LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI

MOLEKULER 2

Topik : AMPLIFIKASI DNA DENGAN POLYMERASE CHAIN

REACTION (PCR) : PCR GRADIENT
Minggu : Ke-2

Nama : Muhammad Iqbal

No BP : 2010342005
Program Studi S1 Ilmu Biomedis
Fakultas Kedokteran
Universitas Andalas, Padang
2021
 AMPLIFIKASI DNA DENGAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) :
PCR GRADIENT

1.Prinsip PCR
Memperbanyak salinan rantai dna yang spesifik,yakni dengan :
1. Denaturation
2. Annealing
3. Extension

2.Teori
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro.
Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula, sekitar 106 -107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua
kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci
utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan
DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan
ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan
untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi
untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi:
– denaturation (95°C), 30 detik
– annealing (55–60°C), 30 detik
– extension (72°C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai
produk amplifikasi.
Sebelum mendapatkan program PCR yang fix dengan suhu annealing yang spesifik,
maka perlu dilakukan PCR gradient. Suhu annealing di lakukan gradasi dalam rentang suhu
tertentu. Penentuan rentang suhu annealing berdasarkan kelimpahan nukleotida G_C dan AT
pada primer yang digunakan.
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR Gradient adalah :

1. Template DNA

Template DNA/RNA Template atau cetakan yang berisi sekuens DNA atau RNA target

yang akan diamplifikasi (misalnya DNA genomik, plasmid, amplikon) (Najafov A, 2017).
2. Primer

Pasangan primer Oligonukleotida yang menentukan sekuens yang akan diamplifikasi.

Apabila konsentrasi primer meningkat, spesifisitas reaksi akan menurun dan efisiensi

reaksi meningkat (Najafov A, 2017). Adapun formula berikut ini dapat digunakan untuk

mengkalkulasi dari kemungkinan bahwa sekuens secara tepat bersifat komplementer

terhadap nukleotida yang terjadi dari kesempatan dalam sekuens DNA yang meliputi

sekuens random dari nukleotida. Saat mendesain primer untuk PCR berlaku aturan yaitu

(Verma K, 2014):

− Desain primer yang memiliki kandungan G-C 50-60%

− Berusaha agar Tm di antara 55-60oC. 4

− Hindari struktur sekunder. Sesuaikan lokasi primer, sehingga berlokasi di luar struktur
sekunder pada sekuens target, apabila diperlukan.
− Hindari pengulangan dari G atau C lebih panjang dari 3 pasangan basa dan tempatkan
G dan C di ujung primer.
− Lakukan pengecekan sekuens dari primer forward dan reverse untuk meyakinkan tidak
ada komplementer di ujung 3’.
− Hindari formasi primer-dimer
3. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)
Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP) Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP) atau
nukleotida yang berisikan grup trifosfat, yaitu suatu blok pembangun yang menjadi sumber
bagi DNA polymerase untuk mensintesis rantai DNA baru. Jumlah yang sama dari empat
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) termasuk dalam reaksi, biasanya pada konsentrasi 0,2
mM (200 μM) setiap kali reaksi (Verma K, 2014).
4. Thermostable DNA polymerase
Setelah penemuan dari PCR, terdapat penemuan baru yaitu thermostable DNA polymerase yang
saat ini secara umum disebut dengan “Taq” yang diisolasi dari Thermus aquaticus, suatu
bakteri yang hidup di air panas. Selanjutnya, thermostable DNA polymerase diisolasi dari
banyak strain bakteri lainnya (misalnya Pfu, Tma, dan KOD). Temperatur optimal untuk
aktivitas Taq yaitu antara 75-80oC dan waktu paruh dari enzim ini pada 95oC yaitu 40
menit. Taq tidak memiliki aktivitas proofreading (3’-5’ exonuclease), oleh karena itu
frekuensi dari mutasi yang terjadi pada produk PCR adalah 1 berbanding 200.000 per
nukleotida per duplikasi DNA. Untuk Untuk aplikasi di mana keakuratan DNA polymerase
amat sangat penting, polymerase seperti Pfu dan Pwo digunakan. DNA polymerase ini
memiliki aktivitas proofreading (3’-5’ exonuclease) dan tingkat akurasi berkisar 10 kali
lebih tinggi dibandingkan dengan tingkat akurasi dari Taq DNA polymerase (Najafov A,
2017).
5. Buffer untuk mempertahankan keasaman (pH)
Cairan buffer, menyediakan lingkungan kimia yang sesuai untuk aktivitas optimal dan
stabilitas dari DNA polymerase. Kebanyakan buffer mengandung Tris dengan konsentrasi
10 mM dan KCl dengan konsentrasi 50 mM. pH bervariasi dari 8,2 hingga 5 9,0 (25oC).
Oleh karena itu, pH 9,0 pada 25oC diterjemahkan menjadi mendekati pH 7,6 pada 72oC,
di mana adalah temperatur optimal untuk aktivitas polymerase. pH 7,0- 7,5
dipertimbangkan optimal untuk Taq polymerase (Verma K, 2014).
6. Magnesium chloride
Magnesium adalah kation yang berikatan dengan polymerase dan adalah kofaktor yang
esensial terhadap aktivitas polymerase. Semakin rendah konsentrasi magnesium, akan
semakin ketat kondisi untuk annealing primer. Perubahan sebanyak 0,25 mM dapat
bermakna perbedaan antara hasil yang baik dari produk sesuai dengan panjang yang
diharapkan atau tidak menghasilkan produk sama sekali (Verma K, 2014).
Pada praktikum kali ini kami menggunakan MyTaq™ Red Mix. MyTaq Red Mix
terdiri dari MyTaq DNA Polymerase dan sistem buffer baru yang memberikan amplifikasi
PCR hasil sangat tinggi melalui berbagai templat PCR. MyTaq memiliki afinitas yang
meningkat untuk DNA dan memungkinkan amplifikasi yang andal bahkan dari jumlah
template yang sangat rendah.

3.Tujuan
 1. Mahasiswa mengetahui cara menyiapkan material genetik DNA
2. Mahasiswa memahami bahwa DNA sebagai rantai ganda dan DNA yang
didapat mengandung berjuta gen sebagai pembawa materi genetik yang
berkaitan dengan kondisi fisiologi dan patofisiologis.
3. Mahasiswa memahami berapa sediaan DNA untuk PCR
4. Mahasiswa memahami metoda PCR dan tujuan DNA untuk di PCR
5. Mahasiswa memahami tahapan tahapan yang terjadi pada proses PCR
6. Memahami optimasi suhu PCR gradient
7. Mahasiswa memahami analisa hasil PCR

4. Alat dan Bahan

- Mikropipet 1000 uL, 200 uL, 10
uL
- Mikrotube
- Tip 1000, 200 dan 10 uL
- Vaccutainer
- Kit PCR
- Sentrifuse
- Vortex

5. Prosedur Kerja
Prosedur kerja amplifikasi PCR
1. Menyiapkan larutan mix untuk semua sampel sekaligus atau disebut dengan
larutan Mix Solution (untuk memudahkan pekerjaan dan memperoleh
ketepatan volume) - Perhatikan penyimpanan larutan-larutan diatas, ada
yang harus pada temperature -20ºC (Go Taq® Green Master Mix, Sampel
DNA, Nuclease- Free Water - NF Water), oleh karena itu pada saat bekerja
harus diletakan yang berisi es
2. Jika membuat mix PCR untuk 5 sampel, maka siapkan 5 tabung PCR untuk
sampel Isolat DNA dari darah
3. Masukan masing masing tabung dengan 12,5 mL mix solution.
ke tube pcr (10 buah tube pcr)
4. Menambahkan 2-5 mL templateDNA ke dalam setiap tabung PCR tersebut.
Kecuali untuk tabung yang berisi negative control
5. Masukan masing masing tabung 1 uL primer forward dan reverse
6. Dicukupkan dengan ddH2O sehingga volume untuk reaksi PCR menjadi 25 uL
7. Tabung ditutup rapat dan ditempatkan dalam Thermal Cycler.
8. Sementara itu dilakukan Pengaturan program Thermal Cycling (sebaiknya
sebelum melakukan mix)

9. Atur Program untuk menjalankan PCR gradient dengan pengaturan umum

sebagai berikut:

Step Temperature Time Cycle

Initial denaturation 95° I menit 1

Denaturation 95° 15 detik

Annealing User determined 15 detik 25-35

Extension 72° 10 detik

10. Tekan tmbol run / On, maka Proses PCR akan berjalan dan berlangsung leboih
kurang 1,5 – 2 jam
11. Amati kurva yang program selama proses PCR

6. Hasil
 Perkiraan suhu optimum pada PCR :
A : 65,0 ºC
B : 64,5 ºC
C : 63,6 ºC
D : 62,3 ºC
E : 60,7 ºC
F :59,4 ºC
G :58,5 ºC
H :58,0 ºC

Dari hasil elektroforesis dapat dilihat bahwa

besper bagian kiri tidak sempurna.hal ini mungkin
disebabkan karna pada saat prosedur kerja
terjadi kesalahan,seperti pencampuran larutan
yang tidak sempurna ataupun teknik pemipeta
yang kurang baik.

7. Kesimpulan
Dari praktikum dapat disimpulkan bahwa suhu optimalnya pada tube E yaitu pada suhu
60.8°C

8. Pertanyaan
1. Apa template yang digunakan untuk proses PCR ?
Jawab : DNA
2. Apa fungsi primer ?
Jawab : Menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Setelah primer berikatan dengan DNA
templat, untai tunggal DNA akan diperpanjang oleh enzim DNA polimerase dan daerah yang
diapit akan terkopi.
3. Apa gen target yang dikerjakan pada pratikum ini ?
4. Sebutkan 3 tahapan utama dalam PCR ?
Jawab :
1. Denaturation
2. Annealing
3. Extension

5. Buatlah progam PCR gradient sesuai pada pratikum ini!

Jawab :
Step Temperature Time Cycle

Initial denaturation 95° I menit 1

Denaturation 95° 15 detik

Annealing User determined 15 detik 25-35

Extension 72° 10 detik