*) Kelompok 2A 1

Laporan Praktikum Genetika

POLYMERASE CHAI N REACTI ON (PCR)

Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, Annisa, M. Khaerulloh

Universitas Indonesia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Departemen Biologi
April 2012
Abstrak
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang digunakan untuk memperbanyak atau amplifikasi sekuen
DNA yang spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan copy DNA. Teknik PCR dilakukan setelah melakukan
isolasi DNA. Siklus PCR terdiri atas 3 tahap yaitu denaturasi (pemisahan), annealing (pelekatan) dan elongasi
(pemanjangan). Tahapan-tahapan pada siklus PCR dipengaruhi oleh suhu dan waktu yang berbeda-beda. Keberhasilan
pelekatan primer dan DNA template dipengaruhi oleh melting temperature (Tm). Komponen-komponen yang berperan
penting dalam reaksi PCR yaitu DNA template, PCR buffer, kation divalen, nuclease free water, Deoxynucleoside
Triphosphat (dNTP), enzim Taq DNA polymerase, primer. Setiap komponen memiliki fungsi dan kegunaan masing-
masing. Teknik PCR digunakan untuk diagnosis penyakit genetik, studi forensik (DNA fingerprinting), terapi gen, proyek
pemetaan genom serta berbagai aplikasi analisis genetik lainnya. Hasil praktikum didapatkan salinan sekuen DNA yang
spesifik.
Kata kunci : Polymerase Chain Reaction (PCR); DNA; DNA polymerase; melting temperature

1. Pendahuluan
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan
suatu teknik molekular yang digunakan untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target
tertentu secara in vitro dengan cara mensintesis molekul
DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA
target tersebut melalui bantuan enzim dan
oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermal
cycler (Russel 1996: 304). PCR pertama kali ditemukan
2

oleh Kary Mullis pada tahun 1985 (Butler 2005: 63).
Prinsip kerja PCR adalah proses penggandaan
(amplifikasi) DNA target tertentu dibantu oleh enzim
DNA polymerase yang akan memperbanyak bagian
spesifik yang diinisiasi oleh primer dengan cara
menghubungkan dNTP-dNTP dalam suatu reaksi termal
(Wolfe 1993: 137).
Suatu reaksi PCR dilakukan dengan
menambahkan komponen- komponen penting kemudian
diencerkan menggunakan nuclease free water (pelarut)
sampai didapatkan konsentrasi yang diinginkan dari
setiap komponen tersebut (Butler 2005: 65). Komponen-
komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR
adalah DNA template, larutan penyangga (PCR buffer),
enzim DNA polymerase, Deoxynucleoside Triphosphat
(dNTP),dan primer (Muladno 2010: 64). DNA template
adalah cetakan DNA yang terdiri dari empat nukleotida.
DNA template berfungsi untuk memastikan bahwa
reaksi PCR terjadi pada sekuen DNA spesifik yang
diinginkan. Larutan penyangga (PCR buffer) berguna
menjaga keseimbangan PH selama reaksi PCR
berlangsung. Enzim DNA polymerase yang paling
banyak digunakan adalah Taq DNA polymerase. Taq
DNA polymerase berasal dari sel bakteri Thermus
aquaticus yang hidup di lingkungan dengan panas yang
ekstrim (Butler 2005: 67-68). Deoxynucleoside
Triphosphat (dNTP) merupakan material utama untuk
membentuk basa komplementer pada hasil cetakan
DNA. Deoxynucleoside Triphosphat (dNTP) terdiri atas
dATP (Deoxyadenosine Triphosphat), dCTP
(Deoxycytosine Triphosphat), dGTP (Deoxyguanine
Triphosphat), dan dTTP (Deoxythymine Triphosphat).
Primer digunakan untuk mengidentifikasi DNA template
yang akan digandakan (Muladno 2010: 65).
Primer bagian yang berfungsi untuk mengapit ,
menentukan serta mengidentifikasi daerah spesifik dari
DNA target yang akan diamplifikasi. (Butler 2005: 65).
Primer yang berada sebelum DNA template disebut
sebagai primer forward dan primer yang berada setelah
DNA template disebut sebagai primer reverse. Primer
berukuran paling pendek sebanyak 16 basa dan biasanya
berkisar antara 18 sampai dengan 24 basa. Konsentrasi
primer yang dibutuhkan dalam proses PCR sekitar 1
Primer merupakan pembatas fragmen DNA target yang
akan diamplifikasi dan berfungsi sebagai penyedia
gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang diperlukan
pada proses eksistensi DNA. Kandungan G+C atau
persentase jumlah G dan C sebaiknya sama atau lebih
besar dari kandungan G+C DNA target, karena primer
dengan persentase G+C yang lebih rendah tidak akan
mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif
pada tempat yang dituju, sehingga akan menurunkan
efisiensi proses PCR. Primer yang baik juga harus
memiliki urutan nukleotida G atau C pada ujung 3,
karena jika pada ujung 3 terdapat urutan nukleotida A
atau T, maka primer tersebut dapat menurunkan
spesifitas primer itu sendiri. Primer yang baik juga harus
memiliki melting Temperature (Tm) yang berkisar
antara 50-65C (Muladno 2010: 64-65).
Satu siklus PCR terdiri atas 3 tahap yaitu
denaturasi (pemisahan), annealing (pelekatan), dan
elongasi (pemanjangan) (Stratchan & Read 1996: 129).
Denaturasi terjadi pada suhu 95
o
C selama waktu 30
detik. Tahapan denaturasi adalah tahapan untuk
menghentikan reaksi enzimatik yang tejadi sehingga
ikatan hidrogen terputus dan untai ganda DNA akan
terbuka menjadi untai tunggal. Tahapan annealing
terjadi pada saat suhu berkisar antara 50
o
C sampai
dengan 60
o
C. Primer forward yang berkomplemen
3

dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada
posisi komplemennya dan juga primer reverse akan
menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua
primer tersebut menempel pada posisinya masing-
masing enzim Taq DNA polymerase mulai membantu
mensintesis molekul DNA baru. Proses ini disebut
sebagai tahapan elongasi yang terjadi pada suhu 72
o
C.
Tahapan elongasi ini akan membuat sekuen DNA
spesifik akan berlipat jumlahnya. Proses PCR biasanya
berlangsung hingga 30 sampai dengan 40 siklus
(Stansfield dkk. 2006: 84).
Keberhasilan pelekatan antara primer dan DNA
template ditentukan oleh Tm (melting temperature).
Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5
o
C
dari nilai Tm. Semakin panjang ukuran primer maka
semakin tinggi temperaturnya. Rumus untuk menghitung
nilai Tm adalah

G adalah jumlah basa guanin, C adalah junlah basa
sitosin, A adalah jumlah basa adenin, dan T adalah
jumlah basa timin (Muladno 2010: 63).
Kelebihan metode PCR dibandingkan ddengan
teknik lain yaitu DNA template yang digunakan dapat
berjumlah sedikit dan diambil dari sel yang sama
kecilnya (Butler 2005: 80). Kelebihan yang dimiliki oleh
teknik PCR adalah teknik tersebut dapat bekerja pada
sampel yang sudah tua, langka, dan memiliki urutan
basa nukleotida yang sedikit (Lewis 2003: 186).
Kelebihan lainnya adalah kecepatan metode PCR lebih
cepat bila dibandingkan dengan Reaction fragment
length polymorphism atau dengan Southern analisis.
Reaksi yang dihasilkan metode PCR juga lebih spesifik
dan akurat serta mudah dilakukan secara otomatis (Dale
& Park 2004: 65). Kekurangan metode PCR yaitu DNA
template tidak dapat diamplifikasi karena adanya
inhibitor pada ekstraksi DNA (Butler 2005: 81). Metode
PCR juga memerlukan biaya yang cukup mahal, rentan
terhadap kontaminasi sehingga harus dilakukan kontrol
kualitas yang sangat ketat, dan tidak dapat mendeteksi
mutasi (Dale & Park 2004: 65).
Aplikasi dari PCR antara lain adalah untuk studi
forensik (DNA fingerprinting), terapi gen, diagnosa
penyakit genetik serta berbagai aplikasi analisis genetik
lainnya. DNA fingerprinting menggunakan prinsip tidak
ada individu yang memiliki sidik jari yang sama
sehingga sidik jari yang ditinggalkan di tempat kejadian
perkara (TKP) dapat menjadi bukti yang penting untuk
penyelidikan dan identifikasi pelaku kejahatan. Penyakit
gen dapat diobati dengan terapi gen. Penyakit genetik
dihasilkan dari fenotip yang terkena mutasi pada sel
somatik. Secara teori ada 2 tipe terapi gen yaitu terapi
sel somatik dan terapi sel gamet (Russell 1994: 310).

2. Metodologi
Alat yang digunakan pada praktikum PCR antara
lain micro tube, pipet mikro, tips, sarung tangan, dan
mesin thermal cycler. Bahan yang digunakan pada
praktikum PCR adalah DNA template (disc) danreaction
mix yang terdiri dari 14 ddH
2
O steril, Kapa 2G
Robust Buffer A dengan Mg 4 , 10 mm dNTPs 0.4 ,
20 primer forward FvCRF 0.3 , 20 primer
reverse FvCRR 0.3 , dan 2G Kapa Robust (5 U/).
Cara kerja pada praktikum PCR yaitu pertama
reaction mix yang terdiri atas komponen-komponen
penting dimasukkan ke dalam tube. Tahapan kerja
pembuatan reaction mixture diawali dengan pemberian
ddH
2
O steril dengan menggunakan mikropipet ke dalam
tabung PCR dengan volume masing-masing bagian 14
l, sehingga diberikan 28 l ke dalam tube tersebut. 5x
Kapa 2G Robust Buffer A with Mg ditambahkan ke
4

dalam tube tersebut dengan volume untuk masing-
masing bagian sebanyak 4 l, sehingga diberikan dengan
volume 8 l. Setelah itu, 10 mM dNTPs ditambahkan
dengan volume masing-masing 0.4 l, sehingga
diberikan dengan volume 0.8 l. Setelah ditambahkan
dNTPs, diberikan 20 M primer FvCRF (forward) dan
20 M primer FvCRR (reverse) untuk pembuatan satu
takaran reaction mixture, sehingga diberikan 40 M
primer FvCRF dan 40 M primer FvCRR ke dalam
tabung PCR tersebut. 2G Kapa Robust dengan takaran
0.5 U untuk satu reaksi, sehingga diberikan ke dalam
tabung tersebut sebanyak 1 U. Campuran tersebut dibagi
menjadi dua bagian yang sama ke dalam dua tube PCR
yang berbeda. Kedua, DNA template dimasukkan ke
dalam tube yang telah berisi reaction mix. Ketiga,
tahapan pembuatan program untuk siklus PCR dimulai
dari penekanan tombol [CREATE] jika ingin
memprogram ulang suhu dan waktu yang diinginkan
dalam siklus PCR. Keempat, program yang telah selesai
dibuat, disimpan dan tube dimasukkan ke dalam mesin
thermal cycle, setelah itu tekan tombol [RUN] untuk
menjalankan program. Mesin thermal cycler yang
digunakan dalam praktikum PCR adalah Perkin Elmer
9600.

3. Hasil dan Pembahasan

Tahapan kerja pembuatan reaction mixture PCR
yaitu pertama ddH
2
O steril sebanyak 14 dimasukkan
ke dalam tube, fungsinya adalah sebagai pelarut
sehingga komponen lain yang dimasukkan ke dalam
tube dapat langsung larut. Kedua, tambahkan komponen
lain seperti Kapa 2G Robust Buffer A dengan Mg 4 ,
10 mm dNTPs 0.4 , 20 primer forward FvCRF 0.3
, 20 primer reverse FvCRR 0.3 , dan 2G Kapa
Robust (5 U/) ke dalam tube. Ketiga, setelah semua
komponen telah dimasukkan ke dalam tube, thawing
tube dengan perlahan agar semua komponen larut
sempurna. Keempat, reaction mixture siap diletakkan
pada mesin thermal cycler (Spormann 2009: 1).
Enzim DNA polymerase yang digunakan pada
saat proses perbanyakan atau ampifikasi DNA adalah
Taq DNA polymerase. Taq DNA polymerase berasal
dari sel bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber
mata air panas (Butler 2005: 67). Bakteri Thermus
aquaticus mempunyai enzim termostabil sehingga dapat
hidup di lingkungan yang sangat panas. Enzim
termostabil digunakan dalam reaksi PCR karena enzim
tersebut tahan terhadap panas sehingga enzim tidak akan
terdenaturasi (Brown 1993: 412).
Praktikum reaksi PCR memiliki beberapa tahapan
yang harus diperhatikan kondisinya. Kondisi tersebut
mempengaruhi keefisienan kerja reaksi dan hasil reaksi.
Tahapan denaturasi yang harus diperhatikan adalah
suhu, tahap denaturasi harus terjadi pada suhu 95
o
C
selama 30 detik atau 97
o
C selama 15 detik. Denaturasi
yang tidak lengkap akan mengakibatkan DNA
mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda
lagi) secara cepat sehingga mengakibatkan gagalnya
proses PCR. Waktu dalam tahapan denaturasi juga harus
diperhatikan jangan sampai terlalu lama karena akan
mengurangi aktivitas enzim Taq DNA polymerase.
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer
yang baik adalah primer tersebut sebaiknya berukuran
18-25 basa, dan mengandung 50-60% guanin dan
sitosin. Sekuen DNA kedua primer tidak boleh saling
berkomplemen karena akan menyebabkan terjadinya
penempelan antar primer yang kemudian membentuk
primer-dimer. Sekuen DNA di dalam masing-masing
primer sebaiknya juga tidak saling berkomplemen
5

karena akan mengakibatkan terbentuknya struktur
sekunder pada primer tersebut sehingga mengurangi
efisiensi PCR. Tahap elongasi harus terjadi pada suhu
72
o
C. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim Taq
DNA polymerase diperkirakan antara 35 sampai dengan
100 nukleotida per detik (Muladno 2010: 63-64).
Optimasi PCR perlu dilakukan agar reaksi PCR
dapat berlangsung secara efisien dan mendapatkan hasil
yang konsisten. Suhu dan waktu pada tahap denaturasi
dipengaruhi oleh enzim Taq DNA polymerasedan
bersifat permanen. Suhu penempelan antara primer dan
DNA template serta waktu yang diperlukan pada tahap
annealing dipengaruhi oleh panjang pendek primer.
Kecepatan penyusunan nukeleotida pada tahap elongasi
bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan
molekul DNA target, sedangkan suhunya bersifat
permanen (Fraga dkk. 2008: 5--6).
Amplifikasi rantai DNA dimulai dari tahap
denaturasi, saat tahapan denaturasi untai ganda DNA
berpisah menjadi untai tunggal kemudian primer
menempel pada DNA template pada tahap annealing.
Tahapan elongasi yaitu setiap untai menghasilkan untai
yang panjang sehingga siklus pertama selesai. Proses
dari denaturasi, annealing, dan elongasi disebut sebagai
satu siklus. Siklus pertama tersebut menghasilkan 2
molekul DNA untai ganda. Saat siklus kedua berakhir, 2
molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus
pertama menjadi DNA templatedan kemudian masing-
masinguntai dilipatgandakan menjadi 4 molekul DNA
untai ganda yang baru. Siklus ketiga berakhir maka akan
terbentuk 4 molekul DNA untai ganda, kemudian
masing-masing untai dilipatgandakan menjadi 8 molekul
DNA untai ganda yang baru. Siklus keempat berakhir, 8
molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus
ketiga menjadi DNA template dan kemudian masing-
masing untai dilipatgandakan menjadi 16 molekul DNA
untai ganda yang baru. Siklus kelima berakhir, 16
molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus
keempat menjadi DNA template dan kemudian masing-
masing untai dilipatgandakan menjadi 32 molekul DNA
untai ganda yang baru. amplifikasi rantai DNA hingga
lima siklus menghasilkan 32 molekul DNA untai ganda
(Muladno 2010: 62).

4. Kesimpulan

Polymerase Chain Reaction (PCR ) adalah teknik
yang digunakan untuk memperbanyak sekuen DNA
spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan
copy DNA. Reaksi PCR membutuhkan komponen-
komponen penting yaitu ddH
2
O steril sebagai pelarut,
Kapa 2G Robust Buffer untuk menjaga keseimbanagn
PH serta mengandung kation Mg yang berfungsi
sebagai kofaktor enzim yang mempercepat reaksi.
Enzim Taq DNA polymerase berfungsi untuk
menghasilkan pemanjangan cetakan DNA dengan
menghubungkan dNTP-dNTP. Amplifikasi pada setiap
siklus menghasilkan jumlah molekul DNA yang sesuai
rumus

, dengan n adalah jumlah siklus.

Daftar Pustaka


Brown, T.A. 1993. Genetics: a molecular approach, 2
nd

ed. Fong & Sons Printers Pte Ltd., Singapore: xiii
+ 467 hlm.
Butler, J.M. 2005.Forensic DNA Typing, 2
nd
ed. Elsevier
Academic Press, New York: xvii + 660 hlm.
6

Dale, J.W. & S.F. Park. 2004. Molecular genetics of
bacteria. John Wiley & Sons Ltd., West Sussex: xi
+ 379 hlm.
Fraga, D., T. Meulia& S. Fenster. 2008. Real-Time PCR.
Journal of Current Protocols Essential Laboratory
Techniques 10(3): 1-34.
Lewis, Ricki. 2003. Human genetics concepts and
applications. 5th ed. The McGraw-Hill
Companies, New York: xviii + 454 hlm.
Muladno. 2010. TeknologiRekayasaGenetika. Ed. Ke-
2.IPB Press, Bogor: ix + 130 hlm.
Russel, P.J. 1996. Genetics. 4th ed. HarperCollins
College Publishers, New York: 784 hlm.
Russell, P. J. 1994. Fundamental of
Genetics. Harper Collins College Publisher, USA:
xvi + 528 hlm.
Spormann, A.M. 2009. Polymerase Chain Reaction
(PCR): 1 hlm.
http://www.stanford.edu/group/spormannlab/cgi-
bin/amslab/content/polymerase-chain-reaction-pcr
25 April 2012, pk. 06.52am.
Stansfield, W., R.J. Cano & J.S. 2006. Colome.
Schaums easy outlines: molecular and cells
biology. terj. dari
Strachan, T. & Read, A.P. 1996. Human Molecular
Genetics.John Willey& Sons, Inc., New York: x +
596hlm.
Wolfe, S.L. 1993. Molecular and cellular
biology.Wadsworth Publishing Company,
Belmont: xviii + 1145 hlm.
7

Lampiran

1. Hitunglah nilai Tm dari primer berikut menggunakan metode Wallace :

a. Primer Forward :

5-GGAATTCGACATTAAGATGA-3

b. Primer Reverse :

3- GTGGTAGTGGTGGTGGT -5

Primer Forward
Jumlah G = 5
Jumlah C= 2
Jumlah A= 8
Jumlah T= 5
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)
Tm = 4( 5+2) + 2 (8+5)
Tm = 28 + 26
Tm = 54
o
C

Primer Reverse
Jumlah G = 10
Jumlah C= 0
Jumlah A= 1
Jumlah T= 6
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)
Tm = 4 (10+0) + 2( 1+ 6)
Tm = 40 + 14
Tm = 54
o
C




8



9