METODE ANALISIS ASAM NUKLEAT

Muhammad Raihan Pratama (1806148555)

Abstrak – Asam nukleat adalah salah satu makromolekul yang dimiliki oleh sel hidup. Asam nukleat
berfungsi sebagai tempat penyimpan sifat individu yang diwariskan, penyimpanan energi, dan
koenzim. Asam nukleat adalah salah satu makromolekul yang dimiliki oleh sel hidup. Asam nukleat
berfungsi sebagai tempat penyimpan sifat individu yang diwariskan, penyimpanan energi, dan
koenzim. Analisis kualititatif asam nukleat dilakukan untuk mengetahui susunan genetik dari suatu
DNA atau RNA. Analisis kualitatif pengujian asam nukleat dapat dibagi menjadi beberapa metode
analisis, yaitu elektroforesis, DNA sequencing, staining, hibridasi, dan blotting. Analisis kuantitatif
pada asam nukleat merupakan suatu analisis yang didasarkan pada perolehan data yang bersifat
statistik dan angka (lebih bersifat numeris). Analisis kuantitatif pengujian asam nukleat dapat dibagi
menjadi beberapa metode analisis, yaitu spektrofotometri UV-Vis, Q-PCR, dan SAGE (Serial Analysis
of Gene Expression).
Keyword: asam nukleat, elektroforesis, DNA sequencing, staining, hibridasi, blotting, spektrofotometri
UV-Vis, q-PCR, SAGE

I. PENDAHULUAN
Asam nukleat adalah salah satu makromolekul yang dimiliki oleh sel hidup. Asam
nukleat berfungsi sebagai tempat penyimpan sifat individu yang diwariskan, penyimpanan
energi, dan koenzim. Asam nukelat merupakan biopolimer yang tersusun atas nukleotida.
Setiap nukleotida terdiri dari tiga komponen yaitu basa nitrogen (purin atau pirimidin),
pentosa, dan gugus fosfat.
Berdasarkan jenis nukleotidanya, asam nukleat dapat dibedakan menjadi dua
macam, yaitu asam ribonukleat (RNA) dan asam deoksiribonukleat (DNA). RNA adalah
makromolekul polinukleotida yang berbentuk untai tunggal dan berperan dalam sintesis
protein. Sedangkan DNA adalah makromolekul asam nukleat yang berbentuk heliks ganda
berpilin dan berfungsi sebagai substansi pembawa informasi genetik. Analisis asam
nukleat dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif.

II. ANALISIS KUALITATIF

Analisis kualititatif asam nukleat dilakukan untuk mengetahui susunan genetik dari suatu
DNA atau RNA. Dalam analisasi kualitatif ini, hal yang diuji meliputi bagaimana
karakteristik yang dihasilkan dari sampel uji (DNA maupun RNA). Analisis kualitatif
pengujian asam nukleat dapat dibagi menjadi beberapa metode analisis, yaitu
elektroforesis, DNA sequencing, staining, hibridasi, dan blotting.

A. Elektroforesis
Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi
makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan
asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul
penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik
sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan
asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub
positif dari gel elektroforesis. Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan
molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan
kecepatan migrasi melewati gel elektroforesis. Secara prinsip, elektroforesis
merupakan tahap memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan
sifatnya.
 Terdapat beberapa jenis elektroforesis yang telah dapat digunakan untuk
menganalisis makromolekul termasuk asam nukleat. Beberapa diantaranya adalah
elektroforesis gel agarosa, elektroforesis kapiler, elektroforesis gel poliakrilamida,
elektroforesis gel 2D, dan elektroforesis isoenzim. Metode elektroforesis gel agarosa

merupakan metode yang paling umum (konvensional) yang dapat digunakan untuk
menganalisis asam nukleat.
Gambar 1. Elektroforesis gel
Sumber: Fundamentals of Biochemistry, 2nd ed.

B. DNA Sequencing
Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA (adenine, guanine sitosin, dan
timun) dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek. Pengurutan (sequencing)
asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA. Metode
ini didasarkan pada pembelahan DNA pada lokasi tertentu dengan menggunakan zat
kimia pada enzim.
Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA.
Metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan
fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda
sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik
kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang diperiksa.

1. Metode Sanger
Metode Sanger memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA
polimerase yang disebut fragmen Klenow. Kedua sifat tersebut adalah
kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan
ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul
dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa,
molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH
pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester.
Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen Klenow dengan suatu molekul
DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang
terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa
oleh molekul ddNTP.
Sekuensi DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi
yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat
berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP
sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu
sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan
 dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’-nya
selalu berakhir dengan basa yang sama.

Gambar 2. Prinsip Kerja Metode Sanger

Sumber: researchgate.net

2. Metode Maxam-Gilbert
Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang
dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini
fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu
ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada
ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda
maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang
dilakukan dalam dua tahap.
Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan
piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan
fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa
dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan
memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis
C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya
bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen,
masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.
 Gambar 3. Prinsip Kerja Metode Maxam-Gilbert
Sumber: researchgate.net

C. Staining
Staining digunakan untuk menunjukkan keberadaan DNA dan RNA terutama setelah
mengalami proses pemisahan (elektroforesis gel). Metode staining ini menggunakan
tambahan pewarna ke dalam sampel yang ingin diamati untuk mendeteksi keberadaan
DNA atau RNA sehingga mempermudah pengamatan visualisasi dibawah mikroskop.
Metode ini dilakukan dengan in vivo (pewarnaan jaringan hidup) dan in vitro
(pewarnaan pada sel atau struktur yang sudah diisolasi dari komponen biologinya).
Staining bertujuan untuk Mengetahui apakah sampel termasuk sel hidup atau tidak
dengan mendeteksi keberadaan DNA dan mengetahui apakah sampel berada dalam
siklus proses sintesis protein dengan mendeteksi keberadaan RNA. Terdapat banyak
jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini, beberapa diantaranya adalah
etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, dan Eva Green.

1. Etidium Bromida
Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk
memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan
penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini
menempel pada rantai DNA dan bersifat fluoresens dia bawah cahaya UV. Namun
etidium bromida bersifat karsinogen, karena itu penggunaannya harus ditangani
dengan baik.

2. SYBR Gold
Pewarna SYBR Gold digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau RNA.
SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai
lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR
Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat
berikatan dengan asam nukleat. Pewarna ini dapat juga digunakan pada gel
formaldehida.

3. SYBR Green
Pewarna SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial
sebagai mutagen, karena itu pewarna ini harus ditangani dengan hati-hati. SYBR
Green I lebih cocok untuk digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR
Green II lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA.

4. SYBR Safe
SYBR Safe merupakan pewarna yang dirancang agar menjadi pewarna yang lebih
aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ni
tidak bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem
pembuangan limbah. Pewarna SYBR Safe dapat digunakan dengan blue-light
transillluminator yang mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang
diamati dan lebih efisien untuk proses kloning selanjutnya.

5. Eva Green
Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR
(Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk
gel yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil
di dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan
 dengan DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki tingkat toksisitas yang
rendah.

D. Hibridasi
Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan
dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan
kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara
pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan
basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan
proses renaturasi dengan cara pendinginan.
Untuk pengujian dengan hibridisasi diperlukan suatu probe asam nukleat yang
komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan
solid pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga
dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis
(target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas
bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan
solid.
Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarosa
ke nilon berpori atau membran nitroselulosa. Pada metode ini mula-mula gel
didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di
atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membran nitroselulosa,
kemudian di atasnya diberi pemberat. Semua fragmen hasil pemotongan dengan
enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke
membran tersebut dalam bentuk untai tunggal.

E. Blotting
Blotting adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA
atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut
mengalami imobilisasi. RNA Blotting dan DNA Blotting umumnya disebut dengan istilah
Northern Blotting dan Southern Blotting.

1. Northern Blotting
Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA sequence)
tertentu diantara kumpulan molekul RNA. Pada dasarnya metode ini adalah
kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Dalam proses ini
RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang
kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat
digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun
hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi
dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam
sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan
dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak
RNA hadir dalam sampel yang berbeda.
Langkah pertama dari metode ini adalah denaturasi atau pemisahan RNA di
dalam sampel menjadi rantai tunggal. Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak
dalam posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul. Selanjutnya
molekul RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode gel elektroforesis.
Setelah pemisahan, RNA ditransfer dari gel ke blot membran. Setelah itu membran
dilalui proses probe, DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan
harus memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. Dengan begitu, probe
dapat terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran. Setelah hibridisasi,
probe mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul
RNA lainnya pada membran.
 Gambar 4. Metode Northern Blotting
Sumber: mybiosource.com

2. Southern Blotting
Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA tertentu
dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi
dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan
blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian dikenakan probe DNA
berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA sampel.
Metode ini digunakan untuk memindahkan protein DNA ke suatu pengangkut
sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel
elektroforesis. Southern blot berkombinasi dengan elektroforesis gel agarosa untuk
separasi ukuran DNA.
Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi
dan studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk
memodifikasi pada organisme. Blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi
bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan dan
untuk mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang mengalami perubahan.
Gambar 5. Metode Southern Blotting

Sumber: genome.gov

III. ANALISIS KUANTITATIF

Analisis kuantitatif pada asam nukleat merupakan suatu analisis yang didasarkan pada
perolehan data yang bersifat statistik dan angka (lebih bersifat numeris). Analisis ini dapat
berupa data jumlah DNA atau yang berhubungan dengan angka dan juga numeri. Analisis
kuantitatif pengujian asam nukleat dapat dibagi menjadi beberapa metode analisis, yaitu
spektrofotometri UV-Vis, Q-PCR, dan SAGE (Serial Analysis of Gene Expression).

A. Spektrofotometri UV Vis
 Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak
dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini
terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sampel tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagen tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun
tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan
filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus
jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Alat ini
menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber
cahaya tampak. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya
satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi
dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia
dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik
untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. DNA yang mengandung
basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV.
Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri UV-Vis
antara lain mikropipet, kuvet, nanodrop spektrofotometer dan seperangkat komputer.
Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan akuades sebagai blanko. Cara kerja
pengujian kuantitatif DNA diawali dengan menghidukan alat nanodrop
spektrofotometer. Kemudian melakukan uji blanko menggunakan aquadest. Setelah itu
dilanjutkan dengan menguji isolat DNA dengan cara meneteskannya pada tempat
sampel sebanyak 1 mikroliter. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan baca hasil
kemurnian DNA-nya.

B. q-PCR
q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) merupakan salah satu teknik
analisis kuantitatif asam nukleat dengan memanfaatkan metode PCR. Metode q-PCR
sering juga dikenal dengan Real-Time PCR. Prinsip kerja dari metode q-PCR mirip
dengan metode PCR. Yang membedakan kedua metode ini adalah pada metode q-
PCR, detektor langsung diberikan dalam analisis. Detektor dapat berupa pewarna
fluorosen. Detektor bekerja dengan mengeluarkan cahaya fluoresen (warna hijau) yang
nantinya akan dianalisis untuk menghitung konsentrasi asam nukleat dalam sampel.
Cahaya fluorosen yang dilepaskan akan ditangkap oleh sistem komputasi dalam
instrument q-PCR.

C. SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

SAGE merupakan salah satu metode analisis yang bersifat kuantitatif untuk
mengekspresikan kode genetik dari mRNA secara digital. Dalam metode ini, ditujukan
untuk mengamati bagaimana gen dari sebuah sel atau jaringan diekspresikan dalam
bentuk kode-kode genetik. Kode-kode genetik yang tercatat kemudian akan disimpan
dalam bentuk database secara digital untuk dapat dianalisis
Prinsip dasar dari metode SAGE adalah sequencing di mana beberapa mRNA
dari sampel uji akan diubah menjadi sebuah rantai DNA. Dalam analisisnya, ekspresi
dari gen akan diuji satu dengan yang lainnya (misalkan ekspresi DNA dari sel yang
normal dengan sel tumor). Metode SAGE diawali dengan cara mengekstrak mRNA dari
sampel. Kemudian, mRNA yang sudah terekstraksi akan dipotong-potong menjadi
potongan kecil secara acak menggunakan enzim restriksi contohnya NIaIII. Potongan-
potongan pendek tersebut dirangkai menjadi satu rantai panjang yang mengandung
basa nukleat yang sudah diberi tanda. Rantai panjang yang dihasilkan kemudian
diubah menjadi bentuk vektor agar dapat dibaca oleh komputer. Melakukan sequencing
 dan memproses datanya dengan komputer. Data yang dihasilkan akan berisikan rantai-
rantai DNA yang mempunyai variasi yang beragam.
Dalam metode SAGE, analisisnya dapat dilakukan terhadap gen yang tidak
diketahui sebelumnya, tidak seperti dengan metode PCR maupun microarray di mana
analisis harus dilakukan dengan DNA yang diketahui sebelumnya. Gen-gen baru yang
dianalisis kemudian dapat diberi tanda sesuai dengan basa nukleotida. Akan tetapi,
metode SAGE tidak dapat mengukur level ekspresi gen secara actual.

IV. Summary
Asam nukleat adalah salah satu makromolekul yang dimiliki oleh sel hidup. Asam nukleat
berfungsi sebagai tempat penyimpan sifat individu yang diwariskan, penyimpanan energi,
dan koenzim. Analisis asam nukleat dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif.
Analisis kualitatif menjadi beberapa metode analisis, yaitu elektroforesis, DNA sequencing,
staining, hibridasi, dan blotting. Analisis kuantitatif dapat dibagi menjadi beberapa metode
analisis, yaitu spektrofotometri UV-Vis, Q-PCR, dan SAGE (Serial Analysis of Gene
Expression).

V. Referensi

Nelson, D., Cox, M., and Lehninger, A. 2017. Lehninger, Principles of Biochemistry.
Basingstoke: Macmillan Higher Education.

Munshi, A. 2012. “DNA Sequencing‒‒Methods and Application”. [Online] Available

at: http://library.umac.mo/ebooks/b28050393.pdf. [Accessed 16 September 2019]

National Human Genome Research Institute. 2015. “DNA Sequencing Fact Sheet”. [Online]
Available at: https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-
Fact-Sheet. [Accessed 16 September 2019]

Voet, D., Voet, G. J., and Pratt, W. C. 2005. Fundamentals of Biochemistry, 2nd edition.
Springer: London.