MAKALAH PENGUKURAN HORMON MATA KULIAH ENDOKRINOLOGI

Disusun oleh : LUTFIYAH 3415102430

Pendidikan Biologi Reguler 2010 Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Jakarta 2013

Pendahuluan Hormon adalah produk system endokrin. Disamping organ endokrin yang sudah dikenal luas seperti hipotalamus, hipofisis, tiroid, paratiroid adrenal, testis, ovarium dan pancreas sekarang diketahui bahwa ada banyak organ lain yang juga dapat mengeluarkan hormon seperti jantung, sel adiposity, dan lain-lain. Pada beberapa keadaan dan penyakit yang berkaitan dengan organ endokrin atau kadar hormon maka diperlukan pengukuran kadar hormon tertentu. Pengukuran kadar hormon merupakan sebagian kecil dari pemeriksaan laboratorium. Sebabnya adalah karena disamping pemahaman kelainan dan penyakit endokrin masih merupakan keahlian tersendiri yang belum banyak ahlinya. Indikasi pemeriksaan kelainan endokrin, juga belum siapnya laboratorium klinik atau rumah sakit untuk melakukan pengukuran hormon. Dibandingkan dengan zat bukan hormon misalnya kadar kolesterol dan glukosa yang dinyatakan dalam mg/dl, kadar hormon amat rendah dan dinyatakan dalam ug, ng atau pg. kadar yang kecil ini memerlukan teknik pemeriksaan yang canggih. Perkembangan teknologi pemeriksaan laboratorium dengan bioassay, bermacam-macam immunoassay, dan teknik dengan alat spektrometri telah membuka kemungkinan pengukuran kadar hormon. Namun teknik yang canggih tentunya juga mahal sehingga tidak semua dapat melakukannya. Jumlah permintaan yang masih sedikit serta batas kadaluwarsa reagen setelah dibuka membuat biaya pengukuran menjadi makin mahal yang membatasi jumlah pemeriksaan dan seterusnya. Pengukuran kadar hormon seperti juga pemeriksaan zat lain memerlukan perhatian dalam pra analitik dan analitiknya.

PRA ANALITIK PENGUKURAN HORMON Tahap pra analitik meliputi persiapan pasien, pengambilan sampel, dan pengiriman sampel ke laboratorium pemeriksaan, proses pemisahan serum atau plasma serta penyimpanan sampel. Semua factor perlu dilakukan agar hasil pemeriksaan dapat diinterpretasikan secara baik dan berguna. Pada persiapan pasien perlu ditentukan apakah puasa atau tidak, makanan dan minuman tertentu, merokok, alcohol, obat-obatan tertentu, juga kerja fisik atau olahraga waktu pengambilan sampel dikaitkan dengan variasi normal. Pada pengambilan sampel perlu diperhatikan posisi badan pasien, lama dan kuatnya pembendungan, jenis antikoagulan, apakah perlu perlakuan khusus seperti pendingin.

Perubahan posisi badan dari tegak ke berbaring atau sebaliknya akan memyebabkan perubahan jumlah cairan dalam pembuluh darah karena perpindahan sebagian plasma ke jaringan interstisial. Akibatnya akan terjadi perubahan kadar analit terutama yang berukuran molekul besar seperti protein. Kadar analit yang berkaitan dengan protein juga akan ikut berubah. Demikian pula pembendungan yang selalu kuat dan lama akan meyebabkan perembesan sebagian plasma keluar pembuluh darah dengan akibat seperti pada posisi badan. Beberapa jenis analit seperti hormon tertentu memerlukan perhatian dan perlakuan khusus sejak sampel diambil. Untuk sampel darah ada yang sudah harus didinginkan pada suhu 4Oc sejak darah diambil sampel diperiksa atau sampel serum atau plasma dipisahkan dari sel darah. Contohnya pada hormon gastrin dan renin. Sejak pengumpulan darah sampai transportasinya ke laboratorium baik dengan kurir atau dengan system angkutan seperti pneumatic tubeharus dijaga agar darah jangan sampai mengalami hemolysis. Pemisahan serum atau plasma sebaiknya dilakukan sebelum 2 jam dari waktu pengambilan darah. Hal ini disebabkan eritrosit dan sel darah yang masih hidup masih melakukan metabolism dan dapat mempengaruh kadar analit dalam serum atau plasma. Akan tetapi pemisahan tersebut sebaiknya setelah terjadi retraksi bekuan sempurna. Bila pengambilan sampel darah dilakukan ditempat yang cukup jauh dari laboratorium pemeriksa maka pemisahan serum atau plasma sebaiknya dikerjakan ditempat pengambilan dan baru serum atau plasmanya yang dikirim ke laboratorium pemeriksa. Untuk analit yang perlu pendingin maka pemusingan dilakukan dengan centrifuge berpendingin. Sampel sering perlu disimpan disebabkan belum dapat dikerjakan segera karena ada jadwal tertentu dan juga untuk keperluan pengukuran ulang bila diperlukan. Untuk hormon perlu diperhatikan beberapa factor tergantung jenis hormon yang diperiksa. Hormon steroid relative stabil sampai 3 hari bila disimpan pada suhu kamar. Hormon peptide perlu disimpan dalam keadaan beku bila tidak diperiksa pada hari pengambilan sampel. Hal ini berlaku untuk hormon yang tidak stabil seperti ACTH, renin, peptide intestinal vasoaktif, insulin, hormon pertumbuhan dan kalsitonin.

Tabel. 1 Daftar hormon dan perlakuan khusus yang diperlukan pada pengambilan sampel dan penyimpanan

Hormon ACTH Aldosteron Androsiadione Calcitonin Cortisol 11-Deoxycortisol Estradiol Gastrin 17-Hydroxyprogesteron Insulin Parathyroid Hormon Palacental lactogen Prolactin Renin

Antikoagulan Heparin

Perlakuan Khusus Bekukan dalam 15 menit pengambilan Bekukan atau + borat Sampel diambil pagi hari Bekukan

Heparin Heparin Heparin

Pisahkan segera Pisahkan segera Bekukan Puasa, bekukan Pengambilan antara jam 09.00-10.00 Puasa, bekukan Bekukan Bekukan Bekukan

EDTA

Dinginkan centrifuge

sewaktu

pengambilan

TAHAP ANALITIK PENGUKURAN KADAR HORMON Pengukuran kadar hormon dilakukan dengan banyak cara yakni secara biologis, kimiawi , immunologis. Cara bioassay kurang teliti dan jarang dipergunakan sehari-hari. Cara yang banyak digunakan secara rutin adalah cara immunoassay, umumnya menggunakan antibody berlabel (immunometric). Antibodi monoclonal yang digunakan satu atau dua jenis, ditujukan kepada epitope berbeda pada molekul protein. Dikenal cara radioimmunoassay, enzyme immunoassay, immunoradiometric assay, immune-

chemiluminescence assay. Teknik instrumental dengan spektrometri massa yang digabungkan dengan kromatografi cair atau gas merupakan teknik yang baik dan kuat baik kualitatif maupun kuantitatif. Spektrometri massa tendem baik untuk memeriksa

sekaligus beberapa jenis hormon yang terkait untuk suatu situasi klinis tertentu, sebagai suatu panel.

Jenis Pemeriksaan Immunoassay

1. Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang nonspesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk menentukan

konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi adanya antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan

telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

Beberapa Tipe ELISA 1. Indirect ELISA Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum adalah: 1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. 2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate. 3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. 4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. 5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,

ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. 6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. 8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya. Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

2. Sandwich ELISA Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: 1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap 2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir 3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate 4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat 5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen 6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer

7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang 8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia 9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

3. ELISA Kompetitif Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu: 1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya 2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen

3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi 4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim 5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal

kromogenik/ fluoresensi. Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

2. Radioimmunoassay (RIA) RIA Radioimmunoassay pertama kali dikembangkan oleh Rosalyn Yalow (1921) dan Solomon A. Berson (1918-1972) dari amerika serikat, pertama kali mereka bekerja untuk mempelajari tentang hormon khusunya insulin yaitu hormon yang mengatur kadar gula dalam darah. Penelitian mereka membuktikan bahwa DM tipe II disebabkan oleh insulin yang tidak efisien. Sebelumnya, diperkirakan bahwa DM hanya terjadi karena kekurangan insulin. Kemudian mereka menemukan RIA pada tahun 1959. RIA bisa mendeteksi dan mngukur triliunan gram substansi per ml darah. Karena limit deteksi yang sangat baik ini makan RIA digunakan sebagai peralatan laboratorium standar. Digunakan untuk mendeteksi jumlah yang sangat kecil dalam darah. Radioimmunoassay adalah teknik nuklir yang banyak digunakan untuk mengetahui konsentrasi hormon. Pengujian ini menggunakan antibodi yang spesifik untuk hormon sebagai protein terikat. Prisip dasar dari radioimmunoassay ini adalah reaksi antara antigen dan antibody di dalam reaksinya ini yang utama adalah sifat kekhususannya, sebuah a n t i g e n t ya n g b e r e a k s i d e n g a n a n t i b o d y y a n g s p e s i f i k u n t u k n ya d a n

t i d a k mengadakan reaksi silang (cross reaction) dengan tipe antigent yang sama. Bahan pereksi dalam radioimmunoassay ialah antigen radioaktif dan antibody spesifik. Dasar kerja RIA adalah untuk mengetahui perbandingan konsentrasi antibody yang terdapat pada bagian dalam tabung dan antigen yang terdapat didalam sampel dengan menggunakan radio aktif. Persaingan konsentrasi antigen sampel dapat ditentukan dari reaksi reduksi pengikatan konsentrasi antigen dari antibody yang terdapat pada bagian dalam tabung. Posisi radioaktif pada antibodi yang mengakibatkan radioktif lepas. Radiaoktif yang bebas ini kemudian diukur untuk menentukan berapa banyak substansi dalam darah.. Menurut Cook (1990), anti serum untuk hormon yang diuji harus memiliki spesifik yang tinggi. Ketelitian ini dapat dikurangi dengan syarat bahwa sampel hormonal berlabel mempunyai kemurnian yang luar biasa. Anti serum mempunyai efiditas yang tinggi untuk anti gen hormon dan diperlukan titer yang tinggi. Cairan a n t i s e r u m ya n g diguanakan antara 1 : 10.000 dan 1 : 100. Hormon berlabel

menunjukkan reaksi pada antibody dengan cara yang sama dengan hormon yang tidak berlabel. Ini tidak dapat terjadi jika atom iodine relative lebih besar darimolekul hormon dalam kompirgurasi yang ditumpangi. M e t o d e r a d i o i m m u n o a s s a y ( R I A ) m e m p u n ya i 2 j e n i s p r i n s i p ya i t u kompetitif dan non kompetitif. Prinsip non kompetitif yang paling banyak di gunakan adalah sandwich.

Prinsip Dasar dari Sandwich RIA Adalah reaksi suatu antibody dalam konsentrasi yang terbatas dengan berbagai konsentrasi antigen. Bagian dariantigen yang bebas dan yang terikat yang timbul sebagai akibat dari penggunaanantobodi dalam kadar yang terbatas ditentukan dengan menggunakan antigen yang diberi label radio isotop. Ada dua jenis pendeteksian dengan RIA yakni Competitive R IA d a n sandwich immunoradiometric assay (IRMA). Pada competitive RIA,sejumlah tertentu antibodi diimobilisasi (ditempelkan) pada suatu fase padatmisalnya dinding tabung plastik. Sampel pasien yang mungkin mengandung biomolekul (misalnya patogen) ditambahkan bersama dengan sejumlah tertentu biomolekul berlabel radioaktif yang akan berinteraksi dengan antibodi yang timbul.Intensitas signal radiasi dari

biomolekul berlabel radioaktif yang terikat pada antibodi yang menempel pada dinding tabung akan berbanding terbalik dengan konsentrasi biomolekul dalam sampel. Sandwich IRMA khusus dipergunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur suatu biomolekul yang berukuran besar. Langkah pertama adalah membuat antibodi berlebihan yang terimobilisasi, langkah berikutnya adalah menambahkan biomolekul yang akan ditentukan yangditempelkan pada antibodi tersebut. Jika biomolekulnya sama seperti antibodi yang terimobilisasi, mereka akan berikatan dengan antibodi dan membentuk lapisan pertama sandwich. Antibodi kedua yang berlabel radioaktif kemudian ditambahkan. Antibodi ini akan menempel pada epitope (daerah) yang berbeda dari biomolekul yang sama dari antibodi yang terimobilisasi. Ini akan berikatan sebagai lapisan atas sandwich. Signal radiasi akan sebanding dengan konsentrasi biomolekul dalam sampel.

Gambar 1. Prinsip dasar teknik competitive RIA dan sandwich IRMA.

Pada prinsip kompetitif bahan yang mengandung antigen yang berlabel dan antigen yang terdapat di dalam sampel akan diberi label radio isotop sehingga terjadi kompetisi antara antigen yang akan ditentukan kadarnya dan antigen yang diberi label

dalam

proses

pengikatan

antibodi

spesifik

tersebut

sampai

terjadi

keseimbangan. Sisa antigen yang diberi label dan tidak terikat dengan antibody dipisahkan oleh proses pencucian. Setelah itu dilakukan penambahan konyugate, sehingga terjadi pembentukan kompleks imun dengan konjugate. Jumlah antigen berlabel yang terikat, antibodi pada fase padat, dan conjugate dapat ditentukandengan suatu radiation counter atau gamma counter. Pada pemeriksaan hormon,label radio isotop yang digunakan adalah isotop 125 I untuk hormon LH dan progesteron estrogen dan HPL, 131I, untuk testoteron , 3 H dan 57C untuk FSH.
o

Keuntungan metode RIA adalah : a. Sensitivitas dan presisi yang tinggi b.Mudah dikerjakanc.Pekerjaannya lebih cepat dan tidak memerlukan sampel yang besar.Kerugian metode RIA adalah : b. R e a g e n k u r a n g s t a b i l c. Memerlukan proteksi terhadap bahan radioaktif (radioactive hazardous)

Metode radioimmunoassay (RIA) mempunyai kemampuan u n t u k menentukan zat-zat fisiologis dalam tumbuh sampai kosentrasi yang sangat rendah sekali hampir sekitar nanogram (ng = 10) dan bahkan mencapai konsetrasi pictogram (pg = 10 ) untuk setiap 1 ml. Metode ini sangat penting dalam peptidedan hormon steroid yang terdapat dalam plasma yang kosentrasinya rendah. Metode RIA ini tergantung kepada kompetisi untuk mendapatkan tempat-tempat kedudukan (ikatan) pada antibody yang spesifik dari suatu zat tertentu antara zat tertentu didalam serum dan zat yang sama ditandai dengan unsur radioaktif. Zat ini misalnya suatu hormon seperti thyroxin , FSH, LH dan lainya. Dasar kerja radioimmunoassay adalah pengikatan antigen progesteron yang terkandung dalam serum dengan progesteron antibody spesifik yang di lapiskan pada dinding tabung. Sisa anti bodi yang spesifik yang tidak diikat oleh antigen progesteron sample akan mengikat125I. makin banyak 125I yang terpecah berarti semakin sedikit kadar progesteron didalam sample (maryati, 1985). M e n u r u t p a r t o d i h a r d j o ( 1 9 8 5 ) m e t o d e R I A i n i s a n g a t p e k a t e r h a d a p pengukuran hormon sampai sekecil 10

pikogram (0,01 mugmilimikogram). Pada metode ria ini yang diukur adalah daya immunologinya dan bukan daya biologi hormon.

DAFTAR PUSTAKA

Haussmann, M. F., C. M. Vleck, and E. S. Farrar. 2007. A laboratory exercise toillustrate increased salivary cortisol in response to three stressful conditionsusing competitive ELISA. Adv. Physiol. Educ. Leng, S. J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel. 2008. "Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research". J Gerontol a Biol Sci Med Sci Lequin, RM .2005. "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Clinical Chemistry Prosesur Kerja KIT RIA. 2005. Progesteron Orion Setiawan, I Made. 2007. Pemeriksaan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

(ELISA)untuk diagnosis Leptospirosis. EBERS PAPYRUS