Anda di halaman 1dari 16

DETEKSI ASAM NUKLEAT

Adlimatul Putri Ilmiyah, 1406531851


Abstrak
Asam nukleat merupakan molekul raksasa yang memiliki fungsi
khusus yaitu, menyimpan informasi genetik dan menurunkannya kepada
keturunanya. Asam nukleat dalam sel ada dua jenis yaitu DNA
(deoxyribonucleic acid) atau asam deoksiribonukleat dan RNA (ribonucleic
acid ) atau asam ribonukleat. Baik DNA maupun RNA berupa anion dan
pada umumnya terikat oleh protein dan bersifat basa. Dalam deteksi
asam nukleat, dapat diklasifikasikan menjadi beberapa macam. Pertama
dapat ditinjau jenis analisisnya yaitu kualitatif dan kuantitatif. Analisis
kualitatif merupakan analisis yang menghasilkan beberapa susunan
klasifikasi genetik dan karakteristik yang ada pada sampel uji seperti PCR,
Elektroforesis, Staining, UV Transillumeter, Hibridisasi in-situ, Northern
Blotting, Southern Blotting, Skuensing DNA. Sedangkan. analisis
kuantitatif merupakan analisis yang didasarkan pada perhitungan dan
yang bersifat numeris seperti qPCR, DNA microarray, SAGE, dan
spektroskopi UV-VIS.
Kata kunci : PCR, Elektroforesis, Staining, UV Transillumeter,
Hibridisasi in-situ,
Northern Blotting, Southern Blotting,
Skuensing DNA, QPCR, DNA microarray, SAGE, Spektroskopi UVVIS
1. Analisis Kualitatif
1.1.
PCR
(Polymerase
Chain
Reaction)Elektroforesis
Staining- UV Transillumeter
1.1.1. PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode
untuk amplifikasi potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106kali lipat dari jumlah nanogram dari DNA template. Proses ini
mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang
bersifat semi konservatif. Polymerase Chain Reaction (PCR)
ini dapat digunakan untuk amplifikasi urutan nukleotida,
menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang
mengalami mutasi, pada bidang kedokteran forensik serta
melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger
print. Umumnya primer yang digunakan pada PCR terdiri
dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen
DNA yang akan dilipatgandakan dan berasal dari patogen
yang terdapat dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase
merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik
Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
menempel pada ujung 3 primer ketika proses pemanjangan
dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polimerase.

Terdapat tiga tahapan penting dalam proses PCR yang


selalu terulang dalam 3040 siklus dan berlangsung dengan
cepat yaitu :
1. Denaturasi di dalam proses PCR, denaturasi awal
dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke
dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses
pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal.
Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk
meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi
DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap
mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk
DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini
mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu
denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas
enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut
mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5
menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5C.
2. Annealing (penempelan primer), kriteria yang umum
digunakan untuk merancang primer yang baik adalah
bahwa primer sebaiknya berukuran 18 25 basa,
mengandung 50 60 % G+C dan untuk kedua primer
tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masingmasing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling
berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan
terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan
mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa
digunakan dalam PCR adalah 30 45 detik. Semakin
panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.
Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah
antara 36C sampai dengan 72C, namun suhu yang
biasa dilakukan itu adalah antara 50 60C.
3. Pemanjangan Primer (Extention), selama tahap ini Taq
polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA
primer dari ujung 3. Kecepatan penyusunan nukleotida
oleh enzim tersebut pada suhu 72C diperkirakan 35
100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH,
konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan
demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang
basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap
perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR
waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang
sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan
terbentuk DNA untai ganda.

Gambar 1. Tahapan PCR


(Sumber : Campbell et al 2005)

1.1.2. Elektroforesis
Setelah proses PCR selesai, selanjutnya sampel dimasukan
ke dalam elektroforesis. Elektroforesis digunakan untuk
pemisahan suatu campuran senyawa yang bermuatan,
protein atau DNA. Metode ini bekerja dengan menggerakan
partikel yang bermuatan listrik di dalam suatu media yang
diberi arus listrik. Secara kualitatif, elektrolisis dapat
menganalisis DNA. Penggunaannya dalam biologi molekuler
melalui suatu pendekatan proteomic studies untuk
menentukan
gen
yang
bertanggungjawab
dalam
menghasilkan suatu protein dan menentukan fungsi protein
tersebut. Proteomic merupakan suatu studi tentang struktur,
fungsi, dan regulasi protein suatu organisme. Prinsip dasar
elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul
bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik,
dimana kecepatan migrasinya tergantung pada muatan,
ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat.
Prosedur percobaan elektroforesis gel yaitu :
1) Menyiapkan dan menuangkan gel;
2) Menyiapkan dan menuangkan sampel. Sampel DNA/RNA
akan dipotong oleh enzim restriksi menjadi beberapa
fragmen kemudian diletakkan ke dalam gel yang sudah
diberi larutan buffer;
3) Elektroforesis. Mengalirkan listrik sehingga DNA/RNA yang
bermuatan negatif akan bergerak ke katoda (elektroda
positif); dan
4) Visualisasi. Memberikan dye sehingga dapat diamati
seperti barcode.
Distribusi migrasi (kecepatan dan jarak yang ditempuh) yaitu
:
1) Ukuran : kecil > besar;
2) Berat molekul : ringan > berat; dan
3) Bentuk : supercoiled > linear > nicked/relaxed.

Tipe elektroforesis gel :


1) Agarose (DNA/RNA); dan
2) Poliakrilamida (protein).
Tabel 1. Perbandingan elektroforesis dengan jenis gel yang
berbeda
Elektroforesis Gel
Agarosa
Dituangkan secara
horizontal
Memisahkan molekul yang
besar
Non-toxic
Kebanyakan digunakan
untuk pemisahan DNA
Tahap pewarnaan sebelum
dan sesudah penuangan
gel

Elektroforesis Gel
Poliakrilamida
Dituangkan secara vertical
Memisahkan molekul yang kecil
Neurotoxic
Digunakan untuk pemisahan DNA
atau protein
Tahap pewarnaan setelah
penuangan gel

(a)

(b)

Gambar 3. a) Tahapan elektroforesis gel agarose b) Hasil elektrroforesis gel


agarose
(sumber : mobitec.com)

1.1.3. Staining (Pewarnaan)


Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses
pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah
dapat dilihat. Staining merupakan metode analisis keberadaan

DNA/RNA dengan memberikan dye (pewarna) sehingga


meningkatkan hasil visualisasi pengamatan di bawah
mikroskop. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru
Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk
keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar
ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium
bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul
sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel
tersebut dibuat.
Prosedur percobaannya yaitu :
1) Fixation.
Tujuannya
untuk
menghentikan
proses
metabolisme dan mencegah degradasi struktur sel. Dapat
menggunakan bahan kimia ataupun pembekuan;
2) Permeabilization. Tujuannya untuk merawat membran
(surfaktan ringan) dan memungkinkan molekul dye yang
lebih besar masuk ke bagian dalam sel;
3) Mounting. Meletakkan sampel ke preparat mikroskop
(microtom); dan
4) Stainning. Menyisipkan dye pada sampel sehingga sampel
berwarna (mordant). Dapat dilakukan sebelum atau sesudah
fixation dan mounting.
Tipe staining yaitu :
1) Basic stain (positive stain). Bersifat kationik. Dye mengikat
sampel;
2) Acidic stain (negative stain). Bersifat anionic. Dye
mengelilingi sampel;
3) In vivo stain. Pewarnaan jaringan hidup; dan
4) In vitro stain. Pewarnaan jaringan yang sudah dipisahkan
dari hubungan biologinya
Tabel 2. Contoh-contoh dye
Aplikasi

Blue
view

DNA
RNA
Batas
Deteksi

+
0.2

Warna
Emisi
Fluoresen
si

g
DNA
Biru

Ethidiu
m
bromid
e
+
+
1

Methyle
ne Blue

SYBR
Gree
nI

SYBR
Green
II

Pyroni
n

DAP
I

+
+

+
60

+
0.5

+
-

+
0.5

DNA

DNA

Merah

Biru

pg

DNA
Hijau

DNA
Hijau

g
Merah

DNA
Biru

Acridin
e
Orang
e
+
+
0.2

g
DNA
Hijau /
Merah

Adapun hasil dari proses staining dapat dilihat dalam gambar


berikut :

(b)

(b)

Gambar 3. a) Usus ikan zebra dewasa menggunakan SYTOX Green b) Telur


dorsopila 10 hari menggunakan propidium iodida
(sumber : mobitec.com)

1.1.4. UV Transillumeter
Gel yang telah dielektroforesis, direndam dalam etidium
bromide. Etidium merupakan larutan yang biasa digunakan
untuk memvisualisasi potong-potongan DNA yang telah di
pisahkan pada gel elektroforesis. Molekul etidium berpendar
fluor ketika diiluminasi dengan cahaya ultraviolet (UV) pada
kisaran visible UV (Moran, 1979). Etidium merupakan sebuah
molekul yang dapat mengikat kuat pada DNA. Etidium
mengikat dengan cara menyisip di antara ikatan basa pada
untai ganda DNA. Struktur cincin etidium adalah hidrofobik
dan mirip dengan struktur cincin pada DNA. Etidium dapat
membentuk kontak van der Walls tertutup dengan pasangan
basa. Molekul yang mengikat pada lokasi tersebut dikenal
dengan Agent inter khelat karena mengkhelat pada susunan
DNA yang kokoh. Dengan demikian, etidium merusak pilin
ganda (double helix) dan menghambat replikasi DNA,
transkripsi, perbaikan DNA, dan rekombinasi. Ini sebabnya
intercalating agent berpotensi sebagai mutagen (Reha, 2012).
Pada saat hasil elektroforesis terbaca oleh UV Transillumeter,
DNA ladder atau gene ruler dibutuhkan pada waktu
elektroforesis sebagai pembanding DNA sampel saat analisa
dilakukan.
1.2. Hibridisai in-situ
Hibridisasi in-situ Merupakan metode analisis untuk mengetahui
urutan basa nukleotida DNA/RNA dengan cara memasangkan
DNA/RNA sampel dengan DNA/RNA probe sehingga dapat
dihasilkan pasangan DNA-DNA, DNA-RNA, ataupun RNA-RNA.
Probe merupakan asam nukleat rantai tunggal yang dapat
diberi label untuk hibridisasi dengan DNA/RNA sampel sebagai
basa komplementer.
Tipe pelabelan yaitu :
1) Radioactive labeling, Menggunakan radioaktif;

2) Non-radioactive labeling, Menggunakan antigen labeling


(antibody, enzim, substrat);
3) End labeling, Diletakkan di ujung; dan
4) Uniform labeling. Diletakkan di bagian dalam.
Prosedur percobaan hibridisasi yaitu :
1) Pengikatan RNA atau DNA untai tunggal (sampel) pada
membran;
2) Penambahan DNA probe sehingga terjadi pasangan antara DNA
sampel dan DNA probe;
3) Pencucian untuk menghilangkan kelebihan DNA probe yang
tidak menempel pada DNA sampel; dan
4) Deteksi adanya hybrid antara DNA sampel dan DNA probe.
Tipe hibridisasi in situ yaitu :
1) FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). Menggunakan probe
yang mengandung komponen berfluorescent yang dapat
berpendar jika dikenakan sinar UV, dimana probe yang
digunakan hanya potongan asam nukelat pendek untuk jenis
gen tertentu;
2) GISH (Genomic In Situ Hybridization). Probe yang digunakan
berupa keseluruhan genom DNA dari suatu spesies.

Gambar 3. Prosedur Hibridisasi in-situ


(Sumber : Wippold, Franz J dan Perry, A. 2007. Neuropathology for
the Neuroradiologist:Fluorescent in Situ Hybridization. American
Journal of Neuroradiology)

1.3. Southern Blotting


Southern Blotting adalah sebuah metode dalam bidang biologi
molekular untuk menentukan keberadaan dan intensitas sebuah
sekuens DNA dalam sebuah sampel DNA. Metode yang digunakan
adalah kombinasi dari elektroforesis dari fragmen-fragmen DNA
pada sebuah gel yang kemudian dipindahkan ke dalam sebuah
membran filter untuk kemudian dari sebuah membran ini akan
direaksikan dengan sebuah probe pewarna sehingga potonganpotongan fragmen ini bisa dilihat dengan bantuan sinar X dengan
metode hibridisasi menggunakan probe yang mengandung
radioisotop. Dinamakan Southern bukan karena bermakna arah
mata angin, tapi penemunya kebetulan seorang ilmuwan Inggris
bernama Edwin Southern. Dari nama orang inilah metode ini
dinamakan dan dari nama metode ini pula nama metode-metode

biologi molekular dinamakan seperti nama Western blot, Northern


blott dll. Metode :
1) DNA/RNA
genom
dipotong
dengan
enzim
restriksi
endonuclease;
2) DNA/RNA dipisahkan dengan metode elektroforesis gel;
3) Denaturasi (untuk DNA);
4) Sampel DNA/RNA diletakkan pada membran nilon dengan
proses transfer vakum, kapiler, ataupun listrik;
5) Pelabelan DNA probe;
6) Hibridisasi dengan DNA/RNA probe; dan
7) Visualisasi dan deteksi (radioaktif atau non-radioaktif).

Gambar 4. skematik metode Southern blotting


(sumber:
bio.davidson.edu/courses/genomics/method/Southernblot.html)

1.4. Northern Blotting


Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertamakali pada tahun
1977, secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot Yang
membedakan adalah sampel yangdigunakan, yaitu RNA. Teknik ini
digunakan untuk melihat ekspresi(transkripsi) suatu mRNA (gen)
pada organ atau jaringan tertentu, seperti daun, bunga, biji,
batang,dan lain sebagainya. Beberapa hal yang membedakan
dengan Southern blotting adalah: (1) RNA jauh lebih rentan
terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena itu elektroforesis
dilakukan dalam bufer yang mengandung zat kimia yang bersifat
melindungi (biasanya formaldehid), (2) RNA sudah berupa untai
tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih ringan,
(3) RNA biasanya berukuran tertentu sehingga tidak memelukan
digesti enzim untuk memperoleh pola pita. Kedua prosedur sangat
mirip karena setelah elektroforesis RNA juga ditransfer ke
membran melalui difusi kapilaritas. Biasanya sinar UV digunakan

untuk mengikat (crosslink) RNA pada membran sehingga tidak


bergerak (imobilisasi).
1.5. Skuensing DNA
Merupakan metode analisis untuk mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pada untai tunggal DNA/RNA dengan tepat.
Tipe DNA/RNA sequencing dasar untuk asam nukleat yaitu :
1) Metode sanger / chain termination method. Berdasarkan enzim
polymerase; dan
2) Metode maxam-gilbert / chemical degradation method.
Berdasarkan reaksi peluruhan kimia
Prosedur percobaan DNA/RNA sequencing metode sanger yaitu :
1) Denaturasi isolat DNA sehingga menjadi rantai tunggal dengan
panas atau enzim restriksi;
2) Perlekattan primer dan pemanjangan basa. Terbentuk empat
pasang potongan rantai primer yang terputus akibat bantuan
DNA polymerase dan dideoxynukelotida;
3) Terminasi. Pemutusan rantai primer dari DNA sampel
menggunakan panas dan formamida;
4) Elektroforesis gel. Pemisahan potongan rantai primer; dan
5) Analisis urutan basa nukleotida pada DNA sampel dari urutan
dideoxinukleotida pada potongan rantai primer.
Prosedur percobaan DNA/RNA sequencing metode maxam-gilbert
yaitu ;
1) Penandaan isolat rantai DNA dengan radioisotop 32P pada ujung
5;
2) Denaturasi isolat DNA, sehingga keduanya menjadi rantai
tunggal yang dapat disequence secara terpisah;
3) Penambahan dimetil sulfat dan hidrazin. Dimetil sulfat bereaksi
dengan purin dan hidrazin bereaksi dengan pirimidin untuk
mematahkan ikatan glikosida antara gula ribosa dengan basa;
4) Piperidin menjadi katalis untuk ikatan fosfodiester (tempat basa
pada ikatan glikosida sebelumnya digantikan);
5) Elektroforesis fel. Pemisahan fragmen rantai tunggal hasil reaksi;
dan
6) Pembacaan autoradiogram untuk menentukan sekuens DNA
sampel.
Tabel 3. Perbedaan metode sanger dan maxam-gilbert
Sanger / Terminasi Rantai
Enzimatik
Membutuhkan sedikit DNA
purifikasi
Tidak ada pelabelan untai
DNA
Butuh sintesis DNA

Maxam-Gilbert / Degradasi
Kimia
Kimiawi
Membutuhkan banyak DNA
purifikasi, dan banyak langkah
purifikasi intermediet
Menggunakan pelabelan untai
DNA
Membutuhkan untaian panjang
DNA

Memutuskan rantai panjang


Bisa dilakukan automasi

Memutuskan DNA pada nukleotida


yang berbeda
Tidak bisa dilakukan automasi
Umumnya pembacaan pendek

Gambar 5. Proses Sqeuncing DNA


(Sumber : wikipedia.org)

1.6. RLFP (Restriction Fragment Length Polymorphism)


Dalam dunia biologi molecular RFLP merupakan suatu cara
yang digunakan untuk mengeksploitasi beberapa variasi sekuens
DNA yang homolog. Aplikasi dari RFLP adalah untuk menganalisis
suatu penyakit turunan di dalam keluarga. Misalkan dengan
metode ini kita ingin mengetahui asal gen pembawa suatu
penyakit. Maka langkah pertama adalah menganalisis DNA tiap
anggota keluarga yang terjangkit penyakit dan mencocokan
alelnya. Dengan begitu asal muasal pembawa penyakit tersebut
bisa diketahui. Selain itu dengan RFLP ini kita juga bisa mengetahui
kemungkinan anggota keluarga lainnya untuk terjangkit penyakit.
Tahapan RFLP sebagai berikut :
a. DNA yang telah diisolasi dari sampel dipotong menjadi
beberapa fragmen oleh enzim restriksi
b. Hasil fragmen DNA ini dipisahkan dengan metode elektroforesis
gel
c. Fragmen DNA yang telah terpisah dipindahkan ke dalam
membrane melalui proses southern blotting
d. Proses hibridisasi yang terjadi pada membran akan
menentukan panjang tiap-tiap fragmen yang berkomplemen
dengan DNA probe
e. Tiap panjang fragmen ini disebut alel dan bisa digunakan untuk
analitik genetik

10

Gambar 6. Proses RFLP


(Sumber : Anonim. 2001. RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism). Santa Monica College)

2. Analisis Kuantitatif
2.1.
Q-PCR
Real-Time PCR (Quantitative Real time Polymerase Chain
Reaction atau Q-PCR) merupakan suatu metode analisa yang
dikembangkan dari reaksi PCR. Teknik ini digunakan untuk
mengamplifikasi
(memperbanyak)
sekaligus
kuantifikasi
(menghitung) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.
Real time PCR memungkinkan dilalukan deteksi dan kuantifikasi
(sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah
relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen
penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sequens spesifik
dari sampel DNA yang dianalisis. Pada analisa PCR konversional
deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan
pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel
agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa
menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan
pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil
amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil
akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR
pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis,
sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan
Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.
Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR,
utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap
siklus amplifikasi selesai. Adapun prosedur dari metode ini, adalah
sebagai berikut:
1) Inisiasi, Pemanasan DNA template pada suhu 94C-96C selama
1-9 menit.

11

2) Denaurisasi, Pemanasan DNA template pada suhu 94C-98C


selama 20-30 detik hingga menjadi rantai tunggal.
3) Primer annealing, pemanasan DNA template 50C-56C selama
20-40 detik. Pada tahap ini primer menempel pada DNA
template.
4) Ekstensi/Elongasi, DNA polymerase mensintesis rantai DNA yang
komplemen dengan DNA template dengan menambahkan dNTP
yang sesuai, suhu yang digunakan tergantung dari DNA
polymerase yang digunakan (umumnya 72C)
5) Pemanasan DNA hasil ekstensi/elongasi pada suhu 70C-74C
untuk memastikan setiap rantai tunggal DNA telah mengalami
elongasi.
Perhitungan pada PCR, yaitu :
Pada akhir siklus pertama akan diperoleh 2 potongan DNA panjang.
Pada akhir siklus kedua akan diperoleh 4 potongan DNA yang
panjang. Pada siklus ketiga, akan diperoleh 8 potongan DNA
dimana 6 potongan panjang, dan 2 potongan pendek. Potongan
pendek merupakan hasil yangdiperoleh dari metode PCR tersebut.
Pada siklus berikutnya, jumlah potongan pendek akan dihasilkan
dengan derajat eksponensial. Pada siklus ke-4 akan dihasilkan
sebanyak 8. Pada siklus ke-5 jumlahnya menjadi 22. Pada siklus ke10 jumlahnya menjadi 1004. Nilai tersebut dapat dirumuskan
berdasarkan persamaan eksponensial sebagai berikut :
n

N n=N 0 +(1+ E)

N n merupakan jumlah potongan DNA pada siklus n-

Dengan,
siklus,

N0

merupakan jumlah potongan DNA target pada awal

siklus, n merupakan jumlah siklus, dan E merupakan nilai dari


sensitifitas (0>E<1).
2.2.

DNA Microarray

Microarray ini merupakan suatu metode yang digunakan untuk


melihat dan mempelajari gen mana saja yang aktif di dalam sel
tubuh manusia. Kenyataannya tiap gen yang identik belum tentu
selalu aktif di tiap sel tubuh manusia. Dengan mengetahui
karakteristik ini, sekarang para ilmuwan sudah bisa mengetahui
efek negatif yang ditimbulkan apabila gen yang berada di dalam
sel tubuh manusia tidak bekerja secara normal. Dengan teknologi
ini ilmuwan sudah mulai lebih memahami beberapa jenis penyakit
dan infeksi yang bisa terjadi pada tubuh manusia.
Tahapan kerja microarray:
1. Mengisolasi mRNA yang ada di dalam sel tubuh.
2. Menandai tiap mRNA yang telah diisolasi dengan enzim
transcriptase, yang nantinya akan merubah mRNA menjadi
cDNA.

12

3. Memberi pewarna yang berbeda pada tiap cDNA (misal sel


normal diberi warna hijau, dan sel kanker diberi warna merah).
4. Lalu meletakan kedua jenis cDNA pada alat microarray.
5. Pada alat ini cDNA tadi akan mengalami hibridisasi, dan pola
warna yang sebelumnya diberikan pada masing-masing cDNA
akan bercampur.
6. Untuk melihat pola warna yang terbentuk diperlukan alat pindai
khusus.

Gambar 7. Proses Microarray


(Sumber : Bowtell, David dan Sambrook, Joseph. 2013-2014. DNA
Microarray : A Molecular Cloning Manual. New York : Cold Spring
Harbor Laboratory Press)

Metode microarray banyak diaplikasikan pada bidang


biomedical. Pemanfaatan metode ini umumnya digunakan untuk
menganalisis DNA dari sel-sel orang yang berpenyakit seperti sel
tumor, gen yang termutasi, aktifitas gen pada sebuah sel atau
jaringan tertentu, bahkan dapat menentukan ekspresi gen atau
profil gen dari sampel yang berbeda-beda.
2.3.

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

SAGE merupakan metode yang digunakan untuk analisis


secara keseluruhan dari pola ekspresi gen, menggambarkan
populasi mRNA yang ada dalam sampel, dan melihat aktivitas gen
dalam sel secara keseluruhan. Dalam bidang biologi molekular
metode ini biasa dipakai untuk memahami karakteristik sel yang
sehat dan yang terkena penyakit dengan cara membandingkan
kedua sel yang berbeda. SAGE lebih kuantitaif dan tepat dalam
mengukur ekspresi gen daripada DNA microarray, namun lebih
mahal. Secara sederhana berikut tahapan kerja dari SAGE:
1. Mengisolasi mRNA dari sel sampel (misal sel tumor)
2. Mengekstraksi sebagian sekuens pada bagian tertentu dari tiap
Mrna
3. Menghubungkan tiap-tiap sekuens yang telah dipisahkan
membentuk rangkaian yang lebih panjang, atau biasa disebut
concatamer

13

4. Mengkloning rangkaian sekuens tersebut


5. Mengurutkan rangkaian yang telah diklon dengan DNA
sequencers
6. Memproses data yang didapat dengan computer untuk
menghitung label sekuens-sekuens yang lebih kecil
2.4.

Spektroskopi UV-VIS
Spektrofotometri UV-Vis adalah suatu metode untuk
mengetahui konsentrasi suatu senyawa berdasarkan daya absorbsi
cahaya dari senyawa tersebut. DNA murni dapat menyerap cahaya
tampak akibat keberadaan basa purin dan pirimidin. Pita DNA
dapat menyerap cahaya pada panjang gelombang 260 nm,
sedangkan kontaminan lain seperti protein dan phenol menyerap
cahaya pada panjang gelombang 280 nm. Dengan adanya
perbedaan kemampuan menyerap sinar UV, maka dapat
ditentukan kemurnian dan konsentrasi DNA/RNA.
Dalam
menganalisis asam nukleat, spektroskopi yang umumnya
digunakan adalah spektroskopi raman. Spektroskopi raman
dimanfaatkan untuk menganalisis DNA probe yang hendak
digunakan dalam proses hibridisasi.
Tahapan kerja spektroskopi UV-Vis:
1. Mengisolasi sampel yang sudah terbukti mengandung DNA/RNA
berdasar hasil uji kualitatif.
2. Melarutkan sampel dengan kadar pengenceran tertentu, dan
memasukannya ke dalam kuvet.
3. Memasukan kuvet ke dalam spektrofotometer.
4. Menembakan kuvet dengan cahaya tampak pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.
5. Membaca hasil absorbansi pada alat.
Dalam menghitung kemurnian DNARNA dapat digunakan rumus
sebagai berikut :
260
kemurnian=
280
Dalam hal ini, kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0 sehingga
dapat disimpulkan bahwa :
Kemurnian < 1,8 isolasi belum murni
Kemurnian > 2,0 nilai ddH2O yang diambil lebih banyak
dari DNA/RNA
Menghitung konsentrasi DNA dengan menggunakan rumus :
[DNA] = 260 x 50 x Faktor pengenceran
Dalam hal ini, 50 adalah larutan dengan nilai absorbansi 1,0
ssebanding dengan 50g untai ganda DNA per ml atau 50g/ml
untai tunggal RNA (ssRNA).

Kesimpulan
Metode kualitatif dalam deteksi asam nukleat terdiri dari:
1. PCR (Polymerase Chain Reaction): memperbanyak asam nukleat
dengan amplifikasi potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik.

14

2. Hibridisasi: interaksi DNA yang bersifat homolog dan hanya akan


berkomplemen dengan DNA yang mempunyai pasangan nukleotida
yang sesuai.
3. Southern Blotting: mendeteksi fragmen DNA tertentu pada daerah
smear.
4. Northern Blotting: pemisahan gel dan hibridisasi asam nukleat untuk
RNA.
5. Sekuensing DNA: penentuan urutan nukleotida pada DNA
6. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): analisis beberapa
variasi sekuens DNA yang homolog.
Metode kuantitatif dalam deteksi asam nukleat terdiri dari:
1. qPCR: mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus kuantifikasi
(menghitung) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.
2. DNA Microarray: menganalisis gen aktif suatu sampel dengan
mengukur perubahan ekspresi gen.
3. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE): menganalisis secara
keseluruhan
ekspresi
gen.
4. Spektroskopi UV-Vis:nnmenentukan konsentrasi dan kemurnian
DNA/RNA suatu sampel.
Daftar Pustaka

Arumingtyas, Estri Laras dan Fatchiyah. (2011). Biologi Molekular Prinsip Dasar
Analisis. Bab 5 (uji kuantitatif dan kualitatif), bab 7 (restriction fragment length
polymorphisms), bab 8 (amplifikasi DNA), bab 9 (hibridisasi), bab 10 (hibridisasi
in situ), dan bab 13 (elektroforesis gel poliakrilamida). Jakarta :
Erlangga;Bruckner, Monica Z. Basic Cellular Staining. Serc.carleton.edu.
Diakses 12 April 2016.
Augen, Jeffrey. April 2014. Targeting The Transcriptome. USA : American
Chemical Society. Diakses pada 13 April 2016.
Bowtell, David dan Sambrook, Joseph. 2013-2014. DNA Microarray : A Molecular
Cloning Manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Diakses 14 April
2016.

Campbell et al 2005, Biology, Pearson Education Australia, Melbourne.


Frei, Marck. BioFiles Volume 6 Number 5 - Centrifugation. Sigmaaldrich. Diakses
12 April 2016.
Kumar, Anand dan Siddique, R.A. Sage Technology and Its Application. Pitt.edu.
Diakses 14 April 2016.
Mashek, Jamie. DNA microarray. Chemistry.montana.edu. Diakses 14 April
2016.
Raven. dkk. (2008). Biology Eight Edition. Chapter 17 (DNA hybridization,
southern blot, restriction fragment length polymorphisms, sanger sequencing,
polymerase chain reaction, etc). USA : McGraw-Hill Higher Education. Diakses 13
April 2016.
Shinawi, Thoraia. DNA Gel Electrophoresis. Ksu.edu.sa. Diakses 14 April 2016.

15

Wippold,
Franz
J
dan
Perry,
A.
2007.
Neuropathology
for
the
Neuroradiologist:Fluorescent in Situ Hybridization. American Journal of
Neuroradiology. Diakses 14 April 2016.

16