Nama : Yunita

NIM : K1A018080

Kelas : B

Tugas Bioteknologi “PCR ( Polimarase Chain Reaction )”

A. Sejarah dan perkembangan PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi
sekuen DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA. PCR dikembangkan pada
tahun 1984 oleh seorang biokimiawan bernama Kary Mullis. PCR atau reaksi berantai polimerase
adalah suatu metode enzimatis dalam bidang biologi molekuler yang bertujuan untuk
melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan jumlah kelipatan
ribuan hingga jutaan salinan secara in vitro. Ketika awal perkembangannya, metode ini hanya
digunakan sebagai metode untuk melipatgandakan DNA. Kemudian, metode ini dikembangkan
untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA. Proses PCR merupakan proses
siklus yang berulang meliputi tahap denaturasi, pemisahan kedua untai DNA pada temperatur tinggi.
Teknologi PCR selalu mengalami inovasi mengikuti dan menjawab kebutuhan-kebutuhan di bidang
riset maupun diagnostic dan inovasi tersebut terjadi pada komponen “software” yaitu enzim dan
komponen kimia pendukungnya, komponen “technique” yaitu metodologi PCR dan komponen
“hardware” yaitu mesin PCR.isolasi, kloning gen dan modifikasi dari enzim DNA polimerase.
B. Keuntungan dan Kerugian PCR
Keuntungan Kerugian
Memiliki spesifisitas yang tinggi Mudah terontaminasi
PCR begitu spesifik karena dapat proses PCR harus diawali dengan
mendeteksi mikroorganisme pada tingkat preparasi sampel yang cukup rumit dan
DNAnya. reagen yang
digunakan mahal.
Memiliki sensitifitas yang tinggi karena memerlukan mesin pengatur suhu
mampu mendeteksi satu partikel virus di (thermal cycler) dan waktu relatif lebih
dalam sel yang terinfeksi dengan cara lama
meningkatkan jumlah DNA-nya.
PCR digunakan secara luas untuk Hasil PCR tidak dapat dilihat secara
diagnosis berbasis molekuler, misalnya langsung, harus diproses lagi dengan
deteksi virus, bakteri, protozoa, dan elektroforesis dan dilihat dengan alat gel
cacing documentation
parasit.
PCR dapat membedakan spesies parasit Tidak dapat membedakan apakah parasit
tunggal dengan adanya primer spesifik dalam tubuh masih hidup atau suadah
untuk DNA target. mati.
Relatif mudah dilakukan. Teknik prosedur yang kompleks dan
bertahap membutuhkan keahlian khusus.

C. PRINSIP DAN PROTOKOL SINGKAT PCR

Prinsip dasar PCR adalah sekuen DNA spesifik diamplifikasi menjadi dua kopi selanjutnya menjadi
empat kopi dan seterusnya. Pelipat gandaan ini membutuhkan enzim spesifik yang dikenal dengan
polymerase yaitu enzim yang mampu menggabungkan DNA cetakan tunggal, membentuk untaian
molekul DNA yang panjang. Terdapat 7 kompone yang diperlukan pada proses PCR yaitu, (1)
templat DNA, (2) sepasang primer yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat, (3) dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates), (4) buffer PCR, (5) magnesium klorida (MgCl2 ), (6) enzim
polimerase DNA dan (7) air.Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA
templat; (2) denaturasi DNA
templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan
(5) pemantapan (postextension).

Gambar 1. Prinsip dasar perbanyakn fragmen DNA dengan teknologi

PCR Sumber : Budiarto, 2015.

Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan
kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer
menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA, durasi annealing sangat
bergantung pada spesifikasi dan panjang primer yang dibuat tetapi untuk mudahnya durasi tidak
kurang dari 15 detik dan tidak lebih lama dari 1 menit. Polimerase DNA digunakan untuk
memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan
buffer yang sesuai, durasi polimerasi sangat ditentukan oleh panjang fragmen DNA yang dihasilkan
dan secara kasar ditetapkan untuk memperbanyak fragmen DNA dengan ukuran 1 kb dibutuhkan
durasi 1 menit tergantung pada jenis enzim polimerase yang digunakan. Umumnya keadaan ini
dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan
meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan
meningkat secara linier. Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada akhir
siklus PCR dapat dihitung secara teoritis menurut rumus:

Y = (2n – 2n)X

Dimana Y : jumlah amplicon, n : jumlah siklus, X : jumlah molekul DNA templat semula.
Jika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka jumlah amplicon yang diperoleh pada
akhir proses PCR adalah 1.074 x 109 . Dari fenomena ini dapat terlihat bahwa dengan menggunakan
teknik PCR dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen DNA yang diinginkan (amplicon) secara
eksponensial dalam waktu relatif singkat.

Metode PCR dibedakan menjadi dua yaitu PCR konvensional dan real time. Analisis hasil
amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional dilakukan dengan visualisasi di agar
elektroforesis. Sedangkan PCR real time, jumlah DNA yang diamplifikasi dapat dideteksi dan diukur
di setiap siklus proses PCR.
 Gambar 2. Perbandingan prosedur PCR konvensional dan real time.
Sumber: Adaptasi dari Fraga et al. (2008)
PCR konvensional
Reaksi PCR konvensional biasanya menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk
mengamplifikasi bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan pada suatu tabung.. Proses
amplifikasi RNA didahului dengan siklus reverse transcriptase (RT) yang berlangsung pada suhu 42-
55°C. Proses PCR dibagi menjadi tiga tahap. Pertama, denaturasi cetakan DNA beruntai ganda pada
suhu di atas 90°C sehingga menjadi DNA cetakan berantai tunggal. Kedua, penempelan (annealing)
primer oligonukleotida ke DNA cetakan beruntai tunggal biasanya pada suhu 50-60°C sehingga
primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer
dengan sekuen primer. Ketiga, perpanjangan atau ekstensi fragmen DNA dengan enzim polimerase
dan primer untuk menghasilkan kopi DNA yang dapat berfungsi sebagai DNA cetakan untuk siklus
selanjutnya yang berlangsung pada suhu 70-78°C. Kedua DNA cetakan asli dan target yang
teramplifikasi selanjutnya berfungsi sebagai substrat untuk proses denaturasi, penempelan primer
dan perpanjangan fragmen DNA. Jumlah amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional
divisualisasikan dengan menggunakan agar elektroforesis.
PCR real time (RT-PCR)
Prinsip uji RT-PCR real-time berbasis fluoresensi sederhana: transkripsi balik RNA
ditranskripsi balik menjadi cDNA; kimia pendeteksi yang sesuai melaporkan keberadaan produk
PCR; instrumen memonitor amplifikasi secara real time; dan software yang sesuai menganalisis data.
Karena kualitas template RNA adalah satu-satunya penentu terpenting dari reproduktifitas hasil RT-
PCR, penting untuk memastikan bahwa tidak ada inhibitor yang bekerja sama selama proses
ekstraksi RNA.
Pengujian PCR real time yang berdasarkan fluoresensi menjadi suatu metode pengujian yang
sering digunakan untuk deteksi RNA, DNA dan cDNA. Teknik ini sangat sensitif yang
memungkinkan amplifikasi terjadi secara bersamasama serta kuantitas sekuens asam nukleat dapat
diketahui. Disamping memiliki sensitivitas lebih tinggi, kelebihan pengujian PCR real time jika
dibandingkan dengan PCR konvensional adalah lebih dinamis, risiko kontaminasi silang lebih
sedikit, kemampuan aplikasi penggunaannya untuk pengujian lebih banyak Polymerase Chain
Reaction (PCR) real time tepat untuk berbagai aplikasi seperti analisis ekspresi gen, penentuan
jumlah virus, deteksi organisme yang mengalami mutasi genetik, diskriminasi alel dan genotipe
single nucleotide polymorphisms
 (SNP). Penggunaan probe yang spesifik membantu peningkatan spesifisitas pada pengujian PCR real
time jika dibandingkan dengan pengujian PCR konvensional. Disamping memiliki sensitivitas lebih
tinggi, kelebihan pengujian PCR real time jika dibandingkan dengan PCR konvensional adalah lebih
dinamis, risiko kontaminasi silang lebih sedikit, kemampuan aplikasi penggunaannya untuk
pengujian lebih banyak.
Tahapan-tahapan umum yang dilakukan selama pengujian PCR real time dimulai dari isolasi
RNA atau DNA sampai analisis data. Prinsip kerja PCR real time adalah mendeteksi dan
mengkuantifikasi reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya
amplifikasi DNA PCR dalam reaksi. Reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau dengan
mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus. Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase
eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi target gen. Makin tinggi tingkat ekspresi target
gen maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjad. Siklus threshold / fluoresensi adalah prinsip
dasar dari PCR real time dan sebagai bagian yang sangat penting untuk memperoleh data yang
akurat. Nilai Ct PCR real time sangat berkorelasi dengan kuantitas urutan DNA target. Reaksi PCR
real time dapat dilakukan satu tahap (one step real time PCR) maupun dua tahap (two step real time
PCR). Polymerase Chain Reaction (PCR) real time satu tahap dapat meminimalkan variasi perlakuan
laboratorium karena reaksi kedua enzim terjadi dalam satu tabung. Reaksi reverse transcriptase pada
proses PCR real time dua tahap dilakukan terpisah dari pengujian PCR real time. Prosedur PCR real
time dua tahap akan bekerja lebih baik ketika menggunakan suatu DNA binding dye seperti SYBR
green I karena akan lebih mempermudah untuk mengeliminasi primer-dimer melalui manipulasi Tm.
SYBR green I merupakan salah satu jenis DNA binding dye yang mempunyai kemampuan mengikat
100 kali lebih tinggi dan relatif lebih ramah lingkungan jika dibandingkan dengan ethidium bromide.

D. APLIKASI PCR DALAM BIDANG KEFARMASIAN

Aplikasi PCR dalm bidang farmasi dalam penemuan obat-obatan untuk suatu penyakit
misalkan pada peyakit HIV-AIDS . Virus human immunodeficiency (atau HIV), adalah tujuan yang
sulit untuk diidentifikasi dan dibasmi. Tes paling awal untuk infeksi bergantung pada keberadaan
antibodi terhadap virus yang beredar di aliran darah. Namun, antibodi tidak muncul sampai
berminggu-minggu setelah infeksi, antibodi ibu menutupi infeksi bayi baru lahir, dan agen terapeutik
untuk melawan infeksi tidak memengaruhi antibodi. Tes PCR telah dikembangkan yang dapat
mengungkap sedikitnya satu genom virus di antara DNA lebih dari 50.000 sel inang. Infeksi dapat
dideteksi lebih awal, darah yang disumbangkan dapat disaring langsung untuk mengetahui virusnya,
bayi baru lahir dapat segera di tes untuk infeksi, dan efek perawatan antivirus dapat diukur.
Berikut bebrapa metode PCR beserta aplikasinya dalam dunia kesehatan.

Metode PCR Prinsip Fungsi Aplikasi

COLD PCR Denaturasi selektif Pengayaan fragmen 1. Pengayaan gen KRAS dan
missmatch/heterodu DNA yang gen p53 yag membawa
pleks DNA mengandung mutasi yang jumlahnya
(campuran DNA tipe mutasi pada sedikit pada kanker paru
mutan dengan tipe populasi suatu sel 2. Deteksi mutasi DNA
wildnya) pada Tc dan deteksi mutasi BRAF dan K-ras pada
suhu critical gen kolon kanker
3. Meningkatkan akurasi
deteksi mutasi K-ras
dengan metode analisa
kurva leleh
 PNAC PCR Penghambatan secara Deteksi mutasi gen Deteksi mutasi KRAS pada kanker
selektif perbanyakan kolon dengan tingkat sensitivitas
fragmen DNA tipe dan spesifitas yang cukup tinggi
wild menggunakan
oligo peptida
Supression Amplifikasi spesifik Deteksi keragaman Deteksi type alel gen trombin II,
PCR pada daerah SS loop gen inerleukin 1alfa, alfa
dari hairpin DNA mikroglobulin.
yang terbentuk dari
ikatan
komplementari yang
kuat pada ujung-
ujung linker
menggunakan primer
spesifik en
TETRA Amplifikasi fragmen Deteksi keragaman Deteksi mutasi gen PI3KCA exon
ARMS PCR gen spesifik gen dan mutasi 9 dan 20 pada kanker payudara.
menggunakan
sepasang primer
pengamit dan
sepasang primer
internal yang
berposisi saling
berlawanan arah

DAFTAR PUSTAKA

Budiarto, B. R. 2015. Polymerase Chain Reaction (PCR) : Perkembangan dan Peranannya dalam Diagnostik
Keseehatan. BioTrends. Vol. 6, No. 2, p. 30-33.

Bustin, S. A., Real-Time Reverse Transcription Pcr. University Of London, London, U.K., P. 1131

Feranisa, A. 2016. Komparasi Antara Polymerase Chain Reaction (Pcr) Dan Loopmediated Isothermal
Amplification (Lamp) Dalam Diagnosis Molekuler. Odonto Dental Journal. Vol. 3, No. 2, P. 146.

Fraga D, Meulia T, Fenster S. 2008. Real-time PCR. In: Current protocols essential laboratory techniques.
New York (US): John Wiley & Sons, Inc. p. 10.3.1- 10.3.33.

Handoyo, D., Dan Ari R., 2001. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (Pcr) [General
Principles And Implementation Of Polymerase Chain Reaction]. Unitas. Vol. 9, No. 1, P. 18-20.

Hewajuli, D. A., dan Dharmayanti. 2014. Perkembangan Teknologi Reverse Trascriptase-Polymerase Chain
Reaction dalam Mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan Newcastle Diseases. Wartazoa. Vol.
24, No. 1, p. 17-20

Nurwidayati, A. 2015. Aplikasi Teknik Schistosomiasis Berbasis Molekuler. Jurnal Vektor Penyakit. Vol. 9,
No. 1, p. 32.