ELISA KIT

ELISA merupakan salah satu jenis uji serologis yang dapat digunakan untuk
identifikasi atau mendeteksi antibodi dan antigen. Prinsip uji serologi ELISA adalah antibodi
atau antigen yang telah dikonjugasi dengan enzim, kemudian enzim akan menginduksi
perubahan warna bila ditambahkan substrat yang sudah diberi pewarna (kromogen) yang
kemudian kepekatan warnanya diukur oleh alat ELISA Reader.

ELISA KIT yang digunakan dalam pengujian kali ini merupakan Rat Esterogen
ELISA KIT. Cara menyimpan KIT ini dalam suhu 2-4 oC namun dalam waktu yang lama
disimpan pada suhu -20 oC. Tipe ELISA KIT ini adalah Sandwich kit yang mendeteksi
Esterogen tikus dalam serum, plasma, supernatan sel kultur, jaringan.

Alat dan bahan yang digunakan yaitu serum tikus, micropipet, 1 set ELISA Kit , dan
ELISA reades, inkubator, penampung limbah, air. ELISA kit terdiri dari Standard solution,
pre-coated ELISA plate, Standard diluted, Streptavidin-HRP, Stop solution, Substrate
Solution A, Substrat Solution B, Wash Buffer Concentrate (30x), Biotin-Conjugate Anti-Rat E
Antibody, Plate Sealer, Zipper Bag dan User Instruction.

Prosedur pengujian sampel menggunakan ELISA KIT dilakukan setelah menyiapkan

semua alat dan bahan. Suhu alat dan bahan disesuaikan suhu ruangan sebelum digunakan.
Sumur disiapkan untuk pengujian sampel. Pada sumur A1 dikosongkan, sumur B1 dan C1
sebagai kontrol positif, sumur D1, E1, dan F1 sebagai kontrol negatif. Sumur A1 hingga F10
dipersiapkan sebagai sumur kontrol diberikan larutan standar sebanyak 50 mikroliter
kemudian sisa sumur diisikan 40 mikroliter sampel (serum tikus) dan 10 mikro liter anti E-
antibodi. Seluruh sumur diberikan 50 mikro liters streptavidin-HRP kecuali sumur yang
sengaja dikosongkan di awal. Plate ditutup dengan sealer dan diinkubasi 60 menit pada suhu
37 oC. Setelah waktu inkubasi selesai, sealer dibuka, sumur dicuci menggunakan buffer
sebanyak 5 kali dan tiap mencuci larutan dibuang ke penampung. Sebanyak 50 mikroliter
substrat solution A dan substrat solutin B ditambahkan ke tiap substrat. Inkubaasi plate
dengan sealer selama 10 menit pada suhu 37 oC. Jika telah selesai, diberikan Stop Solution
sebanyak 50 mikroliter, akan ada perubahan warna biru menjadi kuning. Selanjutnya
menentukan optical density (OD value) masing-masing sumur menggunakan ELISA reader.

Gambar 1. Micropalte yang siap diperiksa menggunakan ELISA reader.

 Gambar 2. Hasil pembacaan menggunakan ELISA reader

Prinsip metode ELISA untuk pemeriksaan esterogen adalah hormon esterogen pada
sampel akan berikatan dengan E-antibodi yang telah dicoating pada permukaan sumur.
Setelah dicuci dengan cairan washing solution, protein yang tidak berikatan dengan antibodi
pada dinding sumur akan tercuci dan dibuang. Kemudian diberikan antibodi ke dua yang
telah dikonjugasi dengan enzim horsedish peroxidase (HRP) yang akan berikatan dengan
esterogen yang sebelumnya berikatan dengan E-antibodi pada dinding sumur dan membentuk
kompleks antibodi-antigen-antibodi. Setelah pencucian yang ke dua untuk membuang
antibodi yang tidak berikatan, diberikan substrat solution A dan B sehingga enzim akan
mengolah substrat kemudian terjadi perubahan warna pada cairan dalam sumur dengan
gradasi warna berbeda sesuai dengan konstrasi estrogen dikandungnya. Pengukuran pada
hasil ELISA menggunakan mesin ELISA reader yang prinsipnya sama dengan mesin
spektrofotometer.