang >250 koloni dalam penghitungan TPC
(Tabel 1 nomor 9).

Pelaporan Hasil
a) Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau di atasnya,
maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua naik 1 angka, misalnya 456
menjadi 460 (4.6 x 102).
b) Bila angka ketiga 4 atau dibawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan
angka kedua tetap, misalnya 454 menjadi 450 (4.5 x 102).
c) Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 (nol) dan
angka kedua adalah angka genap, misalnya 445 menjadi 440 (4.4 x 102).
d) Bila angka ketiganya 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 (nol)
dan angka kedua naik 1 angka, misalnya 455 menjadi 460 (4.6 x 102).

17 | P a g e
Tabel 1. Petunjuk penghitungan TPC

18 | P a g e
Hasil

Lampirkan foto hasil pertumbuhan bakteri pada masing-masing cawan petri

Perhitungan Pembuatan Media dan Perhitungan Hasil

Perhitungan pembuatan media PCA :

Perhitungan angka lempeng total :

Angka lempeng total ( koloni/g) = n x F
n adalah rata – rata koloni dari dua cawan petri dari satu pengenceran
F adalah faktor pengenceran dari rata-rata koloni yang dipakai.

19 | P a g e
Pembahasan

Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(Eliya Mursyida, M.Si) ( )

20 | P a g e
 4. UJI ANGKA KAPANG/ KHAMIR PADA SAMPEL SELAI BUAH

Prinsip
Pertumbuhan kapang/khamir dalam media yang sesuai, setelah diinkubasikan pada
suhu 25 °C ± 1°C selama 5 hari.

Tujuan
Mengetahui jumlah kapang/ khamir yang terdapat pada sampel selai buah.

Alat dan Bahan

Alat : Tabung reaksi, erlenmeyer, kawat ose, lampu spritus, autoklaf, inkubator,
timbangan, gelas ukur, pipet ukuran 1ml dan 10ml, termometer, alat penghitung koloni
(colony counter), mikroskop
Bahan : sampel selai buah, BPW (Buffered Pepton Water) / BP (Bacteriological
Pepton)/ NaCl 0.9% steril, medium Potato Dextro Agar (PDA), akuades.

Prosedur Kerja
1. Dilakukan persiapan dan homogenisasi sampel dengan cara, sampel ditimbang
sebanyak 5g dan dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi 45ml larutan
pengencer sehingga diperoleh pengenceran 1:10. Campuran dikocok beberapa kali
hingga homogen.
2. Dipindahkan sebanyak 1ml larutan pengenceran 10-1 tersebut dengan pipet steril ke
dalam 9ml larutan pengencer untuk mendapatkan pengenceran 10-2.
3. Dibuat pengenceran hingga 10-3, 10-4, dan seterusnya dengan cara yang sama, sesuai
kebutuhan.
4. Selanjutnya dimasukkan sebanyak 1ml suspensi dari setiap pengenceran ke dalam
cawan petri secara duplo.
5. Medium PDA dibuat sesuai jumlah yang dibutuhkan (baca aturan pembuatan pada
kemasan media). Setelah disterilkan medium didinginkan hingga temperatur 45°C ±
1°C, ditambahkan 15 - 20ml pada masing-masing cawan yang sudah berisi suspensi.
Supaya larutan sampel dan medium PDA tercampur seluruhnya, dilakukan

21 | P a g e
 pemutaran cawan ke depan dan ke belakang atau membentuk angka delapan dan
didiamkan hingga memadat.
6. Setelah medium padat, diinkubasikan pada suhu 25°C ± 1°C selama 5 hari (tanpa
dibalik)
7. Selanjutnya, dihitung koloni kapang/khamir (dapat dilakukan mulai hari ke tiga
sampai ke lima)
8. Dilaporkan atau dicatat hasil sebagai jumlah kapang/khamir dalam satuan koloni/g
sampel

Interpretasi Hasil
Pilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 10 –
150 koloni setiap cawan petri. Hitung semua koloni dalam cawan petri dengan
menggunakan colony counter. Hitung rata-rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor
pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah kapang/khamir dalam satuan koloni/g.

Keterangan :
Koloni kapang biasanya buram dan berbulu
Koloni khamir berwarna putih dan licin (berbau asam)
Tegaskan koloni dengan pemeriksaan di bawah mikroskop sehingga yakin bahwa koloni
tersebut adalah kapang / kamir.

Hasil
Lampirkan foto hasil pertumbuhan kapang/khamir pada masing-masing cawan petri

22 | P a g e
Perhitungan Pembuatan Media dan Perhitungan Hasil
Pembuatan media PDA

Angka kapang/ khamir ( koloni/g) = n x F

dengan:
n adalah rata – rata koloni dari dua cawan petri dari satu pengenceran
F adalah faktor pengenceran dari rata-rata koloni yang dipakai.

Pembahasan

23 | P a g e
Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(Eliya Mursyida, M.Si) ( )

24 | P a g e
 5. UJI PRESUMTIF (PENDUGA) MOST PROBABLE NUMBER (MPN)
COLIFORM PADA SAMPEL DAGING, TELUR DAN SUSU

Prinsip
Metode Most Probable Number (MPN) terdiri dari uji presumtif (penduga) dan uji
konfirmasi (penegas), dengan menggunakan media cair di dalam tabung reaksi dan
dilakukan berdasarkan jumlah tabung positif. Pengamatan tabung positif dapat dilihat
dengan timbulnya gas di dalam tabung Durham.

Tujuan
Mengetahui ada tidaknya cemaran kelompok bakteri Coliform pada sampel daging, telur
dan susu dengan pengujian menggunakan seri 3 tabung (ragam 3:3:3).

Alat dan Bahan

Alat : Tabung reaksi, tabung durham, erlenmeyer, kawat ose, lampu spritus, autoklaf,
inkubator, timbangan, gelas ukur, pipet ukuran 1ml, 10 ml, 25ml / mikropipet.
Bahan : contoh daging, telur, susu, media BPW (Buffered Pepton Water)/ BP
(Bacteriological Pepton), LSTB (Lauryl Sulfate Tryptose Broth ) / LB (Lactose Broth),
akuades, kapas, kasa.

Prosedur Kerja
1. Persiapan sampel
Sampel padat dan semi padat ditimbang sebanyak 5g atau sampel cair diukur
sebanyak 5ml secara aseptik kemudian dimasukkan ke dalam wadah steril.
2. Ditambahkan 45ml larutan pengencer BPW 0.1% / BP 0.1 % / NaCl 0.9%
fisiologis steril ke dalam wadah steril yang berisi contoh, dihomogenkan dengan
stomacher selama 1 menit sampai dengan 2 menit (kecuali untuk contoh susu
cair). Ini merupakan larutan dengan pengenceran 10-1.
3. Dipindahkan 1 ml larutan pengenceran 10-1 tersebut dengan pipet steril ke dalam
larutan 9 ml pengencer untuk mendapatkan pengenceran 10-2. Dengan cara yang
sama seperti di atas dibuat pengenceran 10-3.
4. Media LB triple dibuat untuk sebanyak 3 tabung reaksi, dan media LB single
sebanyak 6 tabung reaksi (untuk setiap kelompok). Masing-masing tabung reaksi

25 | P a g e
 diisi 10 ml media yang sudah berisi tabung durham dalam keadaan terbalik (cara
pembuatan media baca di kemasan media). Tabung reaksi dibolak balik hingga
tabung durham terisi oleh media dan tidak ada gelembung udara.
5. Tabung reaksi ditutup dengan kapas dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu
121ºC selama 15 menit.
6. Setelah proses sterilisasi selesai, media dikeluarkan dari autoklaf dan dibiarkan
dingin

7. Dipipet masing-masing 1 ml dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri tabung LB

yang berisi tabung Durham.
8. Diinkubasi pada temperatur 35 °C selama 24 jam sampai dengan 48 jam.
9. Diperhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham.

Perhitungan Pembuatan Media

26 | P a g e
Hasil
Diperhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham. Hasil uji dinyatakan
positif apabila terbentuk gas.

Tabung Tabung Tabung

No
Pengenceran 10-1 Pengenceran 10-2 Pengenceran 10-3

Pembahasan

27 | P a g e
Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(Eliya Mursyida, M.Si) ( )

28 | P a g e
 6. UJI KONFIRMASI (PENEGAS) MPN Coliform DAN MPN Escherichia coli

Prinsip
Metode Most Probable Number (MPN) terdiri dari uji presumtif (penduga) dan uji
konfirmasi (penegas), dengan menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi dan
dilakukan berdasarkan jumlah tabung positif. Pengamatan tabung positif dapat dilihat
dengan timbulnya gas di dalam tabung Durham.

Tujuan

Mengetahui ada tidaknya cemaran kelompok bakteri coliform dan bakteri Escherichia
coli pada sampel daging, telur dan susu dengan pengujian menggunakan seri 3 tabung
(ragam 3-3-3)

Alat dan Bahan

Alat : Tabung reaksi, tabung durham, erlenmeyer, kawat ose, lampu spritus, autoklaf,
inkubator, timbangan, gelas ukur.
Bahan : Media LB hasil inkubasi pada uji penduga, media BGLBB (Brilliant Green
Lactose Bile Broth), Media EC (Escherichia coli ) Broth, akuades, kapas, kasa

Prosedur Kerja Uji Peneguhan MPN Coliform

1. Disiapkan tabung reaksi berisi tabung durham sejumlah tabung reaksi yang
positif pada uji penduga
2. Masing-masing tabung reaksi diisi media BGLB sebanyak 10 ml (lihat cara
pembuatan media BGLB di kemasan media)
3. Pengujian selalu disertai dengan kontrol positif.
4. Dipindahkan biakan positif dari setiap media LB dengan menggunakan jarum
inokulasi ke dalam tabung BGLBB yang berisi tabung Durham.
5. Diinkubasikan pada temperatur 35 °C selama 48 jam ± 2 jam.
6. Diperhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham. Hasil uji
dinyatakan positif apabila terbentuk gas.
7. Selanjutnya digunakan tabel Most Probable Number (MPN) untuk
menentukan nilai MPN berdasarkan jumlah tabung BGLBB yang positif
sebagai jumlah koliform per mililiter atau per gram.

29 | P a g e
Prosedur Kerja Uji Peneguhan MPN Escherichia coli

1. Disiapkan tabung reaksi berisi tabung durham sejumlah tabung reaksi yang
positif pada uji penduga
2. Masing-masing tabung reaksi diisi media EC Broth sebanyak 10 ml (lihat cara
pembuatan media di kemasan media)
3. Pengujian selalu disertai dengan kontrol positif.
4. Dipindahkan biakan positif dari setiap media LB dengan menggunakan jarum
inokulasi ke dalam tabung EC Broth yang berisi tabung Durham.
5. Diinkubasikan pada temperatur 45,5 °C selama 24 jam ± 2 jam, jika hasilnya
negatif inkubasikan kembali selama 48 jam ± 2 jam
6. Diperhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham. Hasil uji
dinyatakan positif apabila terbentuk gas.
7. Selanjutnya digunakan tabel Most Probable Number (MPN) untuk
menentukan nilai MPN berdasarkan jumlah tabung EC Broth yang positif
sebagai jumlah koliform per mililiter atau per gram.

Perhitungan Pembuatan Media

Hasil
Diperhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham. Hasil uji dinyatakan
positif apabila terbentuk gas.

30 | P a g e
Tabel hasil uji MPN Coliform

Tabung Tabung Tabung

No
Pengenceran 10-1 Pengenceran 10-2 Pengenceran 10-3

MPN Coliform contoh =

Tabel hasil uji MPN Escherichia coli

Tabung Tabung Tabung

No
Pengenceran 10-1 Pengenceran 10-2 Pengenceran 10-3

MPN Escherichia coli contoh =

31 | P a g e
32 | P a g e
Pembahasan

Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(Eliya Mursyida, M.Si) ( )

33 | P a g e
 7. IDENTIFIKASI BAKTERI Escherichia coli PADA MEDIUM SPESIFIK

Tujuan
1. Menginokulasikan Escherichia coli pada media EMB agar, MC agar, dan endo
agar
2. Melihat koloni Escherichia coli pada media spesifiknya

Tinjauan Pustaka
Escherichia coli merupakan bakteri batang lurus Gram negatif (-), tidak
berspora, tidak berkapsul (ada yang berkapsul dan bergerak aktif / ada yang bergerak),
dengan pewarnaan Gram berwarna merah. Sel Escherichia coli mempunyai ukuran
panjang 2.0-6.0 mikron, lebar 1.1-1.5 mikron, tersusun tunggal, berpasangan, dengan
flagella peritikus. Escherichia coli tumbuh pada suhu antara 10-40ºC, dengan suhu
optimum 37ºC. pH optimum untuk pertumbuhannya adalah pada 7.0-7.5. Escherichia
coli memiliki susunan antigen yang terdiri dari antigen O (somatik), H (flagellar), dan K
(kapsul). Escherichia coli merupakan flora normal di dalam usus manusia dan akan
menimbulkan penyakit bila masuk ke dalam organ tubuh atau jaringan lain. Escherichia
coli dapat menimbulkan infeksi pada luka, bakteri ini juga diduga membantu pembuatan
vitamin K yang penting untuk pembekuan darah.
Escherichia coli mudah tumbuh pada media sederhana, yang dipakai sehari hari
umumnya dapat memfermentasi laktosa (ada juga yang memfermentasi ), menguraikan
glukosa menjadi asam dan gas (aerogenik), tetapi ada juga yang tidak (anaerogenik),
dan ada yang dapat memproduksi hidrogen sulfida.
Ciri-ciri koloni Escherichia coli pada beberapa media spesifik :
Blood agar plate : koloni sedang, abu abu, smooth, keping, haemolysis atau non
haemolysis.
MacConkey agar : koloni sedang, merah bata atau merah tua, metalic, smooth, keping
atau sedikit cembung.
EMB agar : koloni sedang , smooth, keping, kehijau - hijauan -hitam, metalic.
Endo agar : koloni besar, cembung ,bulat, merah tua, metalic.

34 | P a g e
 Gambar 1. Escherichia coli
Alat dan Bahan
Alat : Cawan petri, erlenmeyer, kawat ose, lampu spritus, autoklaf, inkubator,
timbangan.
Bahan : kultur Escherichia coli, akuades, media MacConkey (MC) agar, medium Eosin
Methylen Blue (EMB) agar, media Endo agar, kapas, kasa.

Prosedur Kerja
1. Medium MC agar ditimbang sebanyak 2,575g dilarutkan dengan 50ml akuades
dalam erlenmeyer (51.5g dalam 1000ml), dipanaskan hingga mendidih,
erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa.
2. Medium EMB agar ditimbang sebanyak 1,875 g dilarutkan dengan 50 ml
akuades dalam erlenmeyer (37.5g dalam 1000ml), dipanaskan hingga mendidih,
erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa.
3. Medium Endo agar ditimbang sebanyak 1.8g dilarutkan dengan 50ml akuades
dalam erlenmeyer (36g dalam 1000ml), ditambahlan larutan fuchsin dalam
etanol sebanyak 0.3ml (6ml untuk 1000ml) dipanaskan hingga mendidih,
Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa.
4. Cawan petri sebanyak sembilan buah dibungkus dengan kertas.
5. Media dan cawan petri disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15
menit.
6. Media yang sudah steril dituangkan sebanyak 15-20ml ke dalam cawan petri
steril, dibiarkan hingga membeku.
7. Kultur Escherichia coli dari media EC Broth yang positif diambil menggunakan
ose steril, digoreskan/ dioleskan pada permukaan masing-masing media agar
dengan gerosen sejajar atau sejajar melingkar.

35 | P a g e
 8. Media diinkubasi pada suhu 35 oC selam 18 jam sampai 24 jam.
9. Dilakukan pewarnaan Gram pada masing-masing koloni yang tumbuh

Hasil
Lihat hasil inokulasi Escherichia coli pada media MC agar, EMB agar, dan Endo agar.
Sesuaikan dengan ciri koloni bakteri Escherichia coli pada masing-masing media.
Lampirkan foto hasil inkubasi pada masing-masing media.

Pembahasan

36 | P a g e
Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(Eliya Mursyida, M.Si) ( )

37 | P a g e
8. IDENTIFIKASI BAKTERI Eschericia coli PADA MEDIA GULA-GULA DAN
MEDIA BIOKIMIA

Tujuan
1. Menginokulasikan Escherichia coli pada media gula-gula dan media biokimia
2. Melihat reaksi biokimia Escherichia coli pada media gula-gula dan media
biokimia

Tinjauan Pustaka
Uji biokimia dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme secara fisiologis
berdasarkan reaksi biokimia. Macam atau jenis biokimia dipengaruhi oleh faktor atau
sifat mikroorganisme, jenis media, dan faktor lingkungan. Uji biokimia pada identifikasi
bakteri berbentuk batang/ basil Gram negatif menggunakan uji gula-gula (glukosa,
laktosa, sukrosa, manosa, manitol) dan uji IMVIC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer,
Simmon’s Citrate)
Macam-macam uji biokimia yang umum digunakan untuk identifikasi bakteri :
1. Uji gula-gula
Tujuannya untuk melihat adanya pembentukan asam dan gas.
Reaksi biokimia :
Bakteri tertentu dapat memfermentasikan karbohidrat (glukosa, laktosa, sukrosa,
maltosa, manitol) menghasilkan asam-asam organik dan gas. Mikroorganisme
yang berbeda akan menggunakan karbohidrat yang berbeda tergantung dari
komponen enzim yang dimilikinya. Pembentukan asam ditandai dengan
perubahan warna indikator yang terdapat di dalam media pembenihan.
Perubahan warna dari merah menjadi kuning (indikator phenol red), perubahan
warna kuning menjadi merah (indikator metil red), perubahan warna dari hijau
menjadi kuning (indikator brom thymol blue/ BTB), perubahan warna dari ungu
menjadi kuning (indikator Bromocresol purple/ BCP). Terbentuknya gas
ditandai dengan adanya udara di dalam tabung peragian/ tabung durham.
2. Uji MR (Methyl Red)
Tujuannya untuk mengetahui terbentuknya asam hasil fermentasi karbohidrat.
Cara pengujiannya yaitu medium MR cair diinokulasi dengan bakteri uji lalu

38 | P a g e
 diinkubasi. Medium ditambahkan 5 tetes indikator merah metil (methyl red).
Hasil uji positif terbentuk warna merah dan uji negatif terbentuk warna kuning.
Reaksi biokimia :
Bakteri tertentu dapat memfermentasikan karbohidrat (glukosa) menghasilkan
asam. Adanya asam akan menyebabkan pH media dari 7,0 menjadi 4,4 sehingga
terbentuknya asam dapat diketahui dari warna indikator merah metil yaitu
terbentuknya warna merah (trayek pH 4,2-6,3).
3. Uji VP (Voges Proskauer)
Tujuannya untuk mengetahui terbentuknya acetoin (asetil metil karbinol). Cara
pengujiannya media VP cair diinokulasi dengan bakteri uji lalu diinkubasi.
Medium ditambah 5 tetes KOH (40%) lalu dikocok kuat dan ditambah 5 tetes
reagen Barrit atau reagen O’meara. Hasil uji positif terbentuk warna merah.
Hasil uji negatif terbentuk warna kuning.
Reaksi biokimia :
Bakteri tertentu dapat memfermentasikan glukosa menjadi acetoin melalui jalur
fermentasi butanadiol. Dalam suasana basa serta pengocokan yang kuat maka
acetoin dan butanadiol akan dioksidasi menjadi diasetil, yang akan bereaksi
dengan alfa naftol (dalam reagen barrit) atau kreatin (dalam reagen O’meara)
yang memberikan warna merah.
4. Uji PAD (Phenylalanine Deaminase)
Tujuannya untuk mengetahui adanya deaminasi fenilalanin. Cara ujinya media
PAD cair diinokulasi dengan bakteri uji, lalu diinkubasi. Medium ditambah HCl
0,1 N sampai tepat warna kuning lalu ditambah reagen FeCl3 (10%). Hasil uji
positif terbentuk warna hijau. Hasil uji negatif terbentuk warna kuning.
Reaksi biokimia :
Bakteri tertentu (contohnya, Proteus mirabilis) dapat melakukan deaminasi
fenilalanin menjadi piruvat yang akan bereaksi dengan FeCl3 sehingga terbentuk
warna hijau semi permanen.
5. Uji Sitrat
Tujuannya untuk mengetahui apakah bakteri dapat menggunakan sitrat sebagai
sumber karbon tunggal. Cara ujinya medium citrat agar (agar miring) diinokulasi

39 | P a g e
 secara gores dan tusukan lalu diinkubasi. Hasil uji positif medium berwarna
biru. Hasil uji negatif media tetap berwarna hijau.
Reaksi biokimia :
Jika bakteri dapat menggunakan natrium sitrat sebagai sumber karbon tunggal,
maka akan dibebaskan ion hidroksida yang bersifat basa. Dalam media citrat
mengandung indikator BTB (Brom Thymol Blue) dengan trayek pH 6,0-7,6.
Dalam suasana basa media akan berubah warna yang semula hijau menjadi biru.
6. Uji Urea
Tujuannya untuk mengetahui adanya enzim urease yang dihasilkan oleh bakteri.
Cara ujinya media urea agar (agar tegak) diinokulasi dengan bakteri uji secara
tusukan. Hasil uji positif media berwarna merah. Hasil uji negatif media
berwarna kuning.
Reaksi biokimia :
Bakteri tertentu (contohnya Proteus mirabilis) dapat menghasilkan enzim urease
yang akan menghidrolisis urea menjadi CO2 dan NH3. Akumulasi NH3
menyebabkan suasana basa, sehingga media yang mengandung indikator phenol
red yang semula berwarna kuning berubah menjadi merah.
7. Uji Sulfida, Asam, dan Gas
Tujuannya untuk mengetahui terbentuknya sulfida, asam, dan gas. Cara ujinya
medium KIA (Kliger’s Iron Agar) atau TSIA dalam bentuk agar miring
diinokulasi dengan bakteri uji secara gores dan tusukan lalu diinkubasi.
Hasil pengamatan
a. Sulfida
Hasil uji positif dengan terbentuknya warna atau endapan hitam. Hasil uji
negatif tidak terbentuk warna hitam.
b. Asam
Uji positif media berwarna kuning (A = asam) pada lereng atau dasar media.
Uji negatif media berwarna merah (K = alkali) pada lereng atau dasar media.
Jika lereng dan dasar media berwarna kuning ditulis A/A, bila lereng kuning
dan dasar media merah maka ditulis A/K, jika lereng dan dasar media merah
maka ditulis K/K.

40 | P a g e
 c. Gas
Uji positif medium agar retak atau terangkat. Uji negatif media agar tidak
retak
Reaksi biokimia :
Terbentuknya sulfida (H2S) atau terjadi reaksi antara ion S2- dan ion Fe3+ makan
akan terbentuk Fe2S3 (endapan hitam). Terbentuknya asam karena bakteri yang
dapat memfermentasikan glukosa dan laktosa dalam media KIA yang
mengandung indikator phenol red (merah fenol) dengan trayek pH (6,8-8,4)
sehingga dalam suasana asam media akan berubah yang semula orange menjadi
kuning.
8. Uji Sulfida, Indol, dan Motilitas
Tujuannya untuk mengetahui terbentuknya sulfida, indol, dan motilitas. Cara
ujinya medium SIM (Sulfida Indol Motilitas) dalam bentuk agar tegak
diinokulasi dengan bakteri uji secara tusukan lalu diinkubasi.
Hasil pengamatan
a. Sulfida
Hasil uji positif dengan terbentuknya warna atau endapan hitam. Hasil uji
negatif tidak terbentuk warna hitam.
b. Indol
Hasil uji positif dengan penambahan 5 tetes reagen kovacs atau reagen 5
tetes reagen Erlich terbentuk lapisan/ cincin berwarna merah pada
permukaan media. Hasil uji negatif tidak terbentuk lapisan/cincin berwarna
merah.
c. Motilitas
Uji positif terjadi pertumbuhan koloni merata pada media uji, uji negatif
hanya ada pertumbuhan koloni pada bekas tusukan saja.
Reaksi biokimia :
Terbentuknya sulfida (H2S) atau terjadi reaksi antara ion S2- dan ion Fe3+
makan akan terbentuk Fe2S3 (endapan hitam). Terbentuknya indol yaitu
triptophan dalam media bereaksi dengan H2S dan enzim triptophanase akan
terbentuk indol + piruvat + NH3 + reagen Kovacs (Erlich) membentuk para
dimetil aminobenzaldehid yang berwarna merah.

41 | P a g e
Ciri- ciri kultur Escherichia coli pada media gula-gula dan media biokimia. Hasil positif
pada media gula-gula ditandai dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham.
Glukosa :+
Laktosa : +/-
Mannitol :-
Maltosa :+
Sukrosa : +/-
Ciri-ciri kultur Escherichia coli pada media biokimia
TSI Agar : lereng : kuning/ asam (A)
Dasar : kuning/ asam (A)
Gas :+
SIM agar : H2S :+
Indol :+
Motility : aktif/brown (+/-)
Simmon’s citrate agar :-
Acetate agar :+
Urea agar :-
MR (Methyl Red) :+
VP (Voges Proskauer) :-
PAD (Phenylalanine deaminase) :-

Alat dan Bahan

Alat : Cawan petri, tabung reaksi, kawat ose, lampu spiritus, Erlenmeyer, timbangan,
autoklaf, inkubator.

42 | P a g e
Bahan : media laktosa, glukosa, sukrosa, maltosa, manitol, MR-VP, TSIA (Tripel
Sugar Iron Agar), Simon Citrat agar, SIM agar, Urea agar, indikator metil red, KOH,
reagen Barrit (1 gram alfa naftol dilarutkan dalam 100 mL etanol 96%), reagen Kovacs
(N-amyl alkohol 75mL + HCl pekat 25mL + 5g para dimetil amino benzaldehid) atau
reagen Erlich (2g para dimetil amino benzaldehid, 50 mL HCl 38%, akuades ad 1000
mL)

Prosedur Kerja
1. Pembuatan media glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, manitol
Media gula-gula dibuat masing-masing sebanyak 5ml dengan konsentrasi 1%
dalam media bakteriological pepton. Media gula-gula diteteskan indikator pH
BCP untuk melihat perubahan warna yang terjadi setelah diinkubasi. Media
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi tabung durham,
dipastikan tidak ada gelembung udara. Media ditutup kapas dan disterilkan.
2. Pembuatan medium MR-VP
Medium MR-VP dibuat sebanyak 100ml (17g dalam 1000ml), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5ml, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, didinginkan.
3. Pembuatan media TSIA
Media TSIA dibuat sebanyak 50ml (65g dalam 1000ml), lalu dipanaskan hingga
mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-
masing sebanyak 5ml, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa, disterilkan
dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, didinginkan dalam posisi
miring.
4. Pembuatan mediu Simon’s Citrat agar
Media SC agar dibuat sebanyak 50ml (23g dalam 1000ml), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, didinginkan dalam
posisi miring.

43 | P a g e
5. Pembuatan media SIM agar
Media SIM agardibuat sebanyak 50ml (30g dalam 1000mL), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, didinginkan dalam
posisi tegak.
6. Pembuatan medium Urea agar
Medium Urea agar dibuat sebanyak 50ml (2,4g dalam 95mL), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, didinginkan dalam
posisi tegak
7. Penanaman pada media gula-gula
Koloni bakteri pada media spesifik diambil menggunakan kawat ose steril,
dicelupkan dan dikocok ke dalam media gula-gula.
8. Penanaman pada medium MR-VP
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri dicelupkan dan dikocokkan ke
dalam media MR-VP.
9. Penanaman pada medium TSIA
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri ditusukkan pada tengah
medium TSIA hingga ke dasar medium, dan digoreskan zig zag pada permukaan
miring medium.
10. Penanaman pada medium Simon’s Citrat agar
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni ditusukkan pada tengah media hingga
ke dasar media dan digoreskan zig zag pada permukaan miring media Simon
Sitrat agar.
11. Penanaman pada media SIM agar

44 | P a g e
 Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri ditusukkan pada tengah media
SIM agar hingga ke dasar media.

12. Penanaman pada media Urea agar

Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri ditusukkan pada tengah media
urea agar hingga ke dasar media.
13. Media yang sudah diinokulasi dengan bakteri uji diinkubasi di dalam inkubator
pada suhu 35-37 oC selama 24-48 jam.
14. Setelah 24-48 jam diamati, jika perlu ditambahkan indikator atau reagen
tertentu, dicatat, dan difoto hasil pertumbuhan bakteri pada masing-masing
media.
15. Pembuatan indikator untuk medium MR  methyl red ditimbang sebanyak 0,4
gram dilarutkan dalam 100 mL akuades, disimpan dalam botol coklat bertutup
rapat.
16. Pembuatan indikator untuk media VP
 KOH ditimbang sebanyak 40g dilarutkan dalam 100mL akuades (40%)
 Reagen Barrit : Alfa naftol ditimbang sebanyak 1 gram dilarutkan dalam
100mL etanol 96% (1%)
 Penambahan pada medium VP  0,6mL alfa naftol 1% + 0,2mL KOH
40%

Perhitungan Pembuatan Medium

45 | P a g e
Hasil
No Media Hasil

1 Glukosa

2 Laktosa

3 Sukrosa

4 Maltosa

5 Manitol

6 MR

7 VP

8 TSIA

9 SC

10 SIM

11 Urea

Lampirkan foto media setelah diinkubasi

46 | P a g e
Pembahasan

Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(dr. Olvaria Misfa, M.Biomed) ( )

47 | P a g e
 9. IDENTIFIKASI Salmonella typhi PADA SAMPEL DAGING, TELUR, DAN
SUSU PADA MEDIA PENGAYAAN DAN MEDIA SPESIFIK

Tujuan
1. Menginokulasikan Salmonella typhi pada media pengayaan Selenith Broth dan
media spesifik Salmonella Shigella agar (SS agar)
2. Melihat koloni Salmonella typhi pada media SS agar

Tinjauan Pustaka
Salmonella adalah salah satu genus bakteri enterobakteria Gram
negatif berbentuk basil/batang. Salmonella dapat bergerak bebas dan
menghasilkan hidrogen sulfida, memiliki diameter 0,5-0,8 mikron dan panjang 1-3
mikron. Bergerak dengan flagell peritrik, tidak berselubung, tidak berspora. Salmonella
merupakan bakteri aerob dan fakulatif anaerob dan tumbuh hampir pada semua media
dengan pH 7,2 dan suhu 37oC. Struktur antigen dari Salmonella terdiri dari antigen H
(Heave) atau menyebar, antigen O (Omne Heave) atau tidak menyebar dan antigen vi
(Virulensi).
Tiga serotipe utama dari jenis Salmonella adalah S. typhi, S. typhimurium,
dan S. enteritidis. Salmonell typhi menyebabkan penyakit demam tifus (Typhoid fever),
karena invasi bakteri ke dalam pembuluh darah dan gastroenteritis, yang disebabkan
oleh keracunan makanan/intoksikasi. Gejala demam tifus meliputi demam, mual-mual,
muntah dan kematian. S. typhi memiliki keunikan hanya menyerang manusia, dan tidak
ada inang lain. Infeksi Salmonella dapat berakibat fatal kepada bayi, balita, ibu hamil
dan kandungannya serta orang lanjut usia. Hal ini disebabkan karena kekebalan tubuh
mereka yang menurun. Kontaminasi Salmonella dapat dicegah dengan mencuci tangan
dan menjaga kebersihan makanan yang dikonsumsi.
Ciri- ciri kultur Salmonell typhi :
SS agar : Koloni tidak berwarna, kecil-kecil, keping, smooth, bulat

Alat dan Bahan

Alat : Cawan petri, tabung reaksi, kawat ose, lampu spiritus, erlenmeyer, timbangan,
autoklaf, inkubator.

48 | P a g e
Bahan : Contoh daging, telur dan susu, media pengencer, media Selenith Broth,
Salmonella Shigella (SS) agar, MR-VP, TSIA, Simon’s Citrat agar, SIM agar, Urea
agar, indikator methyl red, KOH, reagen Barrit, reagen Kovacs.

Prosedur Kerja
1. Dilakukan persiapan dan homogenisasi contoh dengan cara contoh ditimbang
sebanyak 5 g atau dipipet sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam botol yang
telah berisi 45 ml larutan pengencer sehingga diperoleh pengenceran 1:10.
Campuran dikocok beberapa kali sehingga homogen.
2. Dibuat medium Selenit Broth (sebagai media pengayaan) sebanyak 100 ml (lihat
aturan pembuatan pada kemasan media), medium dimasukkan ke dalam tabung
reaksi sebanyak 10 ml.
3. Dipipet 1 ml larutan sampel, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi
medium pengayaan, diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 35-37oC selama 24
jam.
4. Diamati pertumbuhan bakteri ditandai dengan terjadinya kekeruhan pada media
pengayaan.
5. Selanjutnya dilakukan penanaman bakteri pada media spesifik Salmonella
Shigella (SS) agar. Medium SS agar dibuat sebanyak 200 ml (lihat aturan
pembuatan pada kemasan media 63 g dalam 1000 mL akuades), dipanaskan
sambil diaduk hingga agar larut. Tidak boleh disterilkan dalam autoklaf. Media
dituangkan sebanyak 20-25 ml ke dalam cawan petri steril, ditutup dan dibiarkan
membeku.
6. Dilakukan penanaman pada media SS agar dengan cara kawat ose steril
dicelupkan ke dalam kultur bakteri pada media Selenith Broth, digoreskan pada
permukaan media SS agar. Media diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 35-
37 oC selama 24-48 jam dengan posisi cawan terbalik. Dilakukan juga untuk
pembanding bakteri Salmonell typhi.
7. Diamati koloni yang tumbuh pada media SS agar, dilakukan pewarnaan Gram.
8. Kultur Salmonella typhi yang tumbuh pada media SS agar dilakukan pewarnaan
Gram, dan dilanjutkan dengan penanaman pada media biokimia.

49 | P a g e
Perhitungan Pembuatan Media

Hasil
Lampirkan foto hasil penanaman pada media pengayaan dan media spesifik

Pembahasan

50 | P a g e
Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(dr. Olvaria Misfa, M.Biomed) ( )

51 | P a g e
10. IDENTIFIKASI Salmonella typhi PADA MEDIA GULA-GULA DAN MEDIA
BIOKIMIA

Tujuan
1. Menginokulasikan Salmonella typhi pada media gula-gula dan media biokimia
2. Melihat reaksi biokimia Salmonella typhi pada media gula-gula dan media
biokimia
Tinjauan Pustaka
Reaksi Salmonella typhi pada media gula-gula dan media biokimia
Glukosa :+
Lactosa :-
Mannitol :+
Maltosa :+
Sukrosa :-
TSI Agar : lereng : merah/ alkali (K)
Dasar : kuning/ asam (A)
Gas : +/-
SIM agar : H2S :+
Indol :-
Motility : aktif (+)
Simmon’s Citrate agar : -/+
Urea agar :-
MR (Metthyl Red) :+
VP (Voges Proskauer) :-
PAD (Phenylalanine deaminase) : -

Alat dan Bahan

Alat : Cawan petri, tabung reaksi, kawat ose, lampu spiritus, erlenmeyer, timbangan,
autoklaf, inkubator.
Bahan : media laktosa, glukosa, sukrosa, maltosa, manitol, MR-VP, TSIA (Tripel Sugar
Iron Agar), Simon Citrat agar, SIM agar, Urea agar, indikator metil red, KOH, reagen

52 | P a g e
Barrit (1 g alfa naftol dilarutkan dalam 100 mL etanol 96%), reagen Kovacs (N-amyl
alkohol 75 mL + HCl pekat 25 mL + 5 g para dimetil amino benzaldehid) atau reagen
Erlich (2 g para dimetil amino benzaldehid, 50 mL HCl 38%, akuades ad 1000 mL)

Alat dan Bahan

Alat : Cawan petri, tabung reaksi, kawat ose, lampu spiritus, erlenmeyer, timbangan,
autoklaf, inkubator.
Bahan : media laktosa, glukosa, sukrosa, maltosa, manitol, MR-VP, TSIA (Tripel Sugar
Iron Agar), Simon’s Citrat agar, SIM agar, Urea agar, indikator methyl red, KOH,
reagen Barrit (1 gram alfa naftol dilarutkan dalam 100 mL etanol 96%), reagen Kovacs
(N-amyl alkohol 75 mL + HCl pekat 25 mL + 5 g para dimetil amino benzaldehid) atau
reagen Erlich (2 g para dimetil amino benzaldehid, 50 mL HCl 38%, akuades 1000 mL)

Prosedur Kerja
1. Pembuatan media glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, manitol
Media gula-gula dibuat masing-masing sebanyak 50 ml dengan konsentrasi 1%
dalam media bakteriological pepton. Media gula-gula diteteskan indikator pH
BCP untuk melihat perubahan warna yang terjadi setelah diinkubasi. Media
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi tabung durham,
dipastikan tidak ada gelembung udara. Media ditutup kapas dan disterilkan.
2. Pembuatan media MR-VP
Media MR-VP dibuat sebanyak 100 ml (17 g dalam 1000 mL), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5 mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit, didinginkan.
3. Pembuatan media TSIA
Media TSIA dibuat sebanyak 50 ml (65 g dalam 1000 mL), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5 mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit, didinginkan
dalam posisi miring.
4. Pembuatan media Simon Citrat agar

53 | P a g e
 Media SC agar dibuat sebanyak 50 ml (23 g dalam 1000 mL), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5 mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit, didinginkan
dalam posisi miring.
5. Pembuatan media SIM agar
Media SIM agardibuat sebanyak 50 ml (30 g dalam 1000 mL), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5 mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit, didinginkan
dalam posisi tegak.
6. Pembuatan medium Urea agar
Media Urea agar dibuat sebanyak 50 ml (2,4 g dalam 95 mL), lalu dipanaskan
hingga mendidih dan larut sempurna, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5 mL, ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa,
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, didinginkan dalam
posisi tegak
7. Penanaman pada media gula-gula
Koloni bakteri pada media spesifik diambil menggunakan kawat ose steril,
dicelupkan dan dikocok ke dalam media gula-gula.
8. Penanaman pada medium MR-VP
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri dicelupkan dan dikocokkan ke
dalam media MR-VP.
9. Penanaman pada medium TSIA
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri ditusukkan pada tengah
medium TSIA hingga ke dasar media, dan digoreskan zig zag pada permukaan
miring media.
10. Penanaman pada medium Simmon Citrat agar
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni ditusukkan pada tengah medium

54 | P a g e
 hingga ke dasar media dan digoreskan zig zag pada permukaan miring media
Simon Sitrat agar.
11. Penanaman pada media SIM agar
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri ditusukkan pada tengah media
SIM agar hingga ke dasar media.
12. Penanaman pada media Urea agar
Koloni bakteri diambil dengan kawat ose yang sudah dibakar di atas api spiritus
dan didinginkan. Kawat ose berisi koloni bakteri ditusukkan pada tengah media
urea agar hingga ke dasar media.
13. Media yang sudah diinokulasi dengan bakteri uji diinkubasi di dalam inkubator
pada suhu 35-37 oC selama 24-48 jam.
14. Setelah 24-48 jam diamati, jika perlu ditambahkan indikator atau reagen
tertentu, dicatat, dan difoto hasil pertumbuhan bakteri pada masing-masing
media.
15. Pembuatan indikator untuk media MR : metil red ditimbang sebanyak 0,4 gram
dilarutkan dalam 100 mL akuades, disimpan dalam botol coklat bertutup rapat.
16. Pembuatan indikator untuk media VP
 KOH ditimbang sebanyak 40 gram dilarutkan dalam 100 mL akuades
(40%)
 Reagen Barrit : Alfa naftol ditimbang sebanyak 1 gram dilarutkan dalam
100 mL etanol 96% (1%)
 Penambahan pada media VP : 0,6 mL alfa naftol 1% + 0,2 mL KOH
40%
Hasil
Lampirkan foto hasil penanaman pada masing-masing media

55 | P a g e
Tabel hasil penanaman pada media gula-gula dan media biokimia
No Media Hasil

1 Glukosa

2 Laktosa

3 Sukrosa

4 Maltosa

5 Manitol

6 MR

7 VP

8 TSIA

9 SC

10 SIM

11 Urea

Pembahasan

56 | P a g e
Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(dr. Olvaria Misfa, M.Biomed) ( )

57 | P a g e
 11. IDENTIFIKASI Staphylococcus aureus PADA SAMPEL SUSU
MENGGUNAKAN MEDIUM BLOOD AGAR DAN MSA

Tujuan
1. Menginokulasikan dan mengidentifikasi Staphylococcus aureus pada medium
Blood Agar dan Manitol Salt Agar (MSA)
2. Mengidentifikasi bakteri Staphylococcus aureus melalui pewarnaan Gram

Tinjauan Pustaka
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif berbentuk bulat,
berdiameter 1 µm tersusun dalam kelompok seperti anggur yang ridak teratur.
Staphylococcus aureus tumbuh dengan baik pada berbagai media bakteriologi pada
suasana aerobik atau mikroaerofilik. umbuh dengan cepat pada temperatur kamar ( -
C). oloni pada media ang padat berbentuk bulat lembut dan mengkilat.
Staphylococcus aureus biasanya membentuk koloni abu-abu hingga kuning emas. Pada
lempeng agar, koloninya berbentuk bulat, diameter 1-2 mm, cembung, buram,
mengkilat dan konsestemsinya lunak. Pada lempeng agar darah umumnya koloni lebih
besar dan pada vrietas tertentu koloninya dikelilingi oleh zona hemolysis.
Ciri-ciri koloni pada media Baird Parker Agar (BPA) dan media Manitol Salt Agar
(MSA) :
Pada BPA : Koloni cembung, warna koloni hitam mengkilat, dikelilingi daerah keruh.

Pada MSA : Koloni cembung, warna kuning dikelilingi daerah keruh dan medi
berubah menjadi kuning.

Alat dan Bahan

Alat : Cawan petri, tabung reaksi, kawat ose, lampu spiritus, erlenmeyer, timbangan,
autoklaf, inkubator, laminar air flow.
Bahan : Contoh susu segar, medium Blood Agar, medium Manitol Salt Agar (MSA),
H2O2 3%, reagen staphylase test.

58 | P a g e
Prosedur Kerja
1. Dibuat media agar darah/ blood agar sebanyak 150 ml dengan penambahan
darah domba sebanyak 5% (lihat cara pembuatan pada kemasan media), dituang
sebanyak 15-20 ml ml ke dalam cawan petri steril. Media dibiarkan membeku.
2. Diambil contoh susu menggunakan kawat ose steril, digoreskan secara zig-zag
pada permukaan media blood agar. Media diinkubasi di dalam inkubator pada
suhu 37 oC selama 24-48 jam dengan posisi cawan terbalik. Diamati koloni yang
tumbuh pada media blood agar.
3. Pembuatan media MSA
Media MSA dibuat sebanyak 150 ml (lihat cara pembuatan pada kemasan
media/ 111g dalam 1000 mL). Media MSA ditimbang, dilarutkan dengan 150 ml
akuades, dipanaskan hingga mendidih sambil diaduk, disterilkan dalam autoklaf.
Media dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak 15-20 mL, dibiarkan
membeku.
4. Kultur Staphylococcus aureus ditanam pada media MSA dengan cara
digoreskan pada permukaan media, diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37
o
C selama 24-48 jam dengan posisi cawan terbalik. Diamati koloni yang tumbuh
pada medium MSA.
5. Dilakukan pewarnaan Gram terhadap koloni yang tumbuh pada medium MSA
6. Dilakukan juga menggunakan pembanding bakteri Staphylococcus aureus

Perhitungan Pembuatan Medium

59 | P a g e
Hasil
Lampirkan foto media setelah diinkubasi

Pembahasan

60 | P a g e
Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(dr. Olvaria Misfa, M.Biomed) ( )

61 | P a g e
12. UJI KATALASE DAN UJI KOAGULASE TERHADAP Staphylococcus aureus

Tujuan
Mengetahui hasil uji katalase dan uji koagulase terhadap Staphylococcus aureus

Tinjauan Pustaka
Fungsi uji katalase pada bakteri berbentuk kokus adalah untuk membedakan
antara staphylococcus dan streptococcus, dimana kelompok staphylococcus bersifat
katalase positif. Katalase merupakan enzim yang mengkatalisa penguraian hidrogen
peroksida menjadi H2O dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena
bahan ini menginaktifkan enzim dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu
metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob
pasti menguraikan bahan tersebut. Semua galur staphylococcus adalah katalase positif.
Uji koagulase bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri menghasilkan
enzim koagulase. Produksi koagulase adalah kriteria yang paling umum digunakan
untuk identifikasi Staphylococcus aureus. Reaksi koagulase positif sangat penting untuk
membedakan S. aureus dengan spesies staphylococcus yang lain. Koagulase merupakan
protein ekstraseluler yang dihasilkan oleh S. aureus yang dapat menggumpalkan plasma
dengan bantuan faktor yang terdapat dalam serum. Oleh karena itu peran koagulase
yang dihasilkan oleh S. aureus dapat digunakan sebagai sarana diagnostik

Alat dan Bahan

Alat : kaca objek, pipet tetes, kawat ose, lampu spiritus, laminar air flow.
Bahan : Kultur Staphylococcus aureus pada media Manitol Salt Agar (MSA), H2O2 3%,
reagen staphylase test.

Prosedur Kerja
1. Uji katalase
 Disiapkan kaca objek yang bersih, kering, dan bebas lemak
 Diambil 1-2 ose koloni bakteri, diletakkan pada permukaan kaca objek
 Ditambahkan 1-2 tetes H2O2 3%, dihomogenkan
 Interpretasi hasil : (+) terjadi gelembung gas

62 | P a g e
 (-) tidak terjadi gelembung gas.
2. Uji koagulase
 Disiapkan kaca objek yang bersih, kering, dan bebas lemak
 Diambil 1-2 ose koloni bakteri, diletakkan pada permukaan kaca objek
 Ditambahkan 1-2 tetes plasma citrat/ staphylase test secara aseptis, diaduk dan
dihomogenkan
 Interpretasi hasil : (+) terjadi aglutinasi
(-) tidak terjadi aglutinasi

Hasil

Pembahasan

63 | P a g e
Kesimpulan

Saran

Pekanbaru,............................
Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikan

(dr. Olvaria Misfa, M.Biomed) ( )

64 | P a g e
 DAFTAR PUSTAKA

Badan Standardisasi Nasional. 2008. Standar Nasional Indonesia Nomor 3756 Tentang
Selai Buah.
Badan Standardisasi Nasional. 2008. Standar Nasional Indonesia Nomor 2897 Tentang
Metode Pengujian Cemaran Mikrobiologi Dalam Daging, Telur dan Susu, Serta
Hasil Olahannya.
Cappuccino, J.G dan Sherman, N. 2013. Manual Laboratorium Mikrobiologi. Edisi
Delapan. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Dewi, A. K. 2013. Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas Staphylococcus aureus
terhadap Amoxicillin dari Sampel Susu Kambing Peranakan Ettawa (PE)
Penderita Mastitis Di Wilayah Girimulyo, Kulonprogo, Yogyakarta. Jurnal Sain
Veteriner. Vol 31 (2), Desember 2013.

Harti, A. S. 2015. Mikrobiologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Andi.

Jawetz, Melnick, & Adelberg. 2012. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Penerbit Buku
Kedokteran EGC.

65 | P a g e