1.1.2. Elektroforesis
Setelah proses PCR selesai, selanjutnya sampel dimasukan
ke dalam elektroforesis. Elektroforesis digunakan untuk
pemisahan suatu campuran senyawa yang bermuatan,
protein atau DNA. Metode ini bekerja dengan menggerakan
partikel yang bermuatan listrik di dalam suatu media yang
diberi arus listrik. Secara kualitatif, elektrolisis dapat
menganalisis DNA. Penggunaannya dalam biologi molekuler
melalui suatu pendekatan proteomic studies untuk
menentukan
gen
yang
bertanggungjawab
dalam
menghasilkan suatu protein dan menentukan fungsi protein
tersebut. Proteomic merupakan suatu studi tentang struktur,
fungsi, dan regulasi protein suatu organisme. Prinsip dasar
elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul
bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik,
dimana kecepatan migrasinya tergantung pada muatan,
ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat.
Prosedur percobaan elektroforesis gel yaitu :
1) Menyiapkan dan menuangkan gel;
2) Menyiapkan dan menuangkan sampel. Sampel DNA/RNA
akan dipotong oleh enzim restriksi menjadi beberapa
fragmen kemudian diletakkan ke dalam gel yang sudah
diberi larutan buffer;
3) Elektroforesis. Mengalirkan listrik sehingga DNA/RNA yang
bermuatan negatif akan bergerak ke katoda (elektroda
positif); dan
4) Visualisasi. Memberikan dye sehingga dapat diamati
seperti barcode.
Distribusi migrasi (kecepatan dan jarak yang ditempuh) yaitu
:
1) Ukuran : kecil > besar;
2) Berat molekul : ringan > berat; dan
3) Bentuk : supercoiled > linear > nicked/relaxed.
Elektroforesis Gel
Poliakrilamida
Dituangkan secara vertical
Memisahkan molekul yang kecil
Neurotoxic
Digunakan untuk pemisahan DNA
atau protein
Tahap pewarnaan setelah
penuangan gel
(a)
(b)
Blue
view
DNA
RNA
Batas
Deteksi
+
0.2
Warna
Emisi
Fluoresen
si
g
DNA
Biru
Ethidiu
m
bromid
e
+
+
1
Methyle
ne Blue
SYBR
Gree
nI
SYBR
Green
II
Pyroni
n
DAP
I
+
+
+
60
+
0.5
+
-
+
0.5
DNA
DNA
Merah
Biru
pg
DNA
Hijau
DNA
Hijau
g
Merah
DNA
Biru
Acridin
e
Orang
e
+
+
0.2
g
DNA
Hijau /
Merah
(b)
(b)
1.1.4. UV Transillumeter
Gel yang telah dielektroforesis, direndam dalam etidium
bromide. Etidium merupakan larutan yang biasa digunakan
untuk memvisualisasi potong-potongan DNA yang telah di
pisahkan pada gel elektroforesis. Molekul etidium berpendar
fluor ketika diiluminasi dengan cahaya ultraviolet (UV) pada
kisaran visible UV (Moran, 1979). Etidium merupakan sebuah
molekul yang dapat mengikat kuat pada DNA. Etidium
mengikat dengan cara menyisip di antara ikatan basa pada
untai ganda DNA. Struktur cincin etidium adalah hidrofobik
dan mirip dengan struktur cincin pada DNA. Etidium dapat
membentuk kontak van der Walls tertutup dengan pasangan
basa. Molekul yang mengikat pada lokasi tersebut dikenal
dengan Agent inter khelat karena mengkhelat pada susunan
DNA yang kokoh. Dengan demikian, etidium merusak pilin
ganda (double helix) dan menghambat replikasi DNA,
transkripsi, perbaikan DNA, dan rekombinasi. Ini sebabnya
intercalating agent berpotensi sebagai mutagen (Reha, 2012).
Pada saat hasil elektroforesis terbaca oleh UV Transillumeter,
DNA ladder atau gene ruler dibutuhkan pada waktu
elektroforesis sebagai pembanding DNA sampel saat analisa
dilakukan.
1.2. Hibridisai in-situ
Hibridisasi in-situ Merupakan metode analisis untuk mengetahui
urutan basa nukleotida DNA/RNA dengan cara memasangkan
DNA/RNA sampel dengan DNA/RNA probe sehingga dapat
dihasilkan pasangan DNA-DNA, DNA-RNA, ataupun RNA-RNA.
Probe merupakan asam nukleat rantai tunggal yang dapat
diberi label untuk hibridisasi dengan DNA/RNA sampel sebagai
basa komplementer.
Tipe pelabelan yaitu :
1) Radioactive labeling, Menggunakan radioaktif;
Maxam-Gilbert / Degradasi
Kimia
Kimiawi
Membutuhkan banyak DNA
purifikasi, dan banyak langkah
purifikasi intermediet
Menggunakan pelabelan untai
DNA
Membutuhkan untaian panjang
DNA
10
2. Analisis Kuantitatif
2.1.
Q-PCR
Real-Time PCR (Quantitative Real time Polymerase Chain
Reaction atau Q-PCR) merupakan suatu metode analisa yang
dikembangkan dari reaksi PCR. Teknik ini digunakan untuk
mengamplifikasi
(memperbanyak)
sekaligus
kuantifikasi
(menghitung) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.
Real time PCR memungkinkan dilalukan deteksi dan kuantifikasi
(sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah
relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen
penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sequens spesifik
dari sampel DNA yang dianalisis. Pada analisa PCR konversional
deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan
pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel
agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa
menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan
pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil
amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil
akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR
pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis,
sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan
Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.
Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR,
utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap
siklus amplifikasi selesai. Adapun prosedur dari metode ini, adalah
sebagai berikut:
1) Inisiasi, Pemanasan DNA template pada suhu 94C-96C selama
1-9 menit.
11
N n=N 0 +(1+ E)
Dengan,
siklus,
N0
DNA Microarray
12
13
Spektroskopi UV-VIS
Spektrofotometri UV-Vis adalah suatu metode untuk
mengetahui konsentrasi suatu senyawa berdasarkan daya absorbsi
cahaya dari senyawa tersebut. DNA murni dapat menyerap cahaya
tampak akibat keberadaan basa purin dan pirimidin. Pita DNA
dapat menyerap cahaya pada panjang gelombang 260 nm,
sedangkan kontaminan lain seperti protein dan phenol menyerap
cahaya pada panjang gelombang 280 nm. Dengan adanya
perbedaan kemampuan menyerap sinar UV, maka dapat
ditentukan kemurnian dan konsentrasi DNA/RNA.
Dalam
menganalisis asam nukleat, spektroskopi yang umumnya
digunakan adalah spektroskopi raman. Spektroskopi raman
dimanfaatkan untuk menganalisis DNA probe yang hendak
digunakan dalam proses hibridisasi.
Tahapan kerja spektroskopi UV-Vis:
1. Mengisolasi sampel yang sudah terbukti mengandung DNA/RNA
berdasar hasil uji kualitatif.
2. Melarutkan sampel dengan kadar pengenceran tertentu, dan
memasukannya ke dalam kuvet.
3. Memasukan kuvet ke dalam spektrofotometer.
4. Menembakan kuvet dengan cahaya tampak pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.
5. Membaca hasil absorbansi pada alat.
Dalam menghitung kemurnian DNARNA dapat digunakan rumus
sebagai berikut :
260
kemurnian=
280
Dalam hal ini, kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0 sehingga
dapat disimpulkan bahwa :
Kemurnian < 1,8 isolasi belum murni
Kemurnian > 2,0 nilai ddH2O yang diambil lebih banyak
dari DNA/RNA
Menghitung konsentrasi DNA dengan menggunakan rumus :
[DNA] = 260 x 50 x Faktor pengenceran
Dalam hal ini, 50 adalah larutan dengan nilai absorbansi 1,0
ssebanding dengan 50g untai ganda DNA per ml atau 50g/ml
untai tunggal RNA (ssRNA).
Kesimpulan
Metode kualitatif dalam deteksi asam nukleat terdiri dari:
1. PCR (Polymerase Chain Reaction): memperbanyak asam nukleat
dengan amplifikasi potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik.
14
Arumingtyas, Estri Laras dan Fatchiyah. (2011). Biologi Molekular Prinsip Dasar
Analisis. Bab 5 (uji kuantitatif dan kualitatif), bab 7 (restriction fragment length
polymorphisms), bab 8 (amplifikasi DNA), bab 9 (hibridisasi), bab 10 (hibridisasi
in situ), dan bab 13 (elektroforesis gel poliakrilamida). Jakarta :
Erlangga;Bruckner, Monica Z. Basic Cellular Staining. Serc.carleton.edu.
Diakses 12 April 2016.
Augen, Jeffrey. April 2014. Targeting The Transcriptome. USA : American
Chemical Society. Diakses pada 13 April 2016.
Bowtell, David dan Sambrook, Joseph. 2013-2014. DNA Microarray : A Molecular
Cloning Manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Diakses 14 April
2016.
15
Wippold,
Franz
J
dan
Perry,
A.
2007.
Neuropathology
for
the
Neuroradiologist:Fluorescent in Situ Hybridization. American Journal of
Neuroradiology. Diakses 14 April 2016.
16