PCR

( Polymerase Chain Reaction )

&
Pustaka Genom

Dosen Pengampu : Dra. Diah Karunia Binawati, M.Si

Presentasi oleh Kelompok 3

Nama Kelompok
Ananda Septa R. (192500001)
Wahyu Bimantoro (192500002)
Sarah Irfani H. (192500003)
Nirmalah Lukman (192500005)
Dina Anggraini (192500007)
Ridho Pratama F. (192500029)
M. Masrukhan (192500031)
 POKOK PEMBAHASAN
1 2 3
Pengertian PCR Tahap - Tahapan Komponen yang
PCR dibutuhkan dalam
PCR

4 5 6
Variasi dari PCR Manfaat PCR Pustaka Genom
 PENGERTIAN PCR
( Polymerase Chain Reaction )
Reaksi berantai polimerase atau PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau
metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan
teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada
tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut.

Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis

enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR
dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua
kali jumlahnya. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan
bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan
amplifikasi urutan non-target.
 Tahap-Tahapan PCR
Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu
1) Denaturasi DNA template
Proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang
menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan primer dan
tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-
95°C selama beberapa menit.
2) Penempelan (annealing) primer
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah
yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Ikatan hidrogen
akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat.
Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50°C – 60°C.
3) Polimerisasi (extension) rantai DNA
Reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72°C.
Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi
3’nya dengan penambahan NTP yang komplemen dengan template oleh
DNA polimerase.
 KOMPONEN - KOMPONEN PCR

DNA Polymerase PRIMER REAGEN

Enzim ini bisa dipakai Primer merupakan Komponen ini adalah dNTP untuk
untuk perpanjangan dan oligonukleotida pendek reaksi polimerisasi, dan buffer yang
hasilnya menjadi kurang rantai tunggal yang mengandung MgCl2. Konsentrasi
spesifik. mempunyai urutan ion Mg2+dalam campuran reaksi
komplemen dengan DNA merupakan hal yang sangat kritis.
Dalam perkembangannya templat yang akan
kemudian dipakai enzim Taq diperbanyak. Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat
DNA polymerase yang mempengaruhi proses primer
memiliki keaktifan pada suhu annealing, denaturasi, spesifisitas
tinggi. produk, aktivitas enzim dan
fidelitas reaksi.
 Variasi PCR
1) Alel-spesifik PCR : kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada -nukleotida polimorfisme
tunggal (SNP) .
2) Polymerase Cycling Assembly (PCA) : sintesis buatan urutan DNA yang panjang dengan
melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan segmen tumpang tindih pendek.
3) Asymmetric PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda.
4) Amplifikasi tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan suhu
konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan annealing / siklus ekstensi.
5) Hot Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama proses set up awal
tahapan PCR.
6) PCR spesifik Inter Sequence (ISSR) : metode PCR untuk sidik jari DNA yang memperkuat
daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan sidik jari yang unik dengan
panjang fragmen diperkuat.
7) Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit sekitar genom
sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi diri .
 Variasi PCR
8) Mediated PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan DNA kepentingan
dan beberapa primer anil ke linker DNA
9) PCR spesifik Metilasi (MSP): digunakan untuk mendeteksi metilasi dari CpG pulau dalam
DNA genom.
10) Mini Primer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat
memperpanjang dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida.
11) Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda.
12) Nested PCR : meningkatkan kekhususan amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar
belakang karena khusus non amplifikasi DNA.
13) Tumpang tindih-ekstensi PCR : sebuah rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk
splice bersama lebih fragmen DNA atau dua yang berisi urutan komplementer.
14) Kuantitatif PCR (Q-PCR): digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR (umum secara
real-time).
15) RT reverse transcription PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA.
 Manfaat dari PCR
Beberapa manfaat PCR diantaranya :
a) Amplifikasi urutan nukleotida.
b) Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang
mengalami mutasi
c) Bidang kedokteran forensik.
d) Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan
“finger print”.
e) Diagnosa Penyakit.
Contohnya seperti Covid-19 yang menjadi pandemi dan
memerlukan hasil tes cepat dan akurat.
 Pustaka Genom
Pustaka genom merupakan koleksi berbagai klon bakteri yang berisi
plasmid rekombinan maupun koleksi klon fage yang mengandung DNA
rekombinan. Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid rekombinan atau
setiap DNA fage rekombinan membawa salah satu potongan atau fragmen
DNA genom yang dipelajari.

Untuk membangun pustaka genom, DNA organisme diekstraksi dari sel

dan kemudian dicerna dengan enzim restriksi untuk memotong DNA menjadi
fragmen dengan ukuran tertentu. Fragmen tersebut kemudian dimasukkan ke
dalam vektor menggunakan DNA ligase. Selanjutnya, DNA vektor dapat
diambil oleh organisme inang - umumnya populasi Escherichia coli atau ragi -
dengan setiap sel hanya mengandung satu molekul vektor. Menggunakan sel
inang untuk membawa vektor memungkinkan amplifikasi dan pengambilan
klon tertentu dari perpustakaan untuk analisis dengan mudah.
 KONTRUKSI PUSTAKA GENOM
Konstruksi perpustakaan genom melibatkan pembuatan banyak molekul DNA
rekombinan. DNA genom suatu organisme diekstraksi dan kemudian dicerna dengan
enzim restriksi. Untuk organisme dengan genom yang sangat kecil , fragmen yang
dicerna dapat dipisahkan dengan elektroforesis gel. Fragmen yang terpisah dapat diklon
ke dalam vektor secara terpisah.

Namun, ketika genom besar dicerna dengan enzim restriksi, ada terlalu banyak
fragmen untuk dipotong satu per satu. Seluruh rangkaian fragmen harus diklon
bersama dengan vektor, dan pemisahan klon dapat terjadi setelahnya. Dalam kedua
kasus, fragmen diikat menjadi vektor yang telah dicerna dengan enzim restriksi yang
sama. Vektor yang mengandung fragmen DNA genom yang disisipkan kemudian dapat
dimasukkan ke dalam organisme inang.

Lanjutan >>>
 Di bawah ini adalah langkah-langkah untuk
membuat pustaka genom dari genom besar :

1) Ekstrak dan pemurnian DNA

2) Mencerna DNA dengan enzim restriksi. Ini
menciptakan fragmen yang ukurannya serupa,
masing-masing berisi satu atau lebih gen
3) Masukkan fragmen DNA ke dalam vektor yang
dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Gunakan
enzim DNA ligase untuk menyegel fragmen DNA ke
dalam vektor. Ini menciptakan kumpulan besar
molekul rekombinan
4) Molekul rekombinan ini diambil oleh bakteri inang
melalui transformasi, menciptakan pustaka DNA
Terima Kasih