LAPORAN PRAKTIKUM MATA KULIAH BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

“TEKNIK ISOLASI DNA”

Oleh
Febbyola Anggelina Cesaria Samaili
NIM. 711345319 053

Instruktur
Elne Vieke Rambi, S.Pd., M.Si

TINGKAT 2A
PRODI DIII JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTRIAN KESEHATAN MANADO
TAHUN AKADEMIK 2020/2021
JUDUL : Teknik Isolasi DNA
TUJUAN :
Agar mahasisawa mampu mengetahui dan memahami prisip dan alat bahan serta
prosedur isolasi DNA

PRINSIP
Isolasi DNA diperlukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain
seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Terdapat 3 prinsip utama dalam isolasi DNA
yakni 1) penghancuran (lisis), 2) esktraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta 3). pemurnian DNA.

DASAR TEORI
DNA atau RNA yang akan diamplifikasi dengan metode PCR dapat diisolasi dari
berbagai sumber baik eukaryot maupun prokaryot. Metode isolasi DNA atau RNA dapat
dilakukan dengan berbagai macam cara antara lain seperti yang dijelaskan oleh
Sambrook et.al (1989) dalam Yuwono (2009).
DNA atau RNA yang akan digunakan dalam PCR tidak selalu harus dalam
kemurnian yang tinggi seperti yang akan digunakan untuk kloning. Tetapi dalam
beberapa hal, seringkali DNA atau RNA yang akan diamplifikasi harus dimurnikan
terlebih dahulu.
Isolasi DNA merupakan tahapan pekerjaan awal yang harus dilakukan dalam
berbagai pemeriksaan analisis DNA. Keberhasilan proses isolasi DNA seringkali sangat
menentukan hasil pekerjaan selanjutnya. Proses ekstraksi untuk mendapatkan DNA
berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam analisis
molekuler. Berbagai analisis biologi molekuler memerlukan hasil isolasi DNA dengan
tingkat kemurnian dan kualitas yang baik. DNA hasil isolasi harus terbebas dari berbagai
kontaminan seperti protein dan RNA yang dapat menggangu berlangsungnya proses
PCR. Oleh karena itu, metode isolasi DNA yang tepat sangat diperlukan untuk
mendapatkan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik. DNA atau RNA yang akan
diamplifikasi dengan metode PCR dapat diisolasi dari berbagai sumber baik eukaryot
maupun prokaryot. Metode isolasi DNA atau RNA dapat dilakukan dengan berbagai
 macam cara antara lain seperti yang dijelaskan oleh Sambrook et.al (1989) dalam
Yuwono (2009).
Isolasi DNA diperlukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain
seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Terdapat 3 prinsip utama dalam isolasi DNA
yakni 1). penghancuran (lisis), 2). esktraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta 3). pemurnian DNA.
Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan sampel, pelisisan
membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan
pengawetan DNA. Isolasi DNA juga berfungsi sebagai media pembelajaran genetik,
dapat mengetahui kelainan genetik yang diderita, dapat mengetahui agen penyebab
penyakit infeksi, dan lain-lain. (Yuwono, 2006.; Soedjadi, 2008.; Maftuchah, 2014).
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa
kimia seperti EDTA ( Ethylen diamnine Tetra Acetic), SDS (Sodium Dodecyl Sulphat),
Ammonium-Choride- Potassium (ACK). Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara
sentrifugasi. Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan
dibersihkan dari protein yang masih ada dengan fenol. Dalam proses ini sebagian kecil
RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan kloroform digunakan untuk membersihkan
sisasisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk
menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau
purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl
yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA
pada saat dicampur dengan etanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan
mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar microtube.
Prinsip dasar isolasi DNA di atas diaplikasikan dengan berbagai macam tahapan
ekstraksi dan purifikasi DNA dengan berbagai modifikasi disesuaikan dengan kebutuhan
atau jenis sampel yang diekstraksi. (Unang Supratman, dkk., 2017).

PROSEDUR KERJA DARI VIDEO

Alat dan Bahan :
 Tabung
 Tip
 Gunting
 Pipet
 Label
 Tempat inkubasi tabung (heat block)
 Pena/sharpie
 Sentrifuge
 Daun lebar dari pohon maple
 Salmon
 Serangga (jangkrik)

Persiapan Sampel ( Video 1 ) :

1. Untuk memulai protokol, pertama-tama perlu mendapatkan sampel (daun lebar dari
pohon maple, salmon, serangga),
2. satu tabung yang telah diberi label untuk setiap sampel. Saat memberi label sampel
hanya akan menggunakan Sharpie. Memberikan tanggal sampel diambil dan
memberi label pada bagian samping dan atas tabung
3. mengumpulkan sampel untuk ekstraksi DNA mengambil sebagian kecilnya, lebih
sedikit sebenarnya lebih banyak. Sebenarnya sangat penting untuk mendapatkan
sedikit sampel.
4. Untuk daun apa yang bisa kita gunakan sebenarnya adalah ujung pipet biru; ini tip
P1000, dan saat Anda menggunakan ujungnya, Anda benar-benar mendapatkan
potongan bulat yang bagus,dengan menggunakan penjepit untuk mengambil ini dari
ujung pipet.
5. Sekarang bekerja dengan ikan atau hal lain, seperti serangga. cari sekitar 10 hingga
20 mg, yang merupakan jumlah sampel yang sangat, sangat kecil.

Prosedur pemeriksaan :
a. Video 2 (Mengekstrak DNA)
1) Sekarang setelah memiliki sampel dan file dan label tabung siap dimulai dengan
ekstraksi apa yang akan kita lakukan
2) yang perlu dilakukan adalah menambahkan 100 mikroliter menggunakan pipet
biru saya disetel ke 100 mikroliter
3) tambahkan solusinya setiap kali saya lisis
 4) dapatkan 100 mikroliter tutup itu kembali dan tambahkan 100 mikroliter itu ke
sampel pertama setelah Anda menambahkan solusi untuk sampel, Anda dapat
mengambil bersihkan lalu dan mulailah menggiling sampel dengan selama sekitar
1 menit
5) setelah menggiling sampel secara menyeluruh, larutan berubah warna klorofil
6) tambahkan sisa 500 mikroliter larutan inti pastikan untuk bercampur setelahnya
7) menambahkan pada 500 inti terakhir jadi larutan dan tambahkan ini ke panas blok
setelah sampel diinkubasi selama 15 menit pada suhu 65⁰
8) tambahkan larutan RNA ke larutan RNA. RNA yang ada dalam larutan sehingga
saat kita benar-benar mengendap asam nukleat sebagian besar dari kita akan
mendapatkan kembali adalah DNA yang saya ambil p10 dan saya setel ke 3
mikroliter dan ambil tip baru, ambil 3 mikroliter dari larutan RNA dan tambahkan
itu ke masing-masing tabung setelah menambahkannya ke tabung Anda ingin
membentuk tabung dan kemudian menempatkannya pada 37 derajat jadi jika
Anda memiliki yang lain blok panas tempatkan di yang satu itu jika Anda perlu
membiarkan blok panas ini mendingin dinginkan hingga 37 derajat.

b. Video 3 (Mengendapkan DNA)

1) Sampel telah diinkubasi selama 30 menit. 15 menit pada suhu 65o dan 15 menit
lagi pada suhu 37o dengan larutan RNA
2) Setelah itu keluarkan tabung dari heat block dan akan terlihat beberapa perubahan
warna dalam oksidasi dan pada saat inilah inti dari kloroplas dan mitokondrianya
telah dicoba oleh solusi.
3) Yang akan dilakukan adalah tambahkan larutan pengendapan protein yang akan
diambil protein yang larut dan dipaksa untuk dikeluarkan
4) Tambahkan 200ul mikroliter pada pengendapan protein solulution untuk masing-
masing tabung dan perhatikan sedikit perubahan warna yang terjadi
5) Solutionnya sebenarnya terlihat bersih tapi ketika dibiarkan dan diletakkan di atas
es itu akan menjadi seperti susu. Perhatikan perubahan warnanya karena warna itu
hanya terlihat sekali
6) Setelah ditambahkan 200ul, letakkan tabung diatas es dan biarkan selama 4 menit.
7) Kemudian, ambil sampel dan masukkan ke dalam sentrifuge dan putar selama 4
menit
8) Setelah selesai dipusingkan atau disentrifuse kemudian sampel dikeluarkan. Lalu
akan terlihat bahwa semua selular detritus telah bersarang di samping dinding
9) Keluarkan supernatannya dan yang tersisa yaitu sisa materi
10) Gunakan tabung yang bersih kemudian transfer 600ul supernatan pada tabung
tersebut. Lakukan secara hati-hati, jangan sampai terjadi guncangan pada tabung
11) Langkah selanjutnya yaitu, tambahkan alkohol dalam hal ini isopropanol ke
masing-masing tabung sebanyak 600ul.
 12) Kemudian kocok tabung secara perlahan selama beberapa waktu dan bida terlihat
pengendapan DNA
13) Setelah ditambahkan isopropanol ke semua tabung, ambil dan pusingkan selama
1 menit dengan kecepatan maksimal

c. Video 4 (Mencuci dan mengelusi DNA)

1) setelah Anda selesai berputar, Anda bisa keluarkan dari centrifuge dan harus
melihat pelet yang ada di sisi yang sama dari engsel dan pelet itu sebenarnya
adalah DNA yang dihasilkan
2) solusi yang ingin Anda lakukan sekarang adalah hati-hati menghapus
3) tuangkan isopropanol jadi buka engselnya dan tutup gelas limbah Anda tuangkan
dengan hati-hati singkirkan alkohol itu jika Anda memiliki setetes atau dua tersisa
Anda bisa menggunakan serbet untuk ambil saja tetes terakhir tapi itu penting
bahwa Anda tidak terlalu menggoyangnya banyak saat Anda menghilangkan
etanol atau isopropanol saat kita melakukan ini langkah pengendapan alkohol saat
itulah pelet paling terlihat jadi jika Anda tidak melihatnya atau jika sudah sangat
jelas sebelumnya ketika Anda tidak memilikinya alkohol mudah untuk melihat
titik ini pergi
4) ambil tabung Anda dan tambahkan 600 mikroliter etanol tersebut etanol hanya
membersihkan kelebihan kotoran setelah Anda melakukan ini untuk semua tabung
Anda, Anda dapat mengocoknya sedikit lalu putar ke bawah 1 menit untuk
kecepatan maksimum setelah Anda menambahkan
5) etanol ke semua tabung Anda saat Anda memutar mereka ke bawah langkah
selanjutnya adalah mengambil sampel Anda dan tuangkan kembali dengan hati-
hati hilangkan etanol berlebih dan sekali lagi Anda bisa gunakan serbet untuk
membuang apa pun yang tersisa hanya mengetuknya dengan lembut Anda ingin
memastikan bahwa pelet tersebut yang ada di langkah terakhir masih erhadap sisi
tabung dan biarkan tabung duduk terbuka di rak sekitar 10 sampai 20 menit untuk
mengangin-anginkannya
6) tambahkan solusi rehidrasi DNA yang Anda butuhkan tambahkan 100 mikroliter
jadi saya akan menggunakan tip baru untuk menambahkan 100 mikroliter
7) Tabung CAPA dan Anda dapat menggunakan jari Anda untuk pusaran sedikit dan
kocok dan kemudian letakkan di atas kompor hitam atau penangas air untuk 65
derajat sekitar 45 hingga 60 menit jika Anda akan menggunakan DNA segera
Anda dapat menyimpannya di atas es sampai Anda pergi ke langkah PCR jika
Anda tidak akan menggunakan DNA dengan segera maka Anda dapat
meletakkannya di -20 untuk benar-benar digunakan.
PROSEDUR KERJA DARI PPT
a. Isolasi DNA dari Spesimen Darah (manusia)
 Peralatan untuk Isolasi DNA : Centrifuge, Tabung centrifuge, Vortex Mikropipet
+ tip dan pipet transfer, Blood tube, Lanset, Inkubator atau waterbath, Sarung
tangan dan masker
 Reagen untuk isolasi DNA dari spesimen darah : larutan pelisis eritrosit, larutan
pelisis leukosit, RNAse, larutan presipitasi protein, isopropanol, etanol 70%, dan
tris-EDTA (TE).
 Prosedur :
1) Ambil darah sebanyak 300 µL dengan menggunakan mikropipet dari ujung
jari steril yang telah ditusuk dengan lanset. Lalu masukkan darah ke dalam
tube dan diberi larutan pelisis eritrosit.  Biologi Sel dan Molekuler 147
2) Tabung diinkubasi selama kurang lebih 10 menit, kemudian disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 2.500 rpm. Setelah itu supernatan
kemudian dibuang.
3) Tambahkan lagi 4,5 mL larutan pelisis eritrosit lalu gunakan vortex untuk
homogenisasi. Lalu sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2.500
rpm. Setelah itu supernatan kembali dibuang.
4) Pelet yang didapat kemudian ditambahkan 1 mL larutan pelisis leukosit lalu
tambahkan 1,5 µL RNase, lalu homogenisasi campuran tersebut dengan cara
membolak-balikkan tabung.
5) Kemudian tabung diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C.
6) Tambahkan 500 µL larutan presipitasi protein dan gunakan vortex untuk
homogenisasi.
7) Selanjutnya tabung di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 3.000
rpm.
8) Supernatan selanjutnya dibuang dan pelet ditambahkan 4 mL etanol 70%
dingin dan dibolak-balikkan.
9) Selanjutnya tabung disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 3.000
rpm.
10) Kemudian tabung dibolak-balikkan dan DNA dikeringkan selama 15 menit.
 11) Tambahkan tris-EDTA 0,5 mL, selanjutnya sampel DNA siap digunakan dan
disimpan pada suhu 4°C.
12) Setelah proses isolasi selesai, kemudian dilanjutkan dengan analisis isolat
DNA. Analisis DNA dapat dilakukan secara kualitatif maupun kuantitatif.

b. Isolasi DNA Spesimen Jaringan Tubuh Manusia

 Peralatan untuk Isolasi DNA : Centrifuge, Tabung centrifuge, Vortex Mikropipet
+ tip dan pipet transfer, Blood tube, Lanset, Inkubator atau waterbath, Sarung
tangan dan masker
 Reagen yang diperlukan : Oktana atau xilena; Etanol 100%; Aseton; Proteinase K
(20 mg/mL); Bufer pencerna (50 mM Tris HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5%
Tween 20 atau 1% Laureth 12).
 Prosedur :
1) Tambahkan 1 mL oktana ke dalam tabung yang berisi irisan jaringan. Tutup
tabungnya kemudian campurkan pada suhu kamar selama 30 menit.
2) Lakukan sentrifugasi menggunakan mikrosentrifuga pada kecepatan penuh
(13.000- 16,000) selama 5 menit sehingga jaringan dan sisa-sisa parafin akan
mengendap.  Biologi Sel dan Molekuler 149
3) Buanglah cairan oktana tersebut dengan menggunakan pipet Pasteur. Lakukan
langkah ini dengan hati-hati, karena seringkali jaringan yang sudah tua atau
rapuh akan terfragmentasi pada waktu parafinnya dihilangkan.
4) Ulangi langkah 1, 2 dan 3.
5) Tambahkan 0,5 mL etanol 100% ke dalam tabung. Tutup tabungnya dan
campurkan dengan cara membalikkan tabung.
6) Lakukan sentrifugasi seperti langkah 2.
7) Hilangkan etanol seperti langkah 3.
8) Ulangi langkah 5,6 dan 7. Hilangkan sebanyak mungkin etanol yang tersisa
dengan menggunakan pipet Pasteur.
9) Keringkan sampel dalam keadaan vakum sampai seluruh etanol menguap.
Penghilangan etanol dapat juga dilakuakn dengan cara menambahkan 2-3
 tetes aseton ke dalam tabung. Buka tabungnya dan letakkan di dalam
waterbath bersuhu 37oC - 50oC sehingga asetonnya menguap.
10) Tambahkan 100µL buffer pencerna yang mengandung 200µg/ mL proteinase
K ke dalam sampel jaringan yang telah diekstraksi. Jika jaringan yang
digunakan cukup banya , gunakan 200 µL buffer pencerna.
11) Inkubasikan selama 3 jam pada suhu 55oC atau pada suhu 37oC selama
semalam.
12) Lakukan sentrifugasi singkat untuk menghilangkan cairan yang ada pada tutup
tabung.
13) Inkubasikan pada suhu 95oC selama 8-10 menit untuk menonaktifkan
proteasenya. Jangan memanaskan sampel lebih dari 10 menit.
14) Lakukan sentrifugasi selama 30 detik untuk mengendapkan sisa-sisa parafin
atau jaringan. Gunakan supernatannnya untuk melakukan amplifikasi dengan
PCR (1-10 µL). Sampel yang tersisa dapat disimpan pada suhu -20oC.

c. Isolasi DNA dari kultur bakteri

1) Isolasi DNA genom (kromosom) bakteri
 Metode boiling
 Alat dan bahan: Biosafety Cabinet; Mikropipet 10, 200 dan 1000 uL;
Mikrotube 200 dan 1500 uL; Mikrosentrifuse; Waterbath/ Thermal Cycler;
Freezer -800C; PCR buffer/T E Buffer; Proteinase K; Sampel (koloni/
suspensi Bakteri).
 Prosedur :
- Tumbuhkan bakteri dalam media LB cair (Lactose Broth) dalam waktu
12-24 jam suhu 370C.
- Ambil sebanyak 250 uL dan masukkan ke dalam 0.5/1,5 mL tabung
Eppendorf.
- Sentrifuse 3000 rpm selama 5 menit, buang supernatan. d. Tambahkan 50
μL 1x PCR-buffer/ TE Buffer
- Tambahkan 1 μL Proteinase K (10 mg/mL).
- Bekukan minimal 1 jam pada -80°C agar jaringan sel rusak.
 - Panaskan selama 1 jam pada 60°C dan didihkan selama 15 menit pada
95°C (dalam mesin PCR).
- Simpan suspensi DNA yang terbentuk pada -20°C atau dapat digunakan
langsung untuk PCR
 Metode reagen kit
 Peralatan yang digunakan antara lain: tabung sentrifugasi, mikropipet,
mikrotip, frezeer, vortex, mesin sentrifugasi, GD column, collectiontube, dan
inkubator.
 Bahan yang diperlukan antara lain kultur murni bakteri, ddH2O, proteinase K,
buffer TE, dan bahan dari Presto™ MinigDNA Bacteria Kit.
 Prosedur :
- Tahap persiapan sampel bakteri gram negatif, sekitar 1 x 109 sel bakteri
dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuge ukuran 1,5 mL.
- Lakukan sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 14.000-16.000 x g.
Supernatan hasil sentrifugasi dibuang.
- Tambahkan GT Buffer sebanyak 180 μL dan pelet dilarutkan kembali
dengan menggunakan vortex atau pipet.
- Tambahkan Proteinase K sebanyak 20 μL (pastikan ddH2O telah
ditambahkan sebelumnya).
- Inkubasi pada suhu 60°C minimal selama 10 menit. Selama inkubasi,
tabung dibalik setiap 3 menit.  Biologi Sel dan Molekuler 151
- Pada tahapan lisis, tambahkan 200 μL GB Buffer ke dalam sampel dan
dicampur hingga merata dengan cara divortex selama 10 detik.
- Inkubasi pada suhu 70°C minimal selama 10 menit. Selama inkubasi,
tabung dibalik setiap 3 menit.
- Selanjutnya pada tahap pengikatan DNA, tambahkan 200 μL etanol
absolut pada lisat sampel dan dengan segera dicampur dengan cara
dikocok. Jika terjadi pengendapan, pisahkan sebisa mungkin dengan
menggunakan pipet.
 - GD Column diletakkan pada Collection tube2 mL. Campuran (termasuk
endapan) dipindahkan ke dalam GD Column selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 14.000-16.000 x g selama 2 menit.
- Collection tube ukuran 2 mL yang berisi materi sisa dipisahkan
selanjutnya GD Column diletakkan pada Collection tube ukuran 2 mL
yang baru.
- Pada tahap pencucian, tambahkan 400 μL of W1 Bufer pada GD Column.
Disentrifugasi dengan kecepatan 14-16.000 x g selama 30 detik
selanjutnya materi pada collection tube dipisahkan.
- GD Column diletakkan kembali pada collection tube 2 mL. Ditambahkan
600 μL Wash Buffer (pastikan etanol telah ditambahkan) pada GD
Column. Disentrifugasi pada kecepatan 14.000-16.000 x g selama 30 detik
selanjutnya materi pada collection tube dipisahkan.
- GD Column diletakkan kembali pada collection tube 2 mL. Disentrifugasi
kembali selama 3 menit pada kecepatan 14.000-16.000 x g untuk
mengeringkan kolom matrik dan selanjutnya dilakukan elusi DNA.
- GD Column kering dipindahkan pada tabung mikrosentrifuge 1,5 mL
bersih. Ditambahkan pre-heated Elution Buffer ke dalam tengah kolom
matrik. Didiamkan sedikitnya 3 menit agar Elution Buffer terserap
sempurna. Disentrifugasi dengan kecepatan 14.000-16.000 x g selama 30
detik untuk menghasilkan DNA yang murni.
- Setelah proses isolasi selesai, kemudian dilanjutkan dengan analisis isolat
DNA. Analisis DNA dapat dilakukan secara kualitatif maupun kuantitatif.

2) Isolasi DNA plasmid bakteri (preparasi mini plasmid DNA Bakteri)

 Peralatan yang digunakan antara lain: tabung sentrifugasi, mikropipet,
mikrotip, frezeer, vortex, mesin sentrifugasi, GD column, collectiontube, dan
inkubator
 Bahan yang digunakan: Koloni bakteri dan Media Luria Berthani (LB) :
Larutan I: 50 mM glukosa; 25 mM Tris-HCl (pH 8,0); dan larutan 1 mM
EDTA (pH 8,0). Larutan II: 5M NaOH dan 10% Sodium Dodecyl Sulphat
 (SDS). Larutan III: 5 mL kalium asetat dan asam asetat glasial. Lain-lain:
Fenol, Etanol absolut, etanol 70% dan buffer TE pH 7,6.
 Prosedur :
- Ambil stok bakteri yang berisi plasmid dari satu koloni yang diinginkan,
masukkan ke dalam tabung sentrifuga berisi medium LB cair (broth).
- Tumbuhkan (inokulasi) pada shaker inkubator bersuhu 37oC, goyang
dengan kuat selama 12-16 jam.  Biologi Sel dan Molekuler 153
- Sentrifugasi tabung yang berisi inokulum dengan kecepatan 10.000 rpm
pada suhu 4 oC selama 5 menit.
- Buang supernatan, tambahkan pelet sel bakteri dengan 100 µL larutan
pertama, vortex keras selama 5 menit sampai terlarut.
- Tambahkan 200 µL larutan kedua (larutan ini harus dibuat segar
menjelang akan digunakan). Bolak balik keras 2-4 kali, kemudian inkubasi
pada suhu ruang selama 5 menit.
- Tambahkan 150 µL larutan ketiga, vortex 2-3 menit, kemudian inkubasi
dalam es selama 3-5 menit.
- Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit.
- Pindahkan supernatant ke tabung baru, tambahkan 1x volume phenol-
saturated buffer TE, kemudian vortex kuat selama 5 menit.
- Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu ruang selama 5
menit.
- Pindahkan supernatan bagian atas yang bening ke tabung baru, tambahkan
2x volume etanol absolut, kocok dengan tangan dan biarkan beberapa
menit.
- Sentrifugasi dengan kecepatan dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu
4oC selama 5 menit.
- Tambahkan pelet yang diperoleh dengan 500µL etanol 70%, kemudian
vortex selama 2 menit.
- Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit.
- Ulangi langkah no. 12 dan 13 sekali lagi.
 - Kering anginkan pelet akhir. Kemudian tambahkan 50 µL buffer TE (pH
7,6). Setelah larut, simpan di freezer pada suhu-20oC.

d. Isolasi DNA dari Kultur Jaringan (Biakan Virus)

1) Lakukan sentrifugasi terhadap 5 mL sel-sel kultur jaringan (atau darah) dengan
kecepatan 500 g selama 5 menit.
2) Pindahkan supernatan ke dalam tabung yang baru, kemudian lakukan sentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit untuk menghilangkan partikel-
partikel yang besar.
3) Pindahkan supernatan ke dalam tabung sentrifuge, kemudian lakukan sentrifugasi
dengan kecepatan 50.000 g selama 45 menit untuk mengendapkan partikel virus.
Untuk menyeimbangkan tabung selama sentrifugasi, gunakan larutan PBS.
4) Buang supernatan, kemudian larutkan pelet virus di dalam 100-500 µL buffer K
atau larutan TE yang mengandung 1% detergen NP-40 dan 100 µg/mL Proteinase
K.
5) Pindahkan pelet virus yang telah dilarutkan dalam tabung mikrosentrifuge dan
inkubasikan pada suhu 55oC selama 30-60 menit. Setelah itu, pindahkan ke 
Biologi Sel dan Molekuler 154 waterbath yang bersuhu 95oC selama 10 menit
untuk menonaktifkan enzim protease.
6) Dinginkan sampel kemudian lakukan sentrifugasi untuk menghilangkan sisa-sisa
partikel virus.
7) Untuk melakukan amplifikasi (PCR) DNA virus, digunakan sampel sebanyak 5
sampai 10 µL di dalam 100 µL volume total PCR. (Yuwono, 2006).

PASCA ANALITIK
Tujuan utama isolasi asam nukleat adalah untuk memisahkan DNA atau RNA dari bahan
lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Dengan memperoleh DNA atau RNA yang murni,
maka akan diperoleh bahan DNA dan atau RNA untuk digunakan dan dimanfaatkan sebagai
sampel untuk pemeriksaan analisis molekuler tahap selanjutnya sesuai tujuan tertentu, misalnya
untuk dilanjutkan proses amplifikasi untuk mengidentifikasi atau mendeteksi ada tidaknya gen
pada suatu penyakit infeksi tertentu atau gen resisten terhadap suatu antibiotik tertentu (MDR)
dan lain-lain.
Terdapat 3prinsip utama dalam isolasi DNA yakni penghancuran (lisis), esktraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Secara
umum, tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan sampel, pelisisan membran dan/ atau
dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan pengawetan DNA.
Spesimen untuk isolasi DNA dapat berasal dari darah, jaringan dalam, semen, saliva, akar
rambut, urin, gigi, kultur sel hewan, bakteri, jaringan tumbuhan dan fungi.Kualitas hasil isolasi
DNA tergantung pada kualitas spesimen yang digunakan.Hasil isolasi DNA yang baik diperoleh
dengan memurnikan DNA genomik dari sel atau jaringan yang segar. Jika spesimen tidak dapat
segera diproses, perlu dilakukan penyimpanan dengan kondisi khusus untuk menjaga integritas
DNA.
Peralatan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah mesin sentrifugasi, tabung
sentrifugasi, vortex, mikropipet, tip, pipet transfer, inkubator atau waterbath, sarung tangan dan
masker. Adapun reagen yang diperlukan berbeda-beda tergantung pada jenis spesimen yang akan
diperiksa maupun kit yang digunakan. Namun secara umum, reagen yang digunakan terdiri dari:
buffer lisis yang berfungsi untuk merusakintegritas barrier dinding sel; ethanol dingin untuk
presipitasi DNA; fenol, fenol:kloroform, isopropanol, Fenol: kloroform:isoamilalkohol untuk
pemurnian DNA dari ekstrak sel; Proteinase-Kuntuk pemurnian DNA dari kontaminan protein;
RNase untuk pemurnian DNA darikontaminan RNA; Cesium Chlorida (CsCl) atau garam
dengan konsentrasi tinggi, seperti 0,25 M sodium acetate atau 0,1 M sodium chloride digunakan
untuk pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein; ethanol 70% untuk pencucian DNA; dan
buffer TE atau ddH2O steril untuk melarutkan DNA. Preparasi sampel yang dilakukan pun
berbeda-beda tergantung pada jenis spesimen yang akan diperiksa.

DAFTAR PUSTAKA
Nurhayati B, Darmawati S.2017.Bahan Ajar TLM : BIOLOGI SEL DAN
MOLEKULER.PPSDMK
STEP 1 : https://www.youtube.com/watch?v=xlrwef2Y3f0

STEP 2 : https://www.youtube.com/watch?v=iYaxOwZLIAk
STEP 3 : https://www.youtube.com/watch?v=y7kny3Xy4k4

STEP 4 : https://www.youtube.com/watch?v=buzWMKIHbBI