Disusun oleh :
Rahma Ayu Larasati (1606839845)
Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen
tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen
Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi
monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
Buang sampel dari well dengan cara dibalikkan dan diketuk-ketukkan pada
tisue.
Masukkan 70 ul washing buffer (PBS 0,05% Tween)
Buang lalu ketuk-ketukkan pada kertas tissue
Ulang pencucian sebanyak tiga kali
Tahap 3 Blocking
- Berikan blocking berupa skim milk 5% sebanyak 70 l pada masing masing
-
well
Lalu inkubasi kembali selama 1 jam pada suhu 37 C
Tahap 4
Lakukan pencucian seperti diatas sebanyak 3 kali
Tahap 5 : penambahan antibody I
Tambahkan 50 l antibodi pasca vaksinasi (+) pada ABCD (1-6) dan 50 l antibodi(-)
pada ABCD (7-12)
Sebelumnya dilakukan pengenceran terhadap antibody dengan cara
1. Mengambil 200 l dari microtube 1
2. Tambahkan ke microtube 2 lalu dilakukan dilution fold
3. Ambil 200 l dari microtube 2 lalu tambahkan ke mcrotube 3 begitu seterusnya
sampai tabung ke 6
4. Buang 200 l antibody terakhir
5. Maka didapatkan pengenceran antibody berupa . 1 - - 1/8 1/16 1/32
Inkubasi semalam pada suhu 4o c
Tahap 6
Lakukan pencucian seperti cara diatas sebanyak 3 kali
Tahap 7 penambahan antibody II
1. Masukkan antibodi anti rabbit berlabel biotin dengan pengenceran 1/100 di
semua sumur sebanyak 50 ul
2. Inkubasi selama 1 jam pada suhu 37o C
Tahap 8
Kemudian lakukan pencucian sebanyak 3 kali
Tahap 9 Penambahan Enzim
1. Tambahkan 50 ul 1/5000 stretavidine HRP
2. Inkubasi selama 1 jam di suhu 37o C
Tahap 10
Lakukan pencucian sebanyak 3 kali
E. Hasil Pengamatan
No
A
1
2
3
4
5
0.714
0.566
0.45
0.417
0.268
50 ng/ml
25 ng/ml
B
average
C
D
average
0.71
0.712
0.67
0.673
0.6715
0.549
0.5575
0.611
0.533
0.572
0.417
0.4335
0.554
0.486
0.52
0.427
0.422
0.5
0.476
0.488
0.266
0.267
0.3
0.256
0.278
0.21
0.204
7
8
9
10
11
12
0.06
0.058
0.058
0.058
0.058
0.065
0.061
0.065
0.051
0.061
0.063
0.068
0.207
Kontrol
0.0605
0.0615
0.0545
0.0595
0.0605
0.0665
0.19
0.183
0.1865
0.055
0.058
0.054
0.054
0.055
0.055
0.056
0.058
0.056
0.056
0.055
0.061
0.0555
0.058
0.055
0.055
0.055
0.058
Kemudian Kurva hasil dari perhitungan tersebut dapat digambarkan sebagai berikut :
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
50 ng/ml
OD 490 0.3
25 ng/ml
0.2
kontrol 1
0.1
kontrol 2
Pengenceran Antibodi
Hasil ELISA pada serum kelinci sesudah diimunisasi secara umum memperlihatkan
nilai OD yang tinggi (OD berkisar antara 0,710 0,714). Hal ini dapat dilihat pada plate
ABCD nomor 1 6. Nilai rata-rata aktivitas respon antibodi tertinggi terdapat pada serum
kelinci yang diimunisasi oleh protein rekombinan ditunjukkan pada serum kelinci
pengenceran 1/25 dengan konsentrasi antigen 50 g/ml, yaitu 0,714. Nilai tersebut jauh lebih
tinggi dibandingkan dengan nilai OD serum kelinci sebelum diimunisasi. Nilai OD serum
yang dihasilkan kelinci sebelum diimunisasi ( kontrol ) hanya berkisar antara 0,0551
0,0680. Hal tersebut membuktikan bahwa telah terjadi peningkatan respon imun di dalam
tubuh kelinci terhadap antigen yang diimunisasikan ke dalam tubuh kelinci. Semakin besar
konsentrasi antigen dan semakin kecil pengencerannya maka nilai optical density-nya makin
besar.
G. Kesimpulan
Pada praktikum ini didapatkan konsentrasi antigen E. coli yang optimal yaitu 50 g/ml
dan pengenceran antibodi spesifiknya adalah 1/25. Semakin besar konsentrasi antigen dan
semakin kecil pengencerannya maka nilai optical density-nya makin besar.
PRAKTIKUM 2
UJI HEMAGLUTINASI (HA)
A. Tujuan Praktikum
Mengukur titer HA sediaan virus influenza yang akan digunakan untuk uji hambatan
agutinasi (HI).
B. Landasan Teori
Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme biologis.
Virus bersifat parasit obligat, hal tersebut disebabkan karena virus hanya dapat bereproduksi
di dalam material hidup dengan menginvasi dan memanfaatkan sel makhluk hidup karena
virus tidak memiliki perlengkapan selular untuk bereproduksi sendiri. Biasanya virus
mengandung sejumlah kecil asam nukleat (DNA atau RNA, tetapi tidak kombinasi keduanya)
yang diselubungi semacam bahan pelindung yang terdiri atas protein, lipid, glikoprotein, atau
kombinasi ketiganya. Beberapa virus manusia mempunyai kemampuan untuk berikatan
dengan permukaan sel darah merah sehingga terjadi aglutinasi.
Kemampuan ini merupakan contoh dari aktivitas biologik virus. Sisi partikel virus yang
spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan
sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi
tampak.
Banyak virus yang menghemaglutinasi eritrosit dan reaksi tersebut secara spesifik dapat
dihambat oleh sistem imun dan sistem konvalesen. Reaksi ini merupakan dasar dari banyak
tes diagnostic pada infeksi infeksi virus.
Hemaglutinasi dalah reaksi pengikatan antigen virus dengan sel darah merah. Jenis eritrosit
berbeda tergantung dari jenis virusnya, yaitu;
a. Virus influenza menghemaglutinasi eritrosit cavia (marmut), eritrosit ayamdan
b.
c.
D. Cara Kerja
10
11
12
A
B
C
D
Kontrol positif
Kontrol negatif
1.
2.
3.
4.
untuk mengaduk)
ambil 50 l campuran tadi dari sumur A2 lalu masukkan ke sumur A3, lakukan
12
A
B
Kontrol negatif
10
11
12
A
B
C
D
pengenceran serum tertinggi hasil positif (titik merah pada dasar sumur di plate yang
digunakan).
Ukuran HAU ini menunjukkan unit operasional yang digunakan untuk mengaglutinasi
sel darah merah ayam pada volume yang sama. Hasil positif ditunjukkan dengan larutnya sel
darah merah pada sumur sehingga tidak terjadi endapan. Sebaliknya, hasil negatif
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan sel darah merah (titik merah) pada dasar sumur.
Pada praktikum kali ini hasil negatif berupa munculnya titik merah (endapan) pada dasar
sumur ditunjukkan pada sumur A1 - A4 dan B1. Hasil duplo dari praktikum ini tidak sama,
hal tersebut dikarenakan keadaan virus yang digunakan sudah tidak stabil karena cukup lama
dibiarkan dalam suhu ruang. Hasil positif didapatkan pada sumur A5 A12.
10
11
12
A
Gambar 5. Skema Penetapan HAU
G. Kesimpulan
Unit HA tidak menunjukkan jumlah absolute virus, namun suatu unut operasional
yang digunakan untuk titrasi HA. Unit HA didefinisikan sebagai jumlah virus yang
diperlukan untuk mengaglutinasi larutan SDM yang telah distandarisasi pada volume yang
sama. Uji ini penting untuk menentukan volume antigen terstandard yang diperlukan untuk
uji HI. Pada praktikum didapatkan sediaan virus yang mengandung titer 8 HAU yang akan
digunakan untuk uji hambatan agutinasi (HI) berada pada well A1, sehingga tidak perlu
pengenceran.
PRAKTIKUM 3
UJI HEMAGLUTINASI INHIBISI (HI)
A. Tujuan Praktikum
Untuk mengetahui titer anti hemaglutinin terhadap serum penderita dengan
menggunakan antigen yang sudah ditetapkan pada uji HA.
B. Landasan Teori
Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme biologis.
Virus bersifat parasit obligat, hal tersebut disebabkan karena virus hanya dapat bereproduksi
di dalam material hidup dengan menginvasi dan memanfaatkan sel makhluk hidup karena
virus tidak memiliki perlengkapan selular untuk bereproduksi sendiri. Biasanya virus
mengandung sejumlah kecil asam nukleat (DNA atau RNA, tetapi tidak kombinasi keduanya)
yang diselubungi semacam bahan pelindung yang terdiri atas protein, lipid, glikoprotein, atau
kombinasi ketiganya.Virus dapat berikatan pada permukaan sel darah merah sehingga
terbentuk reaksi aglutinasi.
Tes aglutinasi dapat dimodifikasi untuk pemeriksaan antigen yang terlarut , tes ini disebut
hemaglutinasi inhibisi . disebut hemaglutinasi inhibisi karena dapat mengukur kemampuan
antigen yang terlarut untuk menghambat aglutinasi antara antigen dengan eritrosit oleh
antibodi . Jika sempel mengandung antigen , antigen terlarut akan bersaing dengan eritrosit
untuk berikatan dengan antibody , sehingga menghambat aglutinasi sel darah merah dengan
menipiskan atau mengencerkan sample , anda dapat menghitung jumlah antigen melalui titer
pada sempel yang belum diketahui .
Hemaglutinasi inhibisi merupakan yang diinduksikan oleh virus sebagai prosedur untuk
mengidentifikasi hemaglutinasi oleh virus atau metode untuk mengukur kensentrasi dari
antigen terlarut dalam specimen biologis dimana specimen diinduksi dengan antibody
spesifik dan kemudian dengan eritrosit .
C. Alat dan Bahan
Alat:
1. Microplate dengan dasar berbentuk V
2. Micropipet single channel 20-200 l
3. Yellow tip 100 L
Bahan:
1. PBS (Phosphat Buffer Saline)
2. Antigen (sequence H1N1 inactivated)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
juga dari B1 B7
7. Lakukan dilution fold 25 l antibodi negatif ke kanan mulai dari A7 A12, demikian
juga dari B7 B12
8. Tambahkan 25 l antigen 8HAU ke masing masing well kecuali C1&C2 ( control)
9. Inkubasi 30 menit
10. Tambahkan 50 l RBC ke semua well, inkubasi kembali selama 30 menit
11. Baca hasil
E. HASIL
10
11
12
A
B
C
D
Antigen virus antibodi serum dan eritrosit ditambahkan dengan perbandingan yang
sama sehingga terjadi ikatan antigen dan antibodi saja , tidak terjadi ikatan antara antigen
dengan eritrosit . Sehingga tidak terbentuk hemaglutinasi , hal ini menunjukkan tes
hemaglutinasi inhibisi positif .
Namun pada hasil yang didapatkan saat praktikum hampir semua plate menunjukkan
hasil positif, tidak ada reaksi hemaglutinasi yang terlihat.
F. Pembahasan
sampai dengan kira-kira 300 nm ) yang hanya memiliki 1 jenis asam nukleat (RNA
atau DNA ) sebagai genom. Asam nukleat terbungkus mantel protein yang dikelilingi
oleh membrane dari lipid. Asam nukleat virus mengandung informasi penting untuk
dapat menghasilkan keturunannya yaitu dengan cara memprogram sel inang yang
diinfeksinya agar mensintesis makromolekul virus spesifik.
Pada pratikum ini dilakukan pemeriksaan hemaglutinasi inhibition dimana
tujuan dari pratikum ini adalah untuk mengetahui titer HI yang masih dapat
menghambat aktivitas hemaglutinasi virus secara sempurna.
Prinsip dari pratikum hemaglutinasi inhibition adalah antigen virus antibodi
serum dan eritrosit ditambahkan dengan perbandingan yang sama sehingga terjadi
ikatan antigen dan antibodi saja , tidak terjadi ikatan antara antigen dengan eritrosit .
Sehingga tidak terbentuk hemaglutinasi , hal ini menunjukkan tes hemaglutinasi
inhibisi positif .
Hemaglutinasi inhibisi merupakan yang diinduksikan oleh virus sebagai
prosedur untuk mengidentifikasi hemaglutinasi oleh virus atau metode untuk
mengukur kensentrasi dari antigen terlarut dalam specimen biologis dimana specimen
diinduksi dengan antibody spesifik dan kemudian dengan eritrosit . Pada pemeriksaan
ini hemaglutinasi inhibition menggunakan antigen 8 HA. Pemeriksaan hemaglutinasi
inhibition pertama-tama dimasukksan PBS pada microwell dan selanjutnya
ditambahkan
serum
yang
kemudian
dilakukan
pengenceran
dengan
cara
mengikat antibody sampai titer 1/2. Dimana hasil positif ditunjukkan dengan
terdapatnya titik pada dasar well yang dikarenakan sel darah merah mengendap
sedangkan antibody berikatan dengan virus. Pemeriksaan hemaglutinasi inhibition ini
selain untuk mengidentifikasi virus juga digunakan untuk menentukan kekebalan
hewan terhadap suatu agen ( virus) melalui pengukuran titer antibody spesifik dalam
serum hewan tersebut.
G. KESIMPULAN
Pada hasil praktikum ini tidak dapat ditentukan titer virus karena didapatkan hasil positif pada
semua sumur. Terjadi kesalahan dimana pada serum negative juga mengalami aglutinasi.
Sehingga hasil positif juga terjadi pada serum negative. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh
berbagai factor antara lain :
- Serum negative terjadi kontaminasi pada saat proses pengerjaan
- Human error pada saat proses pippeting dan diluting
- Terjadi kesalahan pada saat awal pembentukan antibodi