“Isolasi DNA Bakteri”

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Oleh :
Nama : Rachmita Mustika Putri
NIM : 170210103005
Kelas :A

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS JEMBER
2020
 BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Isolasi DNA bakteri yaitu suatu pemisahan molekul DNA dari sel bakteri.
Isolasi yang digunakan untuk praktikum ini dengan menggunakan metode
boiling. Dengan suatu metode bakteri yang dipanaskan pada suhu tinggi
sehingga dinding selnya lisis. Pengenalan isolasi DNA penting dipelajari untuk
bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam
tanaman seperti padi, kapas, dan kedelai. Dalam pentingnya bioteknologi untuk
perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah
keterampilan dan pemikiran yang kritis. DNA isolasi bertujuan untuk
mendapatkan kualitas DNA yang baik dalam berbagai kegunaan seperti
penanda molekuler, genom pembuatan perpustakaan, dan sequencing. Namun,
masalah yang sering ditemukan dalam proses isolasi . DNA tanaman, yang
ditemukan adanya senyawa kontaminan dalam sampel terisolasi seperti
polisakarida, polifenol, protein, RNA (Rachmawati dan Khoiriyah. 2018).

Isolasi dan pemurnian DNA dari sel adalah salah satu prosedur yang paling
umum dalam biologi molekuler kontemporer dan mewujudkan transisi dari
biologi sel ke biologi molekuler (in vivo untuk in vitro) (Ekpa et al. 2016).
Prinsip dasar isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA
dari komponen-komponen lainnya yang harus dilakukan dengan baik dan bebas
dari kontaminasi sehingga diperoleh DNA hasil isolasi dengan kualitas yang
baik (Farmawati et al. 2015). Bakteri epifit dari sayuran segar bias digunakan
untuk diisolasi DNA bakteri (Pérez. 2019). Elektroforesis digunakan untuk
mengamati produk PCR. Hasil elektrofiresis berupa pita (band) DNA hasil
amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan bsasanya
(Adrianto. 2017). Namun, pada praktikum kali ini menggunakan gel agarose.
Kualitas DNA yang diisolasi tersebut diuji secara kualitatif dan kuantitatif.
Pengujian kuantitas isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer (Marshal et al. 2015).

Elektroforesis ini dilakukan untuk pemisahan pragmen DNA dari molekul

terbesar ke molekul terkecil. Pemisahan ini dilakukan dalam medan listrik dari
kutub negatif ke positif, hal ini dilakukan karena DNA bermuatan
negatif.Adrianto. Ada prinsip dasar dari dilakukannya isolasi DNA
yaitugangguan dari dinding sel, membran sel dan membran nuklir untuk
melepaskan DNA yang sangat utuh ke dalam larutan diikuti oleh pengendapan
DNA dan penghapusan kontaminasi yang biomolekul seperti protein,
polisakarida, lipid, fenol dan lainnya (Tiwari et al . 2017).

1.2 Rumusan Masalah

1.1.2 Menjelaskan Pengertian dari Isolasi Bakateri
1.2.3 Menjelaskan fungsi dan alat yang digunakan untuk isolasi DNA
bakteri
1.3.4 Menjelaskan alas an pada setiap alat dan bahan yang digunakan untuk
isolasi DNA bakteri
1.4.5 Menjelaskan prinsip pada kegiatan isolasi DNA bakteri
1.5.6 Menjelaskan metode dalam kegiatan isolasi DNA bakteri
1.6.7 Bagaimana indikasi keberhasilan dari kegiatan isolasi DNA bakteri
1.3 Tujuan
1.3.1 Untuk mengetahui fungsi alat dan alasan digunakannya alat dan
bahan dalam kegiatan isolasi DNA

1.3.2 Untuk mengetahui prinsip kerja isolasi DNA

1.3.3 Untuk mengetahui metode yang digunakan untuk isolasi DNA

1.3.4 Untuk mengetahui indikasi keberhasilan dari isolas DN

 BAB II. METODE
2.1 Alat dan Bahan
2.1.1 Alat
2.1.1.1 Pinset
2.1.1.2 Tri glass
2.1.1.3 Tip biru
2.1.1.4 Mikropipet
2.1.1.5 Bunsen
2.1.1.6 Inkubasi
2.1.1.7 Sentrifugasi
2.1.1.8 Heat block
2.1.2 Bahan
2.1.2.1 Sayuran
2.1.2.2 Aquades
2.1.2.3 Alkohol spray
2.1.2.4 Medium NA
2.1.2.5 Lisozim
2.1.2.6 SDS (Sodium Dodecyl Sulphate)
2.1.2.7 Alkohol 70%
2.1.2.8 Alkohol 96%
2.1.2.9 NaAc
2.1.2.10 TE (Tris EDTA)
2.1.2.11PCL (Phenol Chloroform Isoamylalcoho)
2.2 Langkah Kerja
Mengisolasi DNA berdasarkan Virtual Lab

Menyiapkan alat bahan yang sudah disediakan untuk

memulai kegiatan praktikum isolasi DNA bakteri

Mensterilkan meja yang akan digunakan praktikum

menggunakan alcohol spray

Memasukkan sayuran yang sudah disediakan ke dalam

beaker glass yang berisi aquades dengan mengguanakan
pinset agar tetap terjaga kesterilannya

Mensterilkan tri glass dengan Bunsen kemudian meratakan

medium EMBA menggunakan tri glass

Menekan tombol ON dan memasukkan medium EMBA ke

inkubasi dengan suhu 37°C
 Kemudian mengambil air bekas sayuran dengan mikropipet 5
mikro kemudian memasukkan ke medium EMBA

Menunggu selama 24 jam

Setelah menekan tombol OFF kemudian mengamati

koloni yang terbentuk

Isolasi DNA Bakteri

Menyiapkan alat dan bahan

 Memanen bakteri

Merusak dinding sel bakteri

Melisiskan sel bakteri

Membuang sisa Perusakan dinding sel

Mengekstraksi DNA
Ekstraksi dan Purifikasi

Memanaskan suspensi bakteri pada suhu 100 derajat Celsius selama

5 menit

Men sentrifugasi 12.000 rpm, 4 derajat Celsius selama 5 menit,

kemudian mengambil supernatan

Menambahkan dengan PCL (Phenol Chloroform Isoamylalcohol)

Menginkubasi pada suhu -20 derajat Celsius selama 1 jam

Meng sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 Celsius

selama 15 meit, kemudian mengambil supernatannya

Menambahkan dengan NaAc dan Alkohol 96%

 Menginkubasi pada suhu -20 derajat Celsius selama 1 jam

Mengsentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 derajat

Celsius selama 10 menit kemudian mengambil pelet

Menambahkan pelet dengan alcohol 70%

Mengering anginkan dan menambahkan pelet dengan TE (Tris EDTA)

 BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Pembahasan

Isolasi DNA adalah suatu tahapan perkerjaan awal yang haris dilakukan
dalam berbagai pemeriksaan analisis DNA. Proses ekstraksi untuk mendapatkan
DNA berkualitas tinggi merupakan kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam
analisis molekuler. Berbagai analisis biologi molekuler memerlukan hasil
isolasi DNA dengan tingkat kemurnian dan kualitas yang baik (Narulita, 2019).
DNA isolasi merupakan langkah utama dan penting untuk analisis molekuler
(Handayani et al. 2016). Tujuan isolasi DNA yang dilakukan dalam praktikum
kali ini bertujuan untuk memisahkan molekul DNA dari dua Isolat yang
berbeda yakni, Isolat M dan Isolat O dari molekul lain selain DNA. Hasil
Isolasi DNA tersebut perlu diuji kualitas maupun kuantitasnya (Sorber et al.
2017).

Metode isolasi DNA yang dapat digunakan dalam isolasi DNA bakteri
gram positif sekaligus bakteri gram negatif sangat diperlukan. Salah satu
metode yang umum digunakan untuk isolasi DNA bakteri ialah metode
CTAB/NaCl, tetapi perkembangan teknologi saat ini telah menghasilkan produk
dalam bentuk kit untuk isolasi DNA. Kit untuk isolasi DNA dikeluarkan oleh
beberapa perusahaan dagang, salah satu produknya ialah QIAamp DNA Mini
Kit (Qiagen) (Fitriya et al. 2015). metode pengeditan genom bebas DNA pada
tanaman menggunakan CRISPR (Kim et al. 2017).
Keuntungan dari isolasi DNA dari M. smegmatis menggunakan gDNA
dari M. smegmatis. Keuntungan dari isolasi DNA dari M. smegmatis
menggunakan etanol adalah bahwa proses ini sederhana dan mudah dilakukan,
tanpa protein dan kontaminasi RNA. Konsentrasi etanol meningkatkan
menurunkan kelarutan molekul besar seperti karbohidrat, protein dan asam
nukleat. Namun, dari tiga polimer, asam nukleat yang paling larut dalam etanol
(Gokarn et al. 2016). Alkohol spray digunakan untuk mensterilkan meja yang
akan digunakan untuk melakukan kegiatan praktikum agar steril tidak terdapat
bakteri yang menempel dan untuk menjaga kesterilannya.

Pinset digunakan untuk mengambil bahan yang digunakan untuk isolasi

DNA bakteri yaitu sayuran yang mana pinset untuk mengambil dan dimasukkan
dalam beaker glas berisi aquades yang sudah disediakan. Dan supaya tidak
terdapat bakteri yang ada ditangan dan tetap steril. Tip biru sebagai tempat
suatu sampel. Mikropipet untuk mrngambil sampel dengan ukuran mikro atau
sedikit. Kemudian alat tri glass untuk meratakan sampel yang diletakkan padada
medium. Bunsen untuk mensterilkan tri glass sebelum digunakan untuk
meratakan pada medium. Inkubasi digunakan untuk menginkubasi
(mengeramkan) biakan bakteri setelah dilakukan proses inokulasi (penanaman)
biakan bakteri pada media steril di dalam medium yang sudah disediakan.

Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan medium dengan sampel.

Haetblock untuk memanaskan suspent atau sampel yang akan digunakan isolasi
DNA bakteri. Laminar air flow digunakan untuk tempat kerja steril agar tidak
terkontaminasi bakteri yang lain. Sayuran sebgai sampel pengambilna bakteri,
aquades digunakan sebagai pelarut. Medium NA sebagai medium pertumbuhan
bakteri, SDS digunakan untuk melisiskan dinding sel agar DNA tidak
terdegradasi. Alcohol 70% dan 90% untuk membuang sisa-sisa bahan yang
sebelumnya diberi fenol . fenol digunakan untuk memisahkan molekul
nukleutida dari protein.EDTA merupakan senyawa yang digunakan untuk
melisiskan dinding sel bakteri bias juga untuk mengencerkan sampel apabila
sampel terlalu pekat.

Prinsip isolasi DNA/RNA adalah dengan memecah suatu jaringan

sehingga terbentuk kultur sel yang terdiri dari DNA/RNA dan struktur dasar
lainnya. Prinsip dasar yang paling utama dalam isolasid DNA yaitu
penghacuran (lisis), pemecahan dinding sel dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu
secara fisik dimana nantinya sel ini akan dipecahkan dengan kekuatan mekanik
atau resonansi, secara kimiawi dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti
EDTA (EDTA Ethylen diamnine Tetra Acid), SDS (Soduum Dodecyl Sulphat),
Ammonium – Choridae-Pottasium (ACK). Kemudian prinsip yang kedua
ekstrasi atau pemisahan DN dari bahan padat seperti protein DNA yang ketiga
prinsipnya pemurnian DNA dapat dilakukan dengan mencampurkan larutan
DNA tersebut dengan NaCl yang berfugsi memekatkan, memisahkan DNA dari
larutan dan mengendapkan DNA pada saat dicampurkakn dengan ethanol
(Narulita, 2019). Fenol berfungsi untuk memisahkan molekul-molekul
nukleotida dari protein sehingga sangat diperlukan dalam praktikum.

Metode yang digunakan untuk perusakan dinding sel ada 2 yaitu metode
fisik dan metode kimiawi. Metode fisik sel akan dipecahkan dengan kekuatan
mekanik atau resonansi, secara kimiawi dengan memanfaatkan senyawa kimia
seperti EDTA (EDTA Ethylen diamnine Tetra Acid), SDS (Soduum Dodecyl
Sulphat), Ammonium – Choridae-Pottasium (ACK). Metode isolasi DNA yang
dapat digunakan dalam isolasi DNA bakteri gram positif sekaligus bakteri gram
negatif sangat diperlukan. Salah satu metode yang umum digunakan untuk
isolasi DNA bakteri ialah metode CTAB/NaCl, tetapi perkembangan teknologi
saat ini telah menghasilkan produk dalam bentuk kit untuk isolasi DNA. Kit
untuk isolasi DNA dikeluarkan oleh beberapa perusahaan dagang, salah satu
produknya ialah QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) (Fitriya et al. 2015).

Secara signifikan bagian yang sama dari rRNA urutan yang jauh terkait
dengan organisme. Sangat mudah untuk mengukur perbedaan yang benar oleh
urutan tepat sesuai dengan organisme terkait jarak jauh. Untuk menentukan
taksonomi, filogeni dan spesies perkiraan keadaan divergen tingkat antara
bakteri, gen yang mengkode rRNA telah banyak digunakan (Tomar et al. 2019).
PCR adalah teknik utama yang digunakan untuk memperkuat urutan asam
nukleat spesifik (Chou et al. 2015).

Indikasi keberhasilan isolasi DNA dimana DNA genom bakteri

umumnya berukuran lebih dari 1Mbp. Akan terdapat ukuran DNA genom
bakteri dengan ukuran 0,58 Mb yaitu pada spesies Mycoplasma genitalium,
dengan ukuran tersebut merupakan ukuran terkecil DNA genom bakteri. DNA
genom bakteri yang terbesar terdapat pada spesies (Bacillus megaterium)
dnegan ukuran 30 Mbp oleh karena itu hasil isolasi DNA genom bakteri
umumnya diindikasikan dengan keberadaan pita DNA yang berukuran diatas 1
kb.
 BAB IV. PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Isolasi DNA merupakan tahapan perkerjaan awal yang haris dilakukan

dalam berbagai pemeriksaan analisis DNA. Alkohol spray untuk mensterilkan
meja yang akan digunakan untuk melalukan kegiatan praktikum agar steril tidak
terdapat bakteri yang menempel dan menjaga kesterilannya. Pinset ]untuk
mengambil bahan yang digunakan untuk isolasi DNA bakteri yaitu sayuran dan
dimasukkan dalam beaker glas berisi aquades. Mikropipet untuk mrngambil air
bekas sayuran dengan ukuran yang sudah ditentukan untuk dimasukkan ke
medium EMBA. Tri glass untuk meratakan medium EMBA.

Bunsen untuk mensterilkan tri glass sebelum digunakan untuk

meratakan pada medium. Inkubasi untuk menginkubasi (mengeramkan) biakan
bakteri setelah dilakukan proses inokulasi (penanaman) biakan bakteri pada
media steril di dalam medium yang sudah disediakan. NaCl yang berfugsi
memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA pada
saat dicampurkakn dengan ethanol. Fenol memisahkan molekul-molekul
nukleotida dari protein sehingga sangat diperlukan dalam praktikum

Prinsip isolasi DNA/RNA dengan memecah suatu jaringan sehingga

terbentuk kultur sel yang terdiri dari DNA/RNA dan struktur dasar lainnya.
Metode yang digunakan untuk perusakan dinding sel ada 2 yaitu metode fisik
dan metode kimiawi. Metode fisik sel akan dipecahkan dengan kekuatan
mekanik atau resonansi, secara kimiawi dengan memanfaatkan senyawa kimia
seperti EDTA (EDTA Ethylen diamnine Tetra Acid), SDS (Soduum Dodecyl
Sulphat), Ammonium – Choridae-Pottasium (ACK). Indikasi keberhasilan
isolasi DNA hasil isolasi DNA genom bakteri umumnya diindikasikan dengan
keberadaan pita DNA yang berukuran diatas 1 kb.
4.2 Saran

Untuk praktikum sebaiknya berhati hati jika melakukan kegiatan

praktikum isolasi DNA bakteri agar mendapat hasil yang valid
 DAFTAR PUSTAKA

Chou1, W, P., P, H, Chen., Jr, M, Miao., L, S, Kou., S, H,Yeh., P, J, Chen.

2015. Rapid DNA amplification in a capillary tube by natural convection
with a single isothermal heater. BioTechniques. 2(3): 1
Ekpa, E., A, M., O, INE., E, LUS., E, UdoG. 2016. Comparative Analysis of
some DNA extraction kits used for Molecular Analysis of Iron Ore
samples. International Journal of Biotechnology and Bioengineering.
2(2):2
Farmawati, D, A., N, Wirajana., S, C, Yowani. 2015. Perbandingan Kualitas
Dna Dengan Menggunakan Metode Boom Original Dan Boom
Modifikasi Pada Isolat Mycobacterium Tuberculosis 151. Jurnal kimia.
9(1): 4
Fitriya, R, T., M, Ibrahim., L, Lisdiana. 2015. Keefektifan Metode Isolasi
DNA Kit dan CTAB/NaCl yang Dimodifikasi pada Staphylococcus
aureus dan Shigella dysentriae. LenteraBio. 4(1):3
Gocarn, K., V, Sarangdhar., R, B, Pal., 2016. Ethanol extraction method for
dna isolation from mycobacterium smegmatis. International Journal of
Current Research. 8(9): 2
Handayani, F., R, A, Wulandari., R, H, Murti. 2016. Genomic dna extraction
method from mature leaf of lai (durio kutejensis becc.). Agrivita. 38(1) :
3
Hebert Adrianto. 2017. Buju ajar biologi sel dan molekuler. Yogyakarta :
deepublish
Kim, K., S, S, Kim., J, R, B, C., K, J., Kim, S, G. 2016. CRISPR/Cpf1-
mediated DNA-free plant genome editing. Nature communications.
4(2) : 2
Marshall, O, J., T, D, Southall., A, H, B. 2015. Cell type-specific profiling of
protein-DNA interactions without cell isolation using Targeted DamID
with next-generation sequencing. Bioinformatics. 3(3): 2
Narulita, E. 2019. Bioteknologi untuk strata 1 berbasis riset. Yogyakarta
LaksBang PRESSindo
Pérez, C, G,J., V, Arispuro., E, A, Hernández., C, L, A, Gil., Y, E, A,
Guzmán., A, Castillo., A, H, Mendoza., J, F, A, Zavala., M, A, M,
 Téllez., 2019. Potential Control Of Foodborne Phatogenic Bacteria By
Pediococcus Pentocaeceus And Lactobacillus Graminis Isolated From
Fresh Vegetables. Microbiol. Biotechnol. Lett. 47(2):2
Rachmawati, Y., R, A, Khoiriyah. 2018. Comparison of DNA Isolation
Results using Simple Methods and Kits in Samples of Psidium guajava
Leaves. BIOTROPIC The Journal of Tropical biology. 2(2):1
Sorbar, L., K, Zwaenepoel., V, Deschoolmeester., G. Roeyen., F, Lardon., C,
Rolfo., P, Paulwels. 2016. A Comparison Of Cells Free DNA Isolastion
Kits Isolation and Quantification of Cell-Free DNA in Plasma. The
Journal of molecular diagnotisc. 19(1):1
Tomar, P., K, D, Arunachalam., K, C, Vinuprakash., H, Thakur. 2019.
Isolation, Characterization And Molecular Identification Of Bacteria
From Commercial Source Using 16s Rrna Sequencing For Domestic
Waste Water Treatment. International Journal of Innovative
Technology and Exploring Engineering (IJITEE). 8(6):1
Tiwari, S., R, S, Tomar., M, K, Tripathi., A, Ahuja. 2017. Protokol
dimodifikasi untuk Isolasi Tanaman Genomic DNA. Res India. J.
Genet. & Biotech. 9(4):2
LAMPIRAN