IDENTIFIKASI CANDIDA MENGGUNAKAN PCR DAN NASTED PCR

DEFINISI :
PCR (Polymerase Chain Reation) adalah teknik memperbanyak fragmen DNA tertentu secara
eksponensial menggunakan enzim secara in vitro, yang dapat dilakukan secara cepat. Pada
awalnya metode ini hanya digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA tertentu, tetapi
sekarang berkembang sehingga dapat digunakan untuk mengamplifikasi dan melakukan
kuantitasi molekul mRNA. (Darmawati, 2022)
Nested PCR merupakan suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA memakai
pertolongan enzim DNA polymerase yang memakai dua pasang primer untuk mengamplifikasi
fragmen. Pasangan primer yang pertama akan mengamplifikasi fragmen yang cara kerjanya
mirip dengan PCR pada umumnya. Sedangkan, pasangan primer yang kedua biasanya dikata
nested primers (sepasang primer tersebut terletak di dalam fragmen pertama) yang berikatan di
dalam fragmen produk PCR yang pertama untuk memungkinkan terjadinya amplifikasi produk
PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang pertama. Dengan memakai nested
PCR, bila aci fragmen yang salah diamplifikasi karenanya probabilitas bidang tersebut
diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua sangat rendah. Dengan demikian,
nested PCR merupakan PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.
(www.p2k.unkris.ac.id)
Perbedaan Nested PCR dengan PCR
Nested PCR merupakan variasi dari reaksi polymerase chain reaction biasa (PCR). Nested PCR
dan PCR biasa keduanya berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam banyak
banyak. Pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya memakai
1 pasang primer. Oleh karena itu, hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih
pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu yang dibutuhkan dalam reaksi nested PCR
lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR diterapkan 2 kali reaksi PCR sedangkan
pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR merupakan
meminimalkan kealpaan amplifikasi gen dengan memakai 2 pasang primer.
(www.p2k.unkris.ac.id)

PRINSIP :
Prinsip PCR membutuhkan sebuah Enzim DNA polymerase yang bertugas untuk membuat
kopian strand DNA baru dengan menggunakan stand DNA yang sudah ada sebagai template. DNA
polimerase yang biasanya digunakan pada teknik proses PCR disebut dengan Taq polymerase, yaitu
enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik
ekstrem Thermus  aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil
membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA.
Selain Taq polymerase, primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat
menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam reaksi berantai (Polimerase Chain Reaction)
PCR, pelaku eksperimen sudah menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang akan dikopi dan
diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan digunakan. Primer PCR berupa single
stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada prinsip kerja PCR, digunakan
sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak.
(www.genecraftlabs.com)
Setelah primer berikatan dengan DNA templat, untai tunggal DNA akan diperpanjang oleh enzim
DNA polimerase dan daerah yang diapit akan terkopi.

Prinsip kerja nested PCR sama PCR biasa, namun nested PCR akan bekerja memakai dua pasang
primer untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik melewati dua bagian PCR secara
terpisah. Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan, di mana
sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di
selang kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Kesudahan produk PCR
pertama tersebut dijalankan pada bagian PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested
primer) akan mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR
pertama dan memulai amplifikasi bidang di selang kedua primer tersebut. Hasilnya merupakan
sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama.
(www.p2k.unkris.ac.id)
CARA KERJA :
Kunci dalam pelaksanaan reaksi PCR membutuhkan Taq Polymerase, Primer, DNA templat dan
nukleotida (blok pembangun DNA). Keseluruhan bahan digabung dalam sebuah tube, bersama
kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan dan pendingan berulang yang
memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA.
Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:

1. Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA

akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).
2. Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan
menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA.
3. Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan
membentuk strand DNA baru. (www.genecraftlabs.com)
Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan waktu sekitar 2-4 jam
bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi. Jika reaksinya efisien, wilayah target dapat berubah
dari hanya satu atau beberapa salinan menjadi milyaran. Karena ada banyak salinan atau untai ganda
primer dan banyak molekul Taq polymerase yang mengambang di sekitar reaksi, sehingga jumlah
molekul DNA kira-kira bisa berlipat ganda dalam setiap putaran siklus. Pola pertumbuhan
eksponensial ini ditunjukkan pada gambar di bawah ini.
Hasil dari reaksi PCR dapat divisualisasi menggunakan Gel Electrophoresis. Prinsip dari gel
electrophoresis yaitu pemanfaatan kutub positif dan negatif elektroda untuk menarik fragmen DNA
didalam matriks gel berarus listrik sehingga fragmen DNA terpisah berdasarkan ukurannya. Sebagai
standar digunakan DNA ladder untuk mengukur ukuran suatu fragment DNA hasil PCR. Fragmen DNA
dengan panjang yang sama membentuk ‘pita’ pada gel, yang dapat dilihat dengan mat ajika gel diwarnai
dengan pewarna pengikat DNA. Sebagai contoh, reaksi PCR yang menghasilkan fragmen 400 base pair
(bp) terlihat seperti pada gel.
Polymerase Chain Reaction PCR berkerja dengan visualisasi menggunakan gel elektroforesis
menggunakan mesin PCR konvensional. Dengan teknik ini, hasil PCR hanya dapat dilihat diakhir
setelah proses selesai menggunakan gel elektroforesis (kualitatif) dan tidak dapat dikuantifikasi.
Dengan perkembangan teknologi, kini hasil PCR dapat dilihat secara langsung dan dapat
terkuantifikasi menggunakan mesin Real-time PCR. Real-time PCR disebut juga dengan quantitative
PCR (qPCR) karena hasil PCR dapat analisis secara kuantitatif. (www.genecraftlabs.com)
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN :
Kelebihan PCR adalah dapat digunakan untuk melipatgandakan fragmen DNA secara cepat, dan
dapat juga untuk melipatgandakan DNA yang jumlahnya hanya sedikit, karena pada proses PCR
dibutuhkan DNA catakan cukup 5µg, selain itu reaksi PCR biasa dilakukan pada volumr kecil
25-50 µl. (Darmawati, 2022)
Kelebihan Nasted PCR, Kekurangan PCR dan Nasted PCR (BELUM)
APLIKASINYA :

PCR dan Nested PCR memiliki aplikasi yang banyak dalam bidang kesehatan. Karena nested

PCR memiliki sensitivitas dan spesifitas yang lebih tinggi dibanding PCR biasa, karenanya hasil
yang diperoleh akan lebih akurat. Keakuratan nested PCR karena daerah yang diinginkan akan
diamplifikasi dua kali, dengan dua set primer. Beberapa contoh aplikasinya diantaranya
merupakan dalam mendiagnosis penyakit Candidas yang disebabkan oleh Candida sp.
(www.p2k.unkris.ac.id)

Pada jurnal di atas bertujuan untuk membandingkab RT-PCR (Can-G) dan Nasted PCR
dengan kultur darah untuk diagnosis Candida spp. Sampel diperoleh dari pasien yang dirawat di
rumah sakit Universitas Sfax, Tunusia. Sampel dievaluasi dengan cara kultur darah, Nasted PCR
dan RT-PCR. Sebanyak 10 mL darah segar dari paisen diinokulasi secara aspetis ke dalam botol
kultur darah berisi 50 mL media cair Sabouraud dan diinkubasi pada suhu 37°C maksimal
selama 14 hari. DNA diekstraksi langsung dari 200 µL darah + sampel kultur media dari botol
kultur sebelum inkubasi. Identifikasi fenotif jamur didasarkan pada penilaian tabung kuman dan
profil asimilasi karbohidrat di ID 32 C. Ekstraksi DNA fenol-kloroform dan nasted PCR terkait
prosedur seperti pada umumnya. Ekstraksi DNA, pencampuran dan penggambungan dari
template DNA ke dalam campuran dilakukan ditempat terpisah. Sampel diuji menggunakan Can-
G dan Can-S, semua sampel diuji dengan Can-G kemudian yang positif dilanjutkan dengan uji
Can-S. Uji Can-G dengan RT-PCR mentargetkan gen 18S rRNA dari genus Candida.
Species-specific real-time PCR
Uji RT-PCR yang kedua disebut sebagai Can-S, transkripsi internal yang ditargetkan 1 (ITS1),
5,8S, ITS2 pada rDNA (sama dengan nasted PCR) dengan TaqMAN probe yang dirancang untuk
mendeteksi 5 spesies : C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis and C. parapsilosis.
PCR conditions
Sampel dianalisis menggunakan Mx 4000 RT-PCR. Setiap 25 µL campuran PCR terdiri
dari 2 µL alikuot sampel DNA, 1x PCR buffer, 3,5 mM MgCl2, masing-masing 0,2 µM primer,
deoksiribonukleosida trifosfat pada konsentrasi 0,2 mM, 0,2 µM setiap probe spesifik, 2 U Taq
DNA polimerase, dan 0,5 µL pewarna referensi pasif 6-karboksi x-rhodamin (ROX). Kondisi
siklus termal terdiri dari denaturasi pada 95°C selama 10 menit, diikuti oleh 45 siklus 30 detik
pada 95°C dan 1 menit pada 54°C. Reaksi positif ditandai dengan jumlah siklus (CT) di mana
fluoresensi dasar ambang batas terlampaui. Baik probe berlabel VIC dan FAM digunakan dalam
kombinasi dalam setiap proses PCR Can-G. Dalam Uji Can-S, probe VIC dan FAM digunakan
dalam kombinasi (C. albicans + C. tropicalis; C. glabrata + C. parapsilosis); itu Probe C.
krusei digunakan secara tunggal.
Real-time PCR analytical sensitivity
Darah dari sukarelawan sehat ditambhakan sel C. albicans digunakan untuk menentukan ambang
deteksi DNA jamur pada DNA manusia. DNA yang diekstraksi adalah diencerkan secara serial
pada kisaran 104 –10°C. albicans CFU. Itu ambang deteksi teoritis (jumlah genom setara/tabung
reaksi) dan ambang deteksi klinis (jumlah CFU/mL darah) dihitung.
Hasil
DAFTAR PUSTAKA
Sri Darmawati, (2022) SISTEMATIKA POLIFASIK. Edited by Kedua. Yogyakarta: Salma Idea.

https://p2k.unkris.ac.id/id3/3073-2962/Nested-Pcr_203195_p2k-unkris.html
https://genecraftlabs.com/id/prinsip-kerja-pcr-serta-penjelasannya/