MAKALAH

APLIKASI PCR PADA PERKEMBANGAN MIKROBIOLOGI

MOLEKULER

Oleh :

ADE RIFKA JUNITA

P062191028

PROGRAM PASCA SARJANA STUDI BIOMEDIK

KONSENTRASI MIKROBIOLOGI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2019
 BAB I

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang semakin pesat.
Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah
bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah dan rekayasa
terhadap organisme, sistem, atau proses biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan potensi
organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia. Secara
umum bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan bioteknologi
modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang memanfaatkan mikroba, proses
biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Bioteknologi tradisional ini terus
mengalami perkembangan hingga ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan
lainnya. Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan tentang
DNA, muncullah istilah bioteknologi modern.
Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau
rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan
memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri,
hewan, dan tumbuhan. Produk dari bioteknologi modern, misalnya insulin, kloning domba Dolly,
antibodi monoklonal. Dalam aplikasinya, bioteknologi menerapkan berbagai macam disiplin ilmu.
Disiplin ilmu tersebut antara lain: mikrobiologi (tentang mikroba), biologi sel (tentang sel), genetika
(tentang pewarisan sifat makhluk hidup), dan biokimia (tentang makhluk hidup dilihat dari aspek
kimianya). Salah satu pokok bahasan yang penting untuk di pahami yaitu mengenai Polymerase
Chain Reaction atau yang lebih dikenal dengan istilah PCR.
PCR adalah suatu metode in vitro untuk menghasilkan sejumlah fragmen DNA spesifik
dengan panjang dan jumlah skuens yang telah ditentukan dari jumlah kecil template kompleks.
PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan dapat diaplikasikan dalam
berbagai bidang seperti biologi molekuler, genetika populasi, dan analisis forensik. Mengingat
peningnya peranan teknik PCR ini terhadap perkembangan ilmu pengetahuan kedepan
 BAB II
PEMBAHASAN

A. Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (Polymerase Chain
Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik
tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar
dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan
DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia
dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA
ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi
akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan
bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan
non-target.
Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan
adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan
perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya
saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik
PCR dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA
yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang beberapa
puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan.
Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk
mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang
menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan
tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini
semakin luas penggunaannya.
PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua
oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung 5’dari dua untaian skuen target.
Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer PCR) untuk memungkikan DNA template
 dikopi oleh DNA polimerase. Untuk mendukung terjadinya annealing primer ini pada template
pertama kali diperlukan untuk memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan.
Hampir semua aplikasi PCR mempekerjakan DNA polimerase yang stabil terhadap panas, seperti
polimerase Taq. Awalnya enzim diisolasi dari bakteri Aquaticus Thermus. DNA polimerase
enzimatis ini merakit sebuah untai DNA baru dari pembangunan blok DNA, nukleotida , dengan
menggunakan DNA beruntai tunggal sebagai template dan oligonukleotida DNA (juga disebut
primer DNA ), yang dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR
menggunakan siklus termal , yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan sampel PCR untuk
serangkaian langkah pasti suhu

B. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat, penempelan
(annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Denaturasi merupakan proses
pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat)
sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan
singkat pada suhu 90-95°C selama beberapa menit. Penjelasan ringkas tentang setiap siklus
reaksi PCR adalah sebagai berikut:
Ø Denaturasi.
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal.
Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen
diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan,
misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara
suhu 90 C – 95̊ C.
Ø Penempelan Primer.
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik
yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan
terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan
pada suhu 50oC – 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen
tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi
polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.
Ø Reaksi Polimerisasi (extension).
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC.
Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan
penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.
 Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di
amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai
jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah
jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah
satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi
8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR
dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan
menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan.
Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang
ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu
alat yang disebut thermocycler.

Gambar 01. Proses Amplikasi Secara Eksponensial.

Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
Ø Pra-Denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi
dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih
dahulu).
Ø Final Elongasi/Extention
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk
memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna.
Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.
C. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)
1. DNA
Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk
pembentukan molekul DNA baru yang sama. DNA template ini dapat berupa DNA
kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asalkan di dalam DNA
template tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA
templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel
ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan
menggunakan metode standar. Untuk aplikasi PCR, kemurnian DNA mempengaruhi
hasil.DNA yang tidak murni sering menyebabkan masalah reproduksibilitas, tujuan
utama juga digunakan untuk diagnosis. DNA yang digunakan harus dimurnikan dahulu
sebelum diproses dengan PCR. DNA yang digunakan sebagai cetakan untuk PCR
sebaiknya bebas nukleuse, endo-atau eksoprotease, dan DNA-binding protein.
2. Primer
Primer yaitu suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida) yang mempunyai
urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat, dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, dan enzim DNA polimerase (Reece
2004: 153). Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang
diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat
 menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer.
Terdapat dua dua jenis primer dalam suatu reaksi PCR yaitu primer reverse dan
forward yang bekerja pada dua untai berbeda (sense dan antisense) dalam satu DNA
(Nicholl 2002: 121).
Syarat – syarat primer meliputi panjang primer, kandungan GC, dan melting
temperature. Panjang primer berkisar antara 18 – 30 basa. Primer dengan panjang
kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah sehingga
memungkinkan terjadinya mispriming. Kandungan GC yang ideal dalam primer
adalah sekitar 50%. Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai
ganda DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer
akan berpengaruh di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Suhu optimalnya
berkisar antara 50 0C sampai 60 0C. Selain itu, juga tidak boleh terjadi self dimmer,
pair dimmer, atau hairpin (Roche diagnostics 2006 : 41).
3. Dntp (Deoxynucleotide triphosphate)
dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat),
dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin
trifosfat). dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses
ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer
membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template (Kusuma
2010 : 12).
4. Polimerase DNA
Polimerase DNA merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan. Umumnya
digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap
stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik
didih air. Polimerase DNA berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerisasi DNA.
Pada proses PCR enzim ini juga diperlukan untuk tahap ekstensi DNA (Nicholl 2002:
124).Ketika terjadi sintesis DNA,enzim polimerase DNA akan melakukan seleksi
nukleotida yang tepat untuk ditambahkan ke primer untuk melanjutkan DNA sesuai
dengan aturan pasangan basa Watson-Crick ( A-T dan G-C ). Oleh karena itu,
Polimerase DNA selalu mengkatalis sintresis DNA dalam orientasi 5’ ke 3’. Beberapa
polimerase DNA juga memiliki aktivitas eksonuklease atau yang sering disebut
dengan aktivitas proofreading yang akan memeriksa basa yang telah ditambahkan
untuk menumbuhkan untai DNA. Ketika terjadi penambahan nukleotida yang tidak
tepat aktivitas proofreading tersebut akan membuang basa yang tidak tepat
 tersebut.Mekanisme koreksi ini akan meningkatkan akurasi atau yang disebut juga
dengan fidelitas. Ketika membandingkan atau memilih polimerase DNA untuk PCR
ada dua hal yang penting yang harus dilihat yaitu fidelitasnya dan efisiensi sintesisnya.
Yaitu makin tinggi fidelitas dan efisiensi sintesisnya makin baik polimerase DNA
tersebut (dan makin mahal juga harganya).
5. Buffer reaksi PCR
Fungsi buffer yaitu untuk menjaga keseimbangan pH medium. Umumnya buffer PCR
mengandung senyawa MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi
menstimulasi aktivitas DNA polimerase. MgCl2 tersebut juga akan meningkatkan
interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP. Bufer
reaksi PCR biasanya mengandung Mg2+, kation monovalen, dan beberapa co-solvent.
Co-solvent membantu menstabilisasi enzim polimerase DNA, mempengaruhi kerja
enzim, dan atau DNA melting temperature ( Tm). Ion Monovalen seperti Na+, K+, dan
NH4+ menstimulasi aktivitas polimerase DNA dan melindungi muatan negatif gugus
fosfat DNA, sehingga melemahkan kekuatan kekuatan elektronik yang saling menolak
antara primer dan DNA target.

D. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:
Amplifikasi urutan nukleotida,Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang
mengalami mutasi,Bidang kedokteran forensic, Melacak asal-usul sesorang dengan
membandingkan“finger print”.Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai
macam kebutuhan, diantaranya:
 Isolasi Gen.
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia
saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Fungsi
utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi
protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk
menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian
yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein
atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita
harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian
menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek
samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin
manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin
dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar
bakteri dapat memproduksi insulin. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang
dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih
cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus
‘mengorbankan’ sapi atau babi.
Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang
memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa
dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
 DNA Sequencing.
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang
umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah
dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi
PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR
biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel
fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa
suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
 Identifikasi Forensik.
Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban
kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak
mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat
diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk
mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari,
yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari
keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika
memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang
dimaksud.
Banyak orang yang juga yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua
‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
 Diagnosa Penyakit.
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini,
bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan
diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan.
Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat.
Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri
khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

E. Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)

Ada banyak variasi dari PCR yang umum di kenal, antara lain:
1. Alel-spesifik PCR : atau kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada -nukleotida
polimorfisme tunggal (SNP) Hal ini membutuhkan pengetahuan sebelumnya dari
urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan menggunakan primer yang 3
'berakhir meliputi SNP. amplifikasi PCR dalam kondisi ketat jauh kurang efisien dalam
adanya ketidaksesuaian antara template dan primer, amplifikasi sukses jadi dengan
kehadiran sinyal primer spesifik-SNP dari SNP spesifik secara berurutan.
2. Polymerase Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang panjang
dengan melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan segmen tumpang
tindih pendek. The oligonukleotida bergantian antara rasa dan arah antisense, dan
segmen tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR, sehingga selektif
menghasilkan produk DNA panjang akhir.
3. Asymmetric PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda.
Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi probing amplifikasi hanya satu
dari dua untai komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti biasa, tetapi dengan
kelebihan besar primer untuk untai yang ditargetkan untuk amplifikasi. Karena (lambat
aritmatika amplifikasi) kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah
digunakan Facebook, siklus PCR tambahan yang diperlukan.
4. Amplifikasi tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan
suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan annealing / siklus ekstensi.
DNA helikase , sebuah enzim yang unwinds DNA, digunakan di tempat denaturasi
termal.
5. Hot Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama proses set
up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan memanaskan
komponen reaksi terhadap temperatur leleh (misalnya, 95°C) sebelum menambahkan
polimerase. Khusus sistem enzim telah dikembangkan yang menghambat polimerase,
aktivitas pada suhu sekitar, baik oleh mengikat dari antibodi atau oleh kehadiran
inhibitor yang terikat kovalen yang terdisosiasi hanya setelah suhu aktivasi langkah-
 tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak
aktif pada suhu kamar dan akan segera diaktifkan pada suhu perpanjangan.
6. PCR spesifik Intersequence (ISSR): metode PCR untuk sidik jari DNA yang
memperkuat daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan sidik
jari yang unik dengan panjang fragmen diperkuat.
7. Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit sekitar
genom sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi diri, sehingga
diketahui pada urutan kedua ujung urutan tidak diketahui.
8. Mediated PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan DNA
kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, tetapi telah digunakan untuk
sekuensing DNA , berjalan genom , dan DNA footprinting.
9. PCR spesifik Metilasi (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim Herman di
Johns Hopkins School of Medicine dan digunakan untuk mendeteksi metilasi dari CpG
pulau dalam DNA genom. DNA pertama diobati dengan natrium bisulfit, yang
mengubah unmethylated basa sitosin ke urasil, yang diakui oleh primer PCR sebagai
timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan primer set
identik kecuali pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada titik-titik ini, satu set
primer mengakui DNA dengan sitosin untuk mengamplifikasi DNA alkohol, dan satu
set mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk mengamplifikasi DNA
unmethylated. MSP menggunakan qPCR juga dapat dilakukan untuk mendapatkan
informasi kuantitatif daripada kualitatif tentang metilasi.
10. Miniprimer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat
memperpanjang dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida.
Metode ini memungkinkan menargetkan untuk mengikat PCR primer daerah yang
lebih kecil, dan digunakan untuk memperkuat sekuens DNA, seperti atau eukariotik
18S rRNA).
11. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): izin beberapa sasaran
diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari
keterbatasan resolusi PCR multipleks.
12. Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari
lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak
waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus
 dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon.
Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band
yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .
13. Nested PCR : meningkatkan kekhususan amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar
belakang karena khusus non amplifikasi DNA. Dua set primer yang digunakan dalam
dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi pertama, sepasang primer digunakan untuk
menghasilkan produk DNA, yang selain target yang dimaksud, masih dapat terdiri dari
fragmen DNA non-khusus diperkuat. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam
PCR kedua dengan satu set primer yang mengikat situs sebagian atau seluruhnya
berbeda dari dan terletak 3 'dari masing-masing primer yang digunakan dalam reaksi
pertama. Nested PCR sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen spesifik DNA
yang panjang dari PCR konvensional, tapi membutuhkan pengetahuan lebih rinci
tentang urutan target.
14. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi (BUMN)
: sebuah rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk splice bersama lebih
fragmen DNA atau dua yang berisi urutan komplementer. Hal ini digunakan untuk
bergabung dengan potongan DNA yang mengandung gen, urutan peraturan, atau
mutasi, teknik tersebut memungkinkan penciptaan DNA spesifik dan panjang
konstruksi.
15. Kuantitatif PCR (Q-PCR) : digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR (umum
secara real-time). Ini secara kuantitatif jumlah ukuran mulai DNA, cDNA, atau RNA.
Q-PCR biasanya digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam
sampel dan jumlah salinan dalam sampel. Kuantitatif real-time PCR memiliki tinggi
tingkat yang sangat presisi. QRT-PCR metode menggunakan pewarna fluorescent,
seperti Sybr Green, EvaGreen atau fluorophore DNA probe yang mengandung seperti
TaqMan, untuk mengukur jumlah produk yang diperkuat secara real time. Hal ini juga
kadang-kadang disingkat RT-PCR (R T ime Bit PCR) atau RQ-PCR. QRT-PCR atau
RTQ-PCR sesuai kontraksi lebih, karena RT-PCR umumnya mengacu pada reverse
transkripsi PCR (lihat di bawah), sering digunakan dalam hubungannya dengan Q-
PCR.
16. RT reverse transcription PCR (RT-PCR) : untuk memperkuat DNA dari RNA. Reverse
transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang kemudian diamplifikasi
dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profiling ekspresi , untuk
menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan dari transkrip RNA,
 termasuk start transkripsi dan situs penghentian. Jika urutan DNA genom gen
diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi ekson dan intron dalam
gen. 5 'akhir dari gen (sesuai dengan awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh
RACE-PCR (Rapid Amplifikasi cDNA End).
17. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR ) : untuk isolasi dari suatu urutan yang
tidak diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan diketahui, TAIL-PCR
menggunakan sepasang nested primer dengan suhu yang berbeda anil; degenerate
primer digunakan untuk memperkuat yang lain dari arah yang tidak diketahui.
18. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR) : sebuah varian dari PCR yang bertujuan
untuk mengurangi latar belakang spesifik secara bertahap menurunkan suhu anil
sebagai bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada awal siklus biasanya beberapa
derajat (3-5 ° C) di atas m T primer yang digunakan, sedangkan pada siklus kemudian,
ini adalah beberapa derajat (3-5°C) di bawah T primer m. Suhu tinggi memberikan
spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah izin
lebih amplifikasi efisien dari produk tertentu terbentuk selama siklus awal.

F. iCycler (Thermal Cycler)

iCycler merupakan alat untuk melakukan reaksi PCR. Alat ini dilengkapi dengan sistem
peltier yang berfungsi sebagai heater dan cooling dalam reaksi PCR. Program dalam
iCyler sangat lengkap. Kita dapat membuat atau mengedit protokol yang ada. Selain itu,
iCycler mempunyai kelebihan dalam hal thermal gradient. Thermal gradient ini berfungsi
apabila kita ingin melakukan optimasi dari primer yang akan kita gunakan. Dengan adanya
thermal gradient, maka kita dapat dengan mudah untuk mengetahui suhu optimum dari
primer yang akan digunakan sehingga produk PCR dapat teramplifikasi dengan baik.
Dalam program iCycler, satu protokol dapat memuat sampai 9 cycle. Dalam satu cycle
dapat memuat sampai 9 step.Selain itu, banyaknya pengulangan dapat sampai 600 kali
pengulangan.
Keunggulan lain dari iCycler adalah iCycler dapat di upgrade menjadi real time PCR
dengan menambahkan suatu optik modul.iCycler memiliki beberapa Feature Yaitu :
1. Tombol pada iCycler
Dalam iCycler terdapat 25 macam tombol (gambar 1). Fungsi dari masing-masing
tombol tersebut dapat dilihat pada tabel di bawah ini.
 Gambar 1 Tombol-tombol yang terdapat pada mesin iCycler

Tabel 1 Fungsi dari tombol-tombol yang ada pada mesin iCycler

Tombol Fungsi
F1-F5 Tombol F1-F5 merupakan tombol yang akan menuntun
kita dalam melakukan navigasi program yang ada dalam
mesin tersebut. Pada Home Screen , tombol 1 merupakan
tombol Protocol Library (database file). Tombol F2
(Create)digunakan
apabila ingin membuat protokol baru. F3 (Change User)
digunakan
apabila kita ingin mengubah user.

Digunakan untuk kembali ke menu sebelumnya. Tapi apabila

Back layar
tampil dalam keadaan Home Screen maka tombol back tidak
akan
berfungsi.
 Terdapat tombol angka 0-9 yang masing-masing angka
Alphanumeric kecuali 0 dan 1
juga berfungsi untuk menuliskan huruf-huruf. Tombol
alphanumeric ini
berfungsi apabila ingin membuat protokol, mengetik user, dan
lainnya/
Untuk mengetik angka, tekan Shift dan kemudian tekan angka
yang
dituju.

Decimal Apabila ingin memasukkan angka desimal maka tekan

Point decimal point
dan kemudian tekan angka yang diinginkan

Digunakan untuk menghapus angka atau huruf yang telah

Clear dimasukkan

Membantu untuk pengoperasian angka dan untuk running

Shift overnight

2. Penggunaan Program dengan iCycler

a. Logging On
Ketika tombol On pada mesin iCycler ditekan maka monitor pada layar mesin
akan menunjukkan tampilan Logging On (Gambar 2).
 Gambar 2 Tampilan Logging On pada layar mesin iCycler
Register user dipilih apabila kita sudah pernah memakai alat tersebut dan
menyimpan nama pengguna dalam program tersebut. Nama pengguna inilah
yang nantinya akan menjadi akses kita untuk masuk ke program tersebut. New
User dipilih apabila kita merupakan pengguna baru yang belum terdaftar di
register user (Gambar 3).
User dilengkapi dengan kode Personal Identification Number (PIN). Dengan
adanya PIN maka hanya orang-orang tertentu yang mengetahui nomor PIN
tersebut yang dapat membuka bagian ini. Nomor PIN akan expired apabila
user tidak pernah Log On dalam waktu 30 hari.
 Gambar 3 Tampilan New User dalam program iCycler
b. New User

Cara melakukan New User Name adalah sebagai berikut :

1. Tekan New User pada gambar 2

2. Tekan Enter
3. Gunakan tombol-tombol yang ada di mesin iCycler untuk membuat
nama.
- Untuk spasi tekan F3-Space
- Untuk huruf besar tekan F2-Capslock
- Untuk menulis angka tekan Shift dan akan yang diinginkan
- Untuk menghapus tulisan/angka tekan F1-Clear/ tombol Clear
4. Setelah selesai membuat nama, tekan Enter
5. Muncul tampilan PIN atau No Pin
Jika tidak menggunakan PIN :
 Pastikan bahwa pilihan No Option yang dipilih
 Tekan Enter dan kemudian tampilan Home akan mucul
Jika menggunakan PIN :
 Tekan Use PIN dan kemudian tekan Enter
  Masukkan 1-12 angka pada kotak PIN pertama dan kemudian
tekan enter
 Masukkan nomor PIN yang sama dengan yang pertama untuk
konfirmasi
 Tekan Enter dan akan muncul tampilan Home pada layar
Registered User

Apabila kita sudah terdaftar dalam registered user :

1. Periksa apakah pilihan Registered User yang kita pilih

2. Tekan Enter dan kemudian akan muncul berbagai nama user
3. Gunakan tanda panah untuk memilih nama user
4. Jika menggunakan PIN, masukkan nomor PIN dan tekan Enter
kemudian akan muncul tampilan Home (Gambar 4)
Penggantian Nama User
Untuk masuk dengan nama user yang berbeda :

1. Tekan Change User pada tampilan Home (gambar 4)

2. Pilih/ganti user yang ingin digunakan
Menghapus User
1. Tekan item protocol library pada tampilan Home

2. Pilih nama user yang ingin di hapus kemudian tekan Enter

3. Konfirmasi pilihan untuk menghapus user dan tekan Enter

 Gambar 4 Tampilan Home pada program iCycler

c. Home Screen
Tampilan Home adalah tampilan yang pertama kali muncul ketika telah
melewati tahap Logging On. Tampilan home mencakup logo iCycler, tanggal
dan user name (Gambar 4). Home screen dapat diakses kapan saja dengan
menekan Shift kemudian F1.Berikut adalah keterangan tombol-tombol yang
terdapat dalam tampilan Home :
F1 : Protocol Library, untuk menampilkan daftar protokol yang telah disimpan
F2 : Create, untuk membuat protokol baru
F3 : Change User, untuk mengubah user yang telah ada
F4 : Utilities, untuk melakukan customization pada iCycler
F5 : Info, untuk menampilkan informasi penting yang berkaitan dengan
program
3. Prosedur Penggunaan (Quick Guide)

Berikut ini adalah cara cepat penggunaan program iCycler :

 1. Nyalakan mesin iCycler dengan menekan tombol On pada bagian kanan
alat
2. Jika terdaftar sebagai Registered User I (lihat Gambar 2), tekan Enter dan
pilih user dari daftar pilihan. Jika belum terdaftar, tekan New User dan
tekan Enter. Masukkan nama dan masukkan nomor PIN apabila
diperlukan
3. Run.
a) Dari tampilan Home, tekan F1-Protocol Library (lihat Gambar 4)
b) Pilih protocol yang diinginkan
c) Tekan Enter, pilih Run Protocol
d) Konfirmasi pilihan pada Run Setup Screen
e) Tekan F5-Begin Run untuk mulai Run
 Edit Protokol

Untuk meng edit protokol yang sudah ada, dapat dilakukan dengan cara :

1. Dari tampilan Home, tekan F1-Protocol Library (lihat Gambar 4)

2. Gunakan tanda panah untuk memilih protokol yang akan di edit dan tekan
enter
3. Dari menu pilihan, pilih Edit Protokol
4. Ubah protokol sesuai yang diinginkan
a) Untuk menambahkan/menghapus cycle atau step, tekan F4
Add/Del
b) Untuk memilih penurunan/kenaikan suhu, tekan F3-Option
c) Untuk menjalankan program Gradient, tekan F3-Option
d) Untuk mengatur Ramping Time, tekan F3-Option
5. Setelah selesai meng edit, tekan F5-Done
a) Kita dapat memilih mulai Run tanpa melakukan Save protokol
yang telah di edit tadi dengan memilih Run Protocol
b) Apabila ingin menyimpan protokol, pilih Save Protocol atau Save
Protocol As dari tampilan pilihan yang disediakan. Setelah itu, pilih
Run Protocol
 Membuat Protokol

Cara membuat protokol adalah sebagai berikut :

1. Dari tampilan Home, tekan F2-Create (lihat Gambar 4)
2. Gunakan tanda panah dan pilih Custom
3. Edit/buat protokol sesuai yang diinginkan
a) Untuk menambahkan/menghapus cycle atau step, tekan F4 Add/Del
b) Untuk memilih penurunan/kenaikan suhu, tekan F3-Option
c) Untuk menjalankan program Gradient, tekan F3-Option
d) Untuk mengatur Ramping Time, tekan F3-Option
4. Setelah selesai meng edit, tekan F5-Done
a) Kita dapat memilih mulai Run tanpa melakukan Save protokol yang telah
di edit tadi dengan memilih Run Protocol
b) Apabila ingin menyimpan protokol, pilih Save Protocol atau Save
Protocol As dari tampilan pilihan yang disediakan. Setelah itu, pilih Run
Protocol.
 G. Ringkasan

Polymerase chain reaction atau reaksi polymerase berantai yang lebih sering dikenal dengan

singkatan PCR adalah suatu metode dalam mengamplifikasi (memperbanyak) nukleotida secara

enzimatik yang dilakukan secara invitro. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-

106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence

yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik) dalam waktu yang singkat.

PCR diciptakan pada abad ke IX sebagai cara untuk membuat banyak salinan dari fragmen

DNA dilaboratorium, berkisar pada tahun 1983-1987 kary mullis menemukan sebuah teknik untuk

menggandakan urutan basa nukleotida tertentu secara invitro. Sehingga pada sekarang metode

PCR semakin berkembang pesat.

Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai

temperatur yang berbeda. Thermal-cyler adalah nama alat dari yang digunakan dalam teknik

PCR yang pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986, akan tetapi masih memiliki banyak

kelemahan pada saat itu yaitu, DNA polymerase yang digunakan masih belum thermostabil, dan

harus ditambahkan pada setiap siklus dari proses PCR tersebut , kelemahan yang lain yaitu

mengenai temperatur 37oC yang digunakan dapat menyebabkan non-spesifik priming sehingga

menghasilkan produk yang tidak dikehendaki. Setelah itu baru pada tahun 1988 enzim Taq DNA

polymerase ditemukan yang diisolasi dari bakteri thermus aquitus (Taq) dimana diketahui enzim

ini dapat bertahan pada suhu yang tinggi misalkan pada suhu 100 oC. Dan aktifitas maksimalnya

itu pada suhu 92-95 oC.

Teknik PCR ini dapat digunakan untuk :

 isolasi gen

 DNA sequensing

 sangat membantu bidang kedokteran forensik

 dapat digunakan dalam melacak asal usul seseorang.

 Diagnosa penyakit, dll

PCR ini sangatlah efisien karena dapat dilakukan dengan waktu yang singkat ,

adapun komponen - komponen yang dibutuhkan yaitu:

 DNA template

adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan

digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence).

Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil

polimerisasi molekul primer.

 Primer

primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas

oligonukleotida pendek yaitu sekitar 30 asam basa. Primer disusun dari sintesis

oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus mampu mengenali urutan

yang akan diamplifikasi. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya

penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA

polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus

termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA

yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Untuk standar amplifikasi

sepasang primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa

panjangnya pada tiap primernya, kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing

temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar antara 1°C. Ujung 3’ dari

setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari susunan nukleotida G/C berturut-

turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada

penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan primer

tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu

sama lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada

daerah DNA repetitif.

 Taq DNA polymerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas

polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini

mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95ºC. Biasanya untuk setiap 100μl

volume reaksi ditambahkan 2.0 - 2.5 unit.

 PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

buffer biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia yang digunakan untuk

mengkondisikan reaksi agar dapat berjalan optimum dan menstabilkan enzim

polymerase. Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl

(pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk

DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum

dengan kombinasi yang lain.Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer

merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi

proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk

PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini

penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi

chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas

bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir

PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk

PCR yang tidak diinginka Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk

tanpa atau dengan MgCl2.

 Deoksinukleotida trifosfat (dNTP)

dNTP diketahui sebagai bahan pensintesis molekul. DNTP atau building

block dikenal sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. Dimana dNTP terdiri

atas dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP.

Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM. Pada

konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik

estimasi Km untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi

yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase.

Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang

tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait

dan tidak akan merubah secara bebas.