PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

METODE PCR KONVESIONAL DAN REAL TIME PCR

LAPORAN PRAKTIKUM

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Tugas Instrumentasi Spesifik

Dosen pengampu : Roni Afriansya, ST.,M.Si

disusun oleh :

NAFTYAN YUVINA F

P1337434319041

PROGRAM STUDI SARJANA TERAPAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

JURUSAN ANALIS KESEHATAN
POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES SEMARANG
2020
I. Judul
Laporan praktikum metode PCR konvensional dan real time PCR

II. Tujuan
Untuk mengetahui perbedaan cara pemeriksaan PCR dengan metode PCR
konvensional dan real time PCR

III. Prinsip
A. PCR Konvensional
Suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target
tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan
molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer
dan dilakukan dalam thermocycler.
B. Real Time PCR/ qPCR
Mendeteksi dan mengkuantifikasi reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan
meningkat seiring dengan bertambahnya amplifikasi DNA PCR dalam reaksi.
Reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau dengan mencatat jumlah emisi
fluoresen pada setiap siklus. Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase
eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi target gen. makin tinggi tingkat
ekspresi target gen maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjadi (Pardal,
2010).

IV. Alat dan Bahan

Alat Bahan
A. PCR Konvensional A. PCR Konvensional
1. PCR microtube 1. DNA genom hasil isolasi
2. Thermal cycler 2. ddH2O
3. Micropipette dan tip 3. PCR kit
4. Vortex
 B. Real Time PCR/ qPCR B. Real Time PCR/ qPCR
1. PCR microtube 1. DNA genom hasil isolasi
2. Mesin qPCR 2. SYBR Green I (DNA-binding
3. Micropipette dan tip dye)/probe
4. Vortex 3. Fluorescence primer
5. Sentrifuse 4. ddH2O (DNAse free water)
5. qPCR kit

V. Cara Kerja
A. PCR
1. Menyiapkan PCR Master Mix (DNA polymerase, buffer, air)
2. Dalam setiap microtube, volume PCR total adalah 20 µl, yang terdiri atas;
Komponen Konsentrasi dalam Volume yang dipipet dari
larutan working solution
PCR master mix 1x 10 µl
Template DNA 60 ng/20 µl 5 µl
Primer 50 pmol/20 µl 5 µl
Volume total larutan 20 µl
Keterangan: konsentrasi DNA dan primer tergantung kondisi saat praktikum

3. PCR master mix terdiri atas:

Komponen Konsentrasi final dalam volume PCR total
Vi Buffer A 1x
dNTP 0,08 Mm
MgCl2 1,5 Mm
DNA polymerase 2-3 unit
4. Komponen PCR ditambahkan ke dalam microtube dengan cara dipipet dan
ditempelkan pada dinding microtube. Tiap komponen ditempelkan pada
dinding yang berbeda. Dengan urutan memasukkan komponen PCR ke dalam
microtube yaitu, PCR master mix, primer, kemudian terakhir template DNA
5. Setelah seluruh microtube terisi, microtube dispin/sentrifuse untuk
mengumpulkan larutan di dasar mirotube. Larutan PCR dihomogenasi
(dicampur) dengan cara menjentik (tapping) bagian ujung microtube dan
 kemudian di vortex sekali lagi. Jika PCR akan ditunda, maka sample dapat
disimpan pada suhu -20ºC - 5ºC
6. Masukkan microtube ke dalam thermal cycler
7. Atur suhu sesuai kebutuhan
8. Analisis hasil PCR dapat dilihat dengan elektroforesis

B. Real Time PCR/ qPCR

1. Menyiapkan PCR Master Mix (dilakukan dalam es)
2. PCR master mix terdiri atas; DNA polymerase, buffer, dNTPs, SYBR Green
I/Probe
3. Vortex dahulu semua reagen yang akan digunakan agar larutan homogen
4. Siapkan sampel DNA hasil ekstrasi menggunakan kit yang tersedia
5. Masukkan masing-masing 23 µl larutan mix pada setiap PCR tube yang akan
digunakan
6. Tambahkan masing-masing 2 µl ddH2O (control negative), control positif, dan
sampel DNA yang akan diuji pada PCR tube yang sudah berisi 23 µl larutan
mix
7. Tutup well menggunakan sealing plastic untuk PCR tube, lalu spin down
untuk menurunkan larutan di bawah tube
8. Masukkan PCR tube ke dalam mesin real-time PR, lalu atur penamaan sampel
dan semua parameter yang dibutuhkan
9. Atur program PCR seperti tabel dibawah ini;
Tahapan Parameter
Suhu Waktu
Inisial denaturasi 95ºC 10 menit
Denaturasi 95ºC 15 detik
Annealing-ekstensi 60ºC 45 detik
Pengulangan 40 siklus

10. Setelah proses PCR selesai, dapat langsung dilakukan analisis data

VI. Hasil Pengamatan

 Gambar 1 : hasil PCR pada elektroforesis

Gambar 2: hasil Real Time PCR

VII. Pembahasan
A. PCR Konvensional
PCR konvensional adalah PCR di mana tahap perbanyakan materi genetik dan
tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi
dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Reaksi PCR
konvensional biasanya menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk
mengamplifikasi bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan pada
suatu tabung. Primer PCR adalah oligodeoksiribonukleotida pendek, atau
oligomer yang dirancang untuk melengkapi urutan akhir sekuen dari amplikon
target PCR dan digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. (Dyah Ayu dan
Dharmayanti, 2014). Tahap deteksi dapat dilakukan dengan beberapa cara
(format), salah satunya menggunakan elektroforesis gel kemudian dilanjutkan
dengan hibridisasi pada membran menggunakan reagen pelacak atau hibridisasi
 dalam tabung reaksi. Jika yang diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA
maka DNA dapat langsung diperbanyak. Namun jika yang diisolasi berupa RNA,
maka diperlukan tahap tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu
tahap transkripsi balik.
B. Real Time PCR
Real Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR.
Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain
reaction atau Q-PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi
sekaligus menghitung jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.
Maksud dari kata real time pada metode ini adalah data fuoresensi yang
dihasilkan dari proses amplifikasi dapat diamati secara langsung pada saat proses
amplifikasi masih berjalan dan tanpa harus menunggu seluruh siklus amplifikasi
selesai. Pada analisa PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada
akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan dengan elektroforesis.
Dengan analisa Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan
pada saat reaksi berlangsung. Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi
membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose
dan penggunaan Ethydium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa
karsinogenik. Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR,
utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan
dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.
 Gambar 3 : Alur Pemeriksaan Real Time PCR: Ekstraksi DNA, Amplifikasi dan
Deteksi (Applied Biosystem)

Real Time PCR merupakan pengembangan metode PCR yang hasil

amplifikasinya dianalisis selama proses amplifikasi dengan menggunakan pewarna
DNA atau pelacak berfluoresensi. Analisis data dilakukan dalam instrumen yang
sama, tanpa pemindahan sampel, tanpa penambahan sampel dan tanpa pemisahan
dengan elektroforesis. Metode ini dapat digunakan untuk analisis secara kuantitatif
jumlah awal sehingga dapat digunakan pengukuran secara kuantitatif (Sudjadi, 2008).

Perbedaan PCR Konvensional/ standar dengan Real Time PCR

PCR Konvensional Real Time PCR

Sensitivitas lebih rendah
Presisi lebih rendah
Tidak otomatis
Hasil tidak dalam bentuk angka
Ada tahapan setelah PCR
Deteksi keberadaan DNA dilakukan
pada akhir reaksi
Pengamatan keberadaan DNA hasil
amplifikasi dilakukan di gel agarosa
setelah dilakukan elektroforesis
Sensitivitas lebih tinggi
Presisi lebih tinggi
Otomatis
Data dikumpulkan dalam fase
pertumbuhan eksponensial PCR
Tidak ada tahapan setelah PCR
Keberadaan DNA hasil amplifikasi
dapat diamati pada grafik yang
muncul sebagai hasil akumulasi
fluoresensi dari probe (penanda)
Pengamatan dapat dilakukan saat
reaksi berlangsung

VIII. Simpulan
PCR konvensional adalah PCR dimana tahap perbanyakan materi genetik dan
tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi
dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Reaksi PCR
konvensional biasanya menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk
mengamplifikasi bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan pada suatu
 tabung. Pada analisa PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada
akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan dengan elektroforesis.
Real Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR.
Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah
target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real time pada metode ini adalah data
fuoresensi yang dihasilkan dari proses amplifikasi dapat diamati secara langsung pada
saat proses amplifikasi masih berjalan dan tanpa harus menunggu seluruh siklus
amplifikasi selesai. Pada analisa Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan
pengamatan pada saat reaksi berlangsung. Pada Real Time PCR pengamatan hasil
tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel
agarose dan penggunaan Ethydium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa
karsinogenik.

IX. Daftar Pustaka

Nurhayati, Betty dan Sri Darmawati. 2017. Bahan Ajar Teknologi Laboratorium
Medis (TLM) Biologi Sel dan Molekuler. Badan Pengembangan Dan
pemberdayaan Sumber Daya Manusia Kesehatan Kemenkes RI.

Wahyuni, Febriana Dwi. 2017. Modul Praktikum Biologi Molekuler. Universitas Esa
Unggul: Jakarta.